稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶_PEPCase_基因的克隆与分析
磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）是一种重要的酶类，参与碳的代谢过程，在许多生物体中起着关键的作用。
该酶催化磷酸烯醇化合物和二氧化碳在碳代谢途径中的转化，将磷酸烯醇化合物转化为草酰乙酸（oxaloacetate）。
本文将对磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶的结构、功能和调节机制进行探讨。
磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶是一种转运酶（transcarboxylase），催化的反应是将磷酸烯醇化合物和碳酸转化为草酰乙酸。
该酶广泛存在于植物、细菌和真核生物的细胞质中，并且在植物中存在多个亚型。
PEPC在植物中起着重要的作用，特别是在光合作用的碳固定和二氧化碳浓缩中。
在一些C4植物（如玉米、甘蔗和高粱）中，PEPC被发现在叶肉细胞的细胞质中大量表达，它们参与光合作用的初始碳固定步骤。
因此，PEPC在植物的生长和发育中起着重要的调控作用。
磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶的结构是多样的，不同来源的酶具有不同的亚型和结构特征。
然而，这些结构中的酶都具有共同的特点，包括高度保守的活性位点和催化中心。
PEPC通常是由四个相同的亚基组成，每个亚基包含一个催化中心。
这些亚基通过非共价相互作用力（如离子键、氢键和疏水相互作用）相互结合形成四聚体结构。
在催化中心中，PEPC通过与金属离子（如锰、镁或钙）结合来促进催化反应。
磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶的功能主要体现在其对碳代谢途径的调控。
PEPC在光合作用过程中起到关键的作用。
在C4植物中，PEPC催化的反应是光合作用的第一步，将二氧化碳固定为草酰乙酸，然后将其转运到细胞鞘细胞中进行光合作用。
这种C4途径有效地减少了光呼吸对植物光合作用效率的影响。
另外，在某些条件下，PEPC还可参与细胞的呼吸过程，将草酰乙酸转化为磷酸烯醇化合物，从而提供能量。
磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶的活性受到多种因素的调节。
首先，PEPC的活性可通过调节其基因表达水平来实现。
大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的克隆和表达
大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的克隆和表达作者：何晓亮李竹梁立强孟万利来源：《河北科技大学学报》2019年第02期摘要：为了更好地研究磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的結构和功能，采用PCR（聚合酶链式反应）、双酶切和细胞转化等基因工程方法对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因进行克隆并使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表达分析，扩增出一个新的大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，将其基因克隆到原核表达载体pET-30a上，并导入到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中。
通过IPTG诱导成功表达出大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
所提出的方法能够高效表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，为进一步大规模表达纯化和应用提供参考。
关键词：基因工程;大肠杆菌;磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶;基因表达;二氧化碳中图分类号：Q812文献标志码：AAbstract：In order to better study the structure and function of phosphoenolpyruvate carboxylase， the phosphoenolpyruvate carboxylase gene is cloned and expressed by PCR （polymerase chain reaction）， double enzyme digestion and cell transformation. The results showthat the new phosphoenolpyruvate carboxylase gene of Escherichia coli is successfully