实验室环境污染的预防

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实验室环境污染的预防
1实验室的设计分区和布局1.1样品准备区该区域无压力设置要求。该区域是用于对样品进行分样,将样品进行研磨、粉碎、匀浆的区域。由于在这些粉碎、研磨和匀浆处理过程中会产生气溶胶,因此,存在阳性样品污染后续操作的可能性。该区域与后面的区域应严格隔离,应放在与后面的三个区域隔开的独立的房间中。在样品准备区内还可设立一个专用的封闭区或房间用于样品的接收和储存。这个房间可以放置冰箱用于样品储存,应该和样品准备区其它区域隔离开。样品准备区域的人员不得进入试剂准备区。1.2核酸提取区核酸提取区是进行样品核酸提取的区域。该区域为负压,目的是防止核酸溢出造成污染。样品准备区又包括从样品中进行核酸提取和纯化的区域以及将核酸加到包含PCR主反应混合液管中的操作区域。添加完样品后,PCR管的盖子要尽可能快地盖好。使用PCR板和胶盖时,阳性对照和含目标序列的样品要与待测样本分开操作,以避免模板添加时造成交叉污染。重要提示:这个房间里的一切物品不得带入试剂准备区。1.3扩增和产品检测区该区域是用来进行PCR扩增和PCR分析的。PCR仪放置在这个区域。房间保持负压,目的是防止核酸溢出。在该区域人员一定要一直穿戴工作服和手套,在离开房间前脱去,防止扩增子污染其它地点。所有用于扩增和产品检测的设备要指定用于这个房间。PCR分析工作也设置在该区域,例如:酶切、测序、克隆等,但实验室应尽可能把这些活动隔在不同区域或不同房间,以降低扩增产物的污染风险。如果没有条件在该区域设立负压,此区域必须建立排风装置。重要提示:这个房间的物品不能带入样品准备区或试剂准备区。2设备与耗材配置设备、耗材和实验工作服都应分区存放。各区域应该分别配备可调节移液器和带滤芯的吸头。如条件允许可用颜色标识不同区域的物品架、吸量管、实验工作服以方便监控不同区域间的物品变动。此外,由于尘埃会在试验中产生抑制作用,不论在哪个工作区域,都应全程使用防尘手套。各区域配置如下: 2.1试剂准备区一台用于存放试剂的冰柜(-80℃和-20℃)和冷藏柜(-4℃),专用的涡流混匀器、小型离心机、专用的可调移液管、带滤芯的吸头、实验服和一次性手套。需要总是穿戴干净的手套和实验服以控制污染。操作人员在核酸提取或扩增\检测区工作之前需要先在试剂准备区工作,不能在这些区域操作之后再回到试剂准备区。2.2样品准备区最好在该区域内安装强力吸尘系统,至少应放置一台手提式吸尘器,目的是将研磨、匀浆过程中的气溶胶马上吸走。一台用于存放样品的冰柜(-80℃和-20℃)和冷藏柜(由实验室接受的样品所确定),各种粉碎机、匀浆器皿等。2.3核酸提取区一台用于存放样品的冰柜(-80℃和-20℃)和冷藏柜(由实验室接收的样品所确定),一个提取样品所使用的生物安全柜(如果没有条件在独立房间中设立该区域并且无法实现负压设置或在实验室提取处理传染性样品时),一台离心机(如用来进行样品提取),自动提取仪,专用的可调移液管和阻止气溶胶的或正向位移的吸头,一个恒温加热器,专用的涡流混匀器,一个专用于悬挂实验室工作服及存放相应的安全物品(洗眼器、急救盒、淋浴器)的区域。如果该区域也存放化学药品,那么在这个区域应配备适当的设备和设施用于存放这些药品。该区域应配有一台带或不带计时器的紫外灯。