醇溶蛋白

2.2.2.3醇溶蛋白分析（酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳即A-PAGE）

使用ISTA于1986年颁布的APAGE（Ph3.2）标准程序(Driper,1987).APAGE的分析方法如下:

a. 溶液的配制:

样品提取Buffer(100ml):甲基绿0.05g,2-氯乙醇25ml。

10×电极Buffer(1L):冰醋酸40ml,甘氨酸4g,使用前稀释10倍。

凝胶Buffer(1L):冰醋酸20ml, 甘氨酸1g。

凝胶溶液(200ml):Acr=20g,Bis=0.8g,尿素12g,抗坏血酸0.2g,硫酸亚铁

0.008g,溶于凝胶Buffer中。

b. 样品醇溶蛋白提取:取15-20粒种子去掉内外稃,称重,用样品钳夹碎,放入0.5ml离心管中,然后按1mg加5ul的比例加入样品提取液,室温浸提过夜,使用前用10000rpm离心10min。

c. 凝胶制备:取适量的凝胶溶液,加入适量的10%过硫酸胺(Aps)和TEMED,迅速摇匀,灌胶,插好样品梳,让其在5-10分钟内完全聚合.一般为每ml凝胶溶液加入1ul的10%过硫酸胺(Aps)和TEMED。

d. 加样:小心拔出样品梳,用电极缓冲液冲洗加样孔,每个样品的上样量为

6-10ul。

e. 电泳:恒压500V,恒温4℃,电泳时间为甲基绿前沿指示剂迁移至底板所需时间的三倍。

f. 固定染色:每块胶板吸取1%考马斯亮蓝溶液5ml再加入10%三氯乙酸200ml,染色过夜(染色液可重复使用) 。

g. 保存:在7%冰醋酸中保存,或拍照,制干胶保存。

h. 数据处理:每个样品的电泳条带按有或无记录,电泳带存在时赋值为1,否则赋值为0。按Nei的方法计算材料间相似系数(GS):

GS=2N ij/(N i+N j)

—i品种出现的谱带数;

其中:N

i

—j品种出现的谱带数;

N

j

—i品种和j品种共有的谱带数.

N

ij