amplified andcloned into the prokaryotic expression vector pET-30a， and then introduced into Escherichia coli BL21 expression system. The phosphoenolpyruvate carboxylase of Escherichia coli is successfully induced by IPTG. The phosphoenolpyruvate carboxylase can be efficiently expressed by using the proposed method， which provides preparation for further scale expression， purification and application.Keywords：genetic engineering; Escherichia coli; phosphoenolpyruvate carboxykinase; protein expression; CO2磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）是一种存在于磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳反应生成草酰乙酸过程中的催化酶[1-3]。
花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及反义表达载体的构建
（ ． 山东农业大学农学院 ；２ １ ．作物生物学国家重点实验室 ，山东 泰安 ２ １ １ ） ７ ０ ８
摘要 ：磷 酸烯醇式丙酮酸羧化 酶 （ Ｅ Ｃ ｓ ）是控制植物籽 粒 中蛋 白质／ Ｐ Ｐ ａｅ 油脂 含量 比例的关键 酶。本研究 利用 Ｒ Ｐ Ｒ技术 ，克隆 Ｐ Ｐ ａｅ基因的 ｃ Ｎ Ｔ— Ｃ Ｅ Ｃｓ Ｄ Ａ片段 ，并将克隆 的 Ｐ Ｐ ａｅ 因片段反 向连接 替代植 物表达 载体 Ｅ Ｃｓ 基
ｐ Ｇ Ｅ 。为通过反 义抑 制技 术提高花生含油量提供 了基 因及 表达载体 。 Ｂ ＰＰ
关键 词 ：花生 ；Ｐ Ｐ羧化酶 ；Ｒ Ｐ Ｒ；反义表达载体 Ｅ Ｔ— Ｃ 中图分类号 ：Ｓ １．３ ８ ７ 文献标识码 ：Ａ 文章编号 ：１０ ０ ０—２２ （０ ０ ｌ ０ ０ —０ ３ ４ ２ １ ）Ｏ 一 ０ １ ５
（ ． Ａ ｒｎ ｍ ｏｌ ｅｏ ｈ ｎ ｏｇＡ ｃｌ ｒｌ ｎｖｒｔ；２ Ｓａ ｅ ａｏａ ｒ ｏ ｒｐＢｏｏｙ ，Ｔ ｉ ７ ０ ８，Ｃ ｉａ １ ｇｏｏ ｙＣ ｌｇ ｆ ａ ｄｎ ｕｔ ａ Ｕ ｉ ｓｙ ． ｔｅＫ ｙＬ ｂｒｔ ｙ ｆ ｏ ｉｌ ｅ Ｓ ｕ ｅｉ ｌ ｏ Ｃ ｇ ａａ ２ １ １ ｎ ｈｎ ）
Ｐ Ｉ２ Ｂ １ １的 Ｇ Ｓ基因。从花生栽培 品种荔蒲大花 生中克隆获得 编码 Ｐ Ｐ ａｅ基因 的 ｃ Ｎ Ｕ Ｅ Ｃｓ Ｄ Ａ片段 （ ８ ｐ ，测序 ８ ６ｂ ）
结果 显 示 其 核 苷 酸 序 列 与 已报 道 的 花 生 （ Ｕ ９ ６ ９ 、棉 花 （ Ｙ ０ ９ ９） Ｅ ３ １２ ） Ａ ０ ８ ３ 、大 豆 （ １７７） Ｄ ０ １ 、拟 南 芥
Ａｂｔａ ｔ ｈ ｓｈｅ ｏｐｒｖｔ ｃｒｏｙａｅ（ Ｅ Ｃ ｓ ）ｐａｓａ ｐ ｒ ｎ ｒｌ ｉ ｅｃｎｒｌ ｆｈ ａ ｏｏ ｅ ｓｒｃ ：Ｐ ｏｐ ｏｎ ｌｙｕ ａ ａｂｘ ｌ ｅ ｓ Ｐ Ｐ ａｅ ｌｙ ｎｉ ｏｔ ｔ ｏ ｔ ｏ ｔ ｅｒｔ ｆ ｈ ｍ ａ ｅｎ ｈ ｏｏｔ ｉ ｔ
植物细菌型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的生物信息学分析
［5 ， 6 ］
1
1． 1
材料与方法
植物细菌型 PEPC 成员搜索
gov / ） 中， 利用拟南芥中的细菌型 PEPC 基因 Atppc4 （ 登录号： CAD58727 ） 的氨基酸序列作为检索 序列搜索相似的蛋白序列， 共得到百余条氨基酸 序列， 根据植物型 PEPC 与细菌型 PEPC 的差别， 即细菌型 PEPC 的 N 端没有含有丝氨酸残基的 酸性不变序列： － XX － SIDAQLR 和植物型 PEPC 的 C 端的倒数第 4 个保守氨基酸为谷氨酰胺 （ glutamine） ， 而细菌型 PEPC 则为 精 氨 酸 （ arginine） 或 赖 氨 酸 （ lysine ） 。 