2.4扩增和产品检测区-20℃的冷冻箱用于储存扩增产物和用于贮存试剂的冰箱,一台离心机(进行分子检测时的要求),一台PCR工作站(配有或未配计时器的紫外灯),扩增和凝胶电泳,测序仪或其他扩增产物检测所需的任何设备,专用的可调移液管和带滤芯的吸头,专用的涡流混匀器,一个专用于悬挂实验室工作服及存放相应的安全物品(洗眼器、急救盒、淋浴器)的区域。如果该区域也存放化学药品,那么在这个区域应配备适当的设备和设施用于存放这些药品。该区域应配有一台带或不带计时器的紫外灯。3建立良好操作规范为了最大程度地减少污染应建立良好操作规范,确保遵守良好操作规范是至关重要的。1)实验人员在上岗前,应经过严格的培训和考核,确保操作正确、熟练。应熟练掌握各项操作步骤,尽量在短时间内完成各项操作。在打开Eppendorf管之前应经低速、短时离心(2000~3000g,约10s),应使用正确的方法打开,不能用力崩开,以减少和避免气溶胶的产生。2)各区域要有明显标识,并使用单向流动降低潜在污染。用颜色标签对每个实验室的设备、试剂、工作服和供应品有助于保持单向流动。实验室手册和笔记本也不能在每个房间之间进行传递。实验室可以用电子数据报告以避免这种潜在污染的来源。3)在一天的工作中,实验员在扩增和产品检测室工作之后不能再返回试剂或样品提取区。类似地,实验员在样品提取区工作后不能返回试剂准备区。如果一个实验员不能不返回工作流向中上游的房间,实验员应该先淋浴和更换衣服。若在一些极端情况下,一些耗材和试剂不能不返回工作流向中上游的房间,必须事先使用漂白剂和酒精对其进行彻底清洁。返还的物品架在浸泡于蒸馏水中转移到洁净区之前,应浸泡在1%漂白剂溶液中过夜,如果破坏了工作流向,受影响的实验室房间和设备需进行检测结果的监测。4)每间实验室都应该配备专用实验室外套和无粉手套。实验者在任何时候都要穿工作服和佩戴手套。手套要经常更换,在DNA提取过程中每一步之间都要更换。离开实验室之前要脱掉实验服,扔掉手套。更换实验服和手套降低了模板(PCR进行需要的核酸)或扩增核酸的污染可能性。在处理了阳性对照样品或含目标序列的样品后、处理了模板或扩增核酸后,与外界皮肤接触后,要更换手套。后者防止引入在皮肤上存在的酶,如降解核酸的DNA酶和RNA酶。5)定期清洗防护服可降低对工作区和PCR反应的污染风险。实验服要和普通衣服隔离开(如实验服不能带回家,不能和其它衣服一起洗)。清洗时,一个工作区域的工作服放在一起洗(如样品核酸提取区的防护服不能和扩增及产品检测室的防护服一起洗)。负责清洗防护服的公司要确保分批清洗防护服,防止一个实验区域的防护服和另一个区域的防护服混杂在一起清洗。清洗的时间取决于实验室PCR工作的工作量,工作量大的实验室可能每周或每天清洗防护服。制作阳性对照时穿着的防护服要指定只用于这项工作时穿着,而且清洗得要更勤。为了减少清洗,也可以使用一次性防护服。6)每次实验后,所有表面都要用0.6%的次氯酸钠进行清理。次氯酸钠应该当天配制,将商业漂白剂与水进行1∶10的稀释,将pH调到7。这个溶液可以抑制致病原,破坏核酸。残留的漂白剂要用0.1%的硫代硫酸钠和70%乙醇或等价物去除,否则可能会在不锈钢或罩子上留下斑迹。商业产品是为去除核酸特别设计的,核酸酶也可以用于表面的清理。只要怀疑受到污染,热循环机和离心机用稀释的漂白剂清理(同3)。离心管的清洗根据制造商的说明。货架和托盘每次使用后在0.6%的次氯酸钠溶液中浸泡后用水充分冲洗。凝胶梳和玻璃器皿使用后用中性洗涤剂或用水冲洗。4一些具体污染防控措施1)应尽可能优化和整合样品DNA提取、反应液配制的操作步骤,以减少污染机会。