在 拟 南 芥 （ Arabidopsis thaliana） 、 花生（ Arachis hypogaea ） 、 油菜 （ Brassica napus ） 、卷 柏 （ Selaginella moellendorffii ） 、大 豆 （ Glycine max） 、 水稻 （ Oryza sativa japonica ） 、 云杉 （ Picea sitchensis ） 、 毛 果 杨 （ Populus trichocarpa ） 、 蓖麻 （ Ricinus communis ） 、 高粱 （ Sorghum bicolor ） 和葡 萄 （ Vitis vinifera ） 11 种 植 物 中 获 得 细 菌 型 PEPC 蛋白质序列， 其中有的植物中的一个细菌 型 PEPC 基因具有多种可变剪接形式， 编码不同 ， （ Selaginella moellendorffii ） 的细 的蛋白质 如卷柏 菌型 PEPC 基因有 4 种不同剪接形式， 编码 4 种 蛋白质， 大豆（ Glycine max ） 有 2 种， 蓖麻 （ Ricinus communis） 有 3 种， 但由于可变剪接所编码蛋白 质包含几乎相同的氨基酸序列， 在进一步的多序 列联配和系统进化的分析中总是排列在一起， 所 以仅选取其中信息完整一种形式， 共得到 11 条 植物细菌型 PEPC 蛋白质序列 （ 表 1 ） 。 从 NCBI CDS 和蛋白 数据库中分别下载其相应的核苷酸、 质序列。 2． 2 植物细菌型 PEPC 基因结构分析 分析候选的 11 种植物的 NCBI 的数据， 其中 5 种植物的细菌型 PEPC 基因目前只报道了编码
玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及其表达载体构建
河南农业科学，2018，47 (5):16-23Journal of Henan Agricultural Sciences d〇i：10. 15933/ki. 1004-3268.2018.05.004玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及其表达载体构建曹路遥\周岩14，魏琦超\陈燕绘\陈亚东1!2,蔺一帆\田瑞婷1(1.河南科技学院生命科技学院/现代生物育种河南省协同创新中心，河南新乡453003;2.河南省华隆生物技术有限公司，河南新乡453003)摘要：为了克隆磷酸晞醇式丙酮酸羧化酶（P E PC ae)的编码基因以用于表达载体的构建，本研究根据已公开的序列信息设计特异性引物，以玉米自交系ZD410的叶片D C A为模板，通过P C R技术成功克隆了 D D基因的全长序列。
生物信息学分析发现，该基因完整0P F长度为2 913 bp，编码蛋白质分子质量约为108. 179 ku，等电点（PI)为5.73;对其氨基酸序列进行同源性检索分析显示，该蛋白质与其他C4植物的P E P C蛋白具有极高的同源性；利用Gateway技术构建含D D目的基因的表达载体，并通过农杆菌介导的花序浸染法将该基因导入野生型拟南芥。
关键词：玉米；磷酸晞醇式丙酮酸羧化酶基因；基因克隆；载体构建；拟南芥'遗传转化中图分类号：S513 文献标志码：A文章编号％ 1004 -3268(2018)05 -0016 -08Cloning 〇0 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Gene from Maize andConstruction of Its Expression VectorCAO Luyao1，ZH0U Yan1*，WEI Qichao1，CHEN Yanhui1，CHEN Yadong1，2，LIN Yifan1，T IT A N Ruiting1(1.School of Life Science and Technology，H enan In stitute of Science an d Technology/H enan Province CollaborativeIn novation Center of M od ern Biological Breeding，Xinxiang453003，China；2.H enan H ualong Biological Technology Co.，Ltd.，Xianxiang453003，China)Abstract%I n o nier to clone the encoding gene of phosjDhoenoljDyruvate carlDoxylase for use in the construction of expression vectors，specific primers were designed b ased on the publislied seque tion，and the leaf DNA of maize inbred line ZD410 was used as a template to succe length sequence of D D gene by PCR.Bioinformatics analysis showed that the length of the complete ORFwas 2 913 b p，the molecular weight of the encoded protein was about 108. 179 k u，and the isoelectricpoint was5. 73. The amino aci(d sequence coded of the gene was homologously showed that the protein was related to the PEPC of o tiier C4plants.Gateway technology wa struct an expression vector containing the target gene_p e$c，and the gene was introduced abidopsis through Agrobacterium tumefaciens-mediated inflorescence dip method.Key words%Maize;pepc gene;Gene cloning；Vector construction；Arabidopsis thaliana；Genetic transformation光合作用是地球碳-氧平衡的重要媒介，是植 物赖以生存的基础，也是决定作物产量高低的重要因素之一。
002植物磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶及其编码基因研究进展
植物磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶及其编码基因研究进展杨玲玲（化学与生命科学学院2009级食品质量与安全监测专业学号091004024）指导教师：蔡英卿副教授摘要：本文主要介绍了C4植物中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）及其编码基因在近年来的研究进展，以及对PEPCK的结构，功能,影响其活性的因素等方面进行讨论。
关键词：C4植物磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因光合速率磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK，EC4．1．1．49)催化如下的反应：OAA +ATP →PFP+ADP+CO2。
PEPCK主要作用是参与C4代谢途径的CO2固定作用。
其主要分布在C4植物的叶肉细胞的叶绿体内，形成CO2的浓缩机制为维管束鞘细胞的C3途径提供CO2。
近些年来利用生物技术已将编码该酶的基因(ppc)转移到C3作物中并得到了超量表达，因此，PEPCK成为改善C3作物光合作用重点关注的酶。
对PEPCK有两种形式：一种是存在于哺乳类、鸟类和昆虫等动物内的PEPCK．它利用GTP为底物，Mt 为70000 ；另一种存在于植物、细菌、酵母和藻类中，利用ATP作底物，这种PEPCK的蛋白质分子序列与动物中的不同。
植物的PEPCK与细菌、酵母和藻类的氨基酸序列比较接近，都有一个与ATP结合的保守序列，但来自植物的PEPCK 相对分子质量较太。
本文主要简述近年来对C4植物PEPCK的研究进展。
1 PEPCK的分布与定位1.1 PEPCK的分布1.2 PEPCK的定位2 PEPCK的蛋白结构和生理功能2.1 PEPCK的蛋白结构2.1.1相对分子质量2.1.2活化中心2.2 PEPCK的生理功能2.2.1 生糖作用2.2.2 浓缩CO22.2.3 细胞内的PH平衡2.2.4 其他作用3 PEPCK酶的调节3.1磷酸化调节3.2产物调节4 PEPCK的分子生物学4.1 PEPCK基因的结构特征4.2 PEPCK基因的克隆5 结语。
PEPCase在植物有机酸代谢中的研究进展
Ｖｏ ． ８ １３
Ｎｏ ．１
河 南 科 技 学 院 学 报 ｆ自 然 科 学 版 ）
２ １ 年 ３ 月 ００
Ｍａ ． ０ ０ ｒ２ １
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｎ ｎ Ｉ ｓｉｕ ｅ ｏ ｃｅ ｃ ｎ ｅ ｈ ｏｏ ｙ ｏ ｒ ａ ｆＨｅ ａ ｎ ｔ ｔ ｆＳ ｉｎ ｅａ ｄ Ｔ ｃ ｎ ｌｇ ｔ
很 少发现ｆ Ｐ Ｐ ａｅ ２ Ｅ Ｃ ｓ 在植物代谢 中发挥着 重要 作用 ， 】 ． 本文就 其对植物有机 酸代谢 的调节作 用作 一综述．
在 于植物 细胞质 中的一种酶 ， 化磷 酸烯醇 式丙 酮酸 （ Ｅ ） Ｈ ０ － 生成 草酰 乙酸 和无机磷 ，以往 催 Ｐ Ｐ与 Ｃ ３ 反应
研究大多侧重 于 Ｐ Ｐ ａｅ在 Ｃ Ｅ Ｃｓ ４和 Ｃ Ｍ 植物光合代谢 中的关 键作用 ，而很少 涉及其在 Ｃ Ａ ４和 Ｃ Ｍ植物 Ａ
的非光合组 织 以及 在 Ｃ ３植物 的一些 用途… Ｐ Ｐ ａｅ主要存 在于高等植 物和 细菌 中 。 ．Ｅ Ｃ ｓ 在动物 和酵母 中
Ｋ ｅ ｒ ｓ Ｐ Ｐ ａｅ，ｒａ ｉ ａ ｉ ｔｂ ｌ ｍ ， ｅ ｎ ｙ ｙ ｗｏ ｄ ： Ｅ Ｃ ｓ ｏｇ ｎｃ ｃｄ ｍｅａ ｏｉ ｋ ｙｅ ｚｍｅ ｓ
磷酸 烯 醇式 丙 酮 酸羧 化 酶 （ｈ ｓｈ ｅ ｏ ｙ ａｅｃ ｒｏ ｙ ｓ ， Ｃ ．．．１ ， Ｐ ｏｐ ｏ ｎｌ ｍｖｔ ａｂ ｘｌ ｅ Ｅ ４１ ３ ） 简称 Ｐ Ｐ ａｅ 是广 泛存 ｐ ａ １ Ｅ Ｃ ｓ，
酸循 环 的 顺 利进 行 ， 控果 实有 机 酸 的合 成 与 转 化 ， 时 紧 密联 系植 物 体 内 的碳 氮代 谢 ． 述 了 Ｐ Ｐ ａｅ的生 调 同 论 Ｅ Ｃｓ 理 特 性 和 功 能 ， 其在 植 物 体 内有 机 酸代 谢 中 的关 键 作 用 ， 论 其 可 能存 在 的调 控 机 制 ． 时对 以后 的研 究 提 及 讨 同
玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的克隆及序列分析
玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的克隆及序列分析王重;樊哲儒;张跃强;李剑峰;高新【摘要】Objective] To clone the phosphoenolpyruvate carboxylase(PEPC) gene obtained from Zea mays and analyze it by bioinformatics. [ Method] Primarily, the cDNA clone was constructed by RT-PCR amplified with the gene specific primers, then positive clones were se-quenced and analyzed by bioinformatics.[ Result] The electrophoresis showed that the coding sequence( CDS) of PEPC gene in Zea mays was 2 913 bp and the polypeptide chains coded by PEPC included 926 amino acids, which were hydrophobic amino acids consists of-helix (61.44%), random coil (34.43%) and extended strand (4.12%), with located in the cytoplasm.There was no transmembrane domain. The 175-970 amino acid composition the functional domains of phosphoenolpyruvate carboxylase, in 173-184;597-609 bits had two phos-phoenolpyruvate carboxylase active site with pyruvate orthophosphate dikinase basing on amino acids sequences comparison.[ Conclusion] The PEPC gene in Zea mays has been obtained and the amino acids sequence coded by the gene was conserved and contained active catalyst central site of PEPC.%[目的]获得玉米的PEPC基因，并对其生物信息学进行分析。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)提取液
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)提取液简介：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)是C4植物和CAM 植物固定CO 2的关键酶，为催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸呈不可逆反应的酶，在植物和细菌中广泛存在，在动物及丝状霉菌中缺乏此酶。
大肠杆菌中的酶分子量约36万的四聚体，可受很多因素的影响，例如可为乙酰辅酶A 活化，可受天门冬氨酸抑制。
此酶是变构酶，主要功能为供给三羧酸循环以草酰乙酸，另外也与C4植物光合二氧化碳固定反应(C4二羧酸循环)及景天科植物的苹果酸形成(景天酸代谢)等有关。
Leagene 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)提取液主要用于裂解植物组织，提取样品中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、蒸馏水2、离心管或试管3、匀浆器或研钵4、低温离心机操作步骤(仅供参考)：1、取植物组织清洗干净，切碎。
2、加入预冷的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶提取液，冰浴情况下充分匀浆或研磨。
3、经纱布或滤纸过滤，留取滤液待用。
3、离心，留取上清液。
4、冻存，用于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的检测或其他用途。
计算：组织或植物粗酶液获得率(ml)=上清液体积(ml)/组织或植物质量×100%注意事项：编号名称CS0421Storage 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶提取液500ml 4℃使用说明书1份1、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。