所有试剂应以大体积、高浓度配制,然后稀释和分装成仅够一次使用的量进行贮存,以避免污染。2)尽量使用一次性的、带滤芯的加样器吸头,以减少气溶胶的污染机率。3)UNG控制污染:使用尿嘧啶DNA-糖苷酶(UNG),并用脱氧尿苷三磷酸(dUTP)代替脱氧胸苷三磷酸(dTTP)。其做法是将所有的扩增反应与UNG酶进行预反应,可以去除残留在DNA中的dU(但不影响DNA、gUTP或RNA),产生数十或数百的无碱基位点,DNA聚合酶会在这些位点处停滞。而且这些位点是不稳定的,在热循环中会发生断裂,每一种损伤都会防止重扩增的发生。PCR产物越长,UNG去污染的效率就越高,但对短于100bp的PCR产物不能用UNG完全消除污染。4)紫外线控制污染。用紫外线使干燥的DNA失活以减少器材表面模板DNA污染的手段,机理是通过在相邻的嘧啶碱基之间形成环丁烷而造成DNA损伤,环丁烷形成链内的嘧啶二聚体,从而抑制了聚合酶介导的链延伸反应。其缺陷是不能消除所有污染,而只能将污染降低几个数量级,并且当DNA片段小于300bp时效果较差。另外像加样器、离心机等器材只有一小部分是向着光源的,这样就不能被紫外线有效地去除污染。因而,紫外线照射仅可以为PCR实验室的无污染提供部分安全保障。5)应该在日常样品检测中分析阳性和阴性质量控制对照结果,以说明基于PCR方法的实验结果的可靠性。从污染控制角度,应合理设立阴性对照和空白对照1。1)阴性对照阴性对照是指应对使用的每一套引物和探针进行分析从而确定在样品处理过程中,反应预混液和样品中不存在核酸污染。在反应过程中,阴性对照没有扩增信号则说明检测体系是成立的。两种主要形式的阴性对照介绍如表1所列。(1)PCR阴性对照PCR阴性对照用于确保反应预混液中没有核酸污染。该对照是在配制主反应混合液中加入模版的步骤时加入的,只是加入的不是待扩增的模版而是加入分子生物学级别的水或缓冲液替代模版。阴性对照呈现阴性结果表明反应预混液和试剂都没有被污染。在每个PCR反应批次的每套引物的现场测试样品中按照1~5%的数量设置。一个PCR反应批次是指一组样品使用相同的PCR预混液和PCR仪,在相同的PCR反应条件下进行扩增。(2)方法的空白对照设置方法的空白对照是为了检查在样品处理过程和PCR分析过程中是否有污染。这个控制步骤是通过使用灭菌水完成的,这份灭菌水与测试样品一起经过前处理,核酸提取,样品转移以及PCR反应等步骤。每一样品批次至少设置一个方法的空白对照。一个样品批次是指测试样品的整过实验步骤包括从样品处理直到PCR反应。不同种类的转基因样品,如果前处理和核酸提取步骤不同,就视为不同的样品批次的样品。2)环境质控对照这种对照可每月进行一次。具体方法是:在试剂准备区,向主反应混合液中加入灭菌水以替代模板。然后将这些PCR管放置在试剂准备区、样品准备区、核酸提取区中,将盖子打开,暴露15分钟后盖好。将这些PCR管同阴性对照一样进行PCR扩增。如果任何一管出现阳性,则应立即停止所有工作,查找污染原因实施纠正措施。5结束语综上所述,在转基因检测实验室建立时,合理分区和配置仪器耗材是防控污染的基础条件,但在运行过程中,检测人员的良好操作习惯和防控意识是关键所在,这是依赖专业培训和演练逐渐形成的。对于目前PCR技术占主流的转基因检测实验室,一旦发生实验环境的污染,要清除污染是非常繁琐的一项工作。因此,要将重点放在环境条件的控制和预防上而不是事后的排除污染,只有这样才能以较低的成本确保检测活动的正常进行,确保检测结果可靠。