2、所测样本的值高于标准曲线的上限，应用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶提取液稀释样品后重新测定。
3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：6个月有效。
相关：编号名称CC0007磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁)CS0001ACK红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer)DC0032Masson三色染色液DF0135多聚甲醛溶液(4%PFA)NR0001DEPC处理水(0.1%)PS0013RIPA裂解液(强)TC1167尿素(Urea)检测试剂盒(脲酶波氏比色法)。
麻疯树磷酸烯酮式丙酮酸羧化酶pepc基因全长cDNA克隆及序列分析
（ ．Ｒ ｓａｃ ｓｔｔ ｏ ｕ ｔ ｐｃｌＦｒｓ ｙ ｈｎ ｓ ｃｄｍ ｏｅｔ ， ｕ ａｇ ３ ０ Ｚ ｅａ ｇ ｈｎ ； １ ｅｅｒｈＩ ｔｕｅ ｆ ｂｒ ｉ ｏｅｔ ，Ｃ ｉｅｅＡ ａ ｅ ｙＦｒｓ ｙ Ｆ ｙｎ １ ０， ｈｊ ｎ ，Ｃ ｉ ｎｉ Ｓ ｏ ａ ｒ ｒ １４ ｉ ａ ２ ｅｅｒｈＩｓｔｔ ｏ ｏ ｔ ，Ｃ ｉｅｅＡ ａ ｅ ｙＦｒｓ ｙ，Ｂ ｉｎ １０ ９ ，Ｃ ｉａ ．Ｒ ｓａｃ ｎｔｕｅ ｆ ￣ｓ ｙ ｈｎ ｓ ｃｄｍ ｏｅｔ ｉ Ｆ ｒ ｒ ｅ ｉｇ ０ ０ １ ｈｎ ） ｊ
中 图 分 类 号 ：７ ８４ ￥ １ ．６ 文献标识码 ： Ａ
Ｃｌ ｎ ｎｇ ａ ｑ ｎ ｅＡｎａｙ ｉ ｆＦｕｌ－ｅ ｔ ＤＮＡ ｆ ｏ ｉ ｎｄ Ｓｅ ｕｅ ｃ ｌｓｓｏ ｌｌｎｇ ｈ ｃ ｏ
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植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)酶联免疫分析试剂盒使用说明书
植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
96T检测范围：0.8 U/ml-24 U/ml使用目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）活性。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物苹果酸酶（malic enzyme）水平。
用纯化的植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase），再与HRP标记的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加入底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）活性浓度。
试剂盒组成：1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7 终止液6ml×1瓶2 酶标试剂6ml×1瓶8 标准品（48U/ml) 0.5ml×1瓶3 酶标包被板12孔×8条9 标准品稀释液 1.5ml×1瓶4 样品稀释液6ml×1瓶10 说明书1份5 显色剂A液6ml×1瓶11 封板膜2张6 显色剂B液6ml×1瓶12 密封袋1个标本要求1、标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
2、不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶（HRP）的活性。
操作步骤1、标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图标在小试管中进行稀释。
24U/ml 5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液12U/ml 4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液6U/ml 3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液3U/ml 2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液1.5U/ml 1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液2、加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
C3和C4植物中PEPC的生物信息学分析
C3和C4植物中PEPC的生物信息学分析摘要：ＰＥＰＣ是Ｃ４光合途径中的关键酶之一，为研究Ｃ３和Ｃ４植物ＰＥＰＣ功能上的差异，利用一系列的生物信息学软件分别分析了４种Ｃ３和Ｃ４植物ＰＥＰＣ基因编码蛋白的氨基酸组成、等电点、结构域、二级结构、空间结构等性质，并进行两类植物蛋白质的比对。
结果表明，ＰＥＰＣ基因编码蛋白为不稳定蛋白质；二级结构主要是以无规则卷曲为主。
同时揭示出Ｃ３和Ｃ４植物ＰＥＰＣ存在一定差异。
用ＥＳｙＰｒｅｄ３Ｄ的建模服务器进行ＰＥＰＣ结构的三维建模，预测得到一个同源性较高的蛋白质结构数据１ＪＱＯｃｈａｉｎＡ，同源性为９９．７％，从而构建目标序列的三级结构。
利用ＰＲＯＣＨＥＣＫ对建模结果进行检测，模拟得到的玉米ＰＥＰＣ蛋白质的三维结构的氨基酸残基有９４．２％位于Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ点图中合理区域，模拟得到的玉米ＰＥＰＣ的三维结构是可靠的。
关键词：Ｃ３植物；Ｃ４植物；ＰＥＰＣ；生物信息学Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎＣ３ａｎｄＣ４ＰＥＰＣ，ＰＥＰＣｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｆｏｕｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔＣ３ａｎｄＣ４ｐｌａｎｔｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｖａｒｉｏｕｓｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｔｏｏｌｓｔｏｐｒｅｄｉｃｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｓｕｃｈａｓａｍｉｎｏａｃｉｄｓｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，pＩ，ｄｏｍａｉｎｓ，ｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎｄｓｐａｔｉａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；ａｎｄｔｈｅＰＥＰＣｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＣ３ａｎｄＣ４ｐｌａｎｔｓｗｅｒｅａｌｉｇｎｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＰＥＰＣｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｕｎｓｔａｂｌｅａｎｄｔｈｅｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｗｅｒｅｍａｉｎｌｙｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆｒａｎｄｏｍｃｏｉｌ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｓｏｍｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎＰＥＰＣｓｏｆＣ３ａｎｄＣ４ｐｌａｎｔｓ．Ａｈｉｇｈｌｙｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ（９９．７％）ｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄａｔａ１ＪＱＯｃｈａｉｎＡｗａｓｐｒｅｄｉｃｔｅｄｂｙｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｏｆＰＥＰＣｂｙＥＳｙＰｒｅｄ３Ｄ，ｔｈｕｓｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄｔｈｅｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｂｕｉｌｄｉｎｇｏｆｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅ．ＴｈｅｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｍｏｄｅｌｏｆＺｅａｍａｙｓＰＥＰＣwas ｆｕｒｔｈｅｒｃｈｅｃｋｅｄｂｙＰＲＯＣＨＥＣＫｐｒｏｇｒａｍｍｅｒ，ａｎｄｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ９４．２％ｏｆｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓwere ｌｏｃａｔｅｄｉｎｔｈｅｍｏｓｔｆａｖｏｒｅｄｒｅｇｉｏｎｓｉｎＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎｐｌｏｔ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｓｉｍｕｌａｔｅｄｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＺｅａｍａｙｓＰＥＰＣｗａｓｒｅｌｉａｂｌｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃ３ｐｌａｎｔ；Ｃ４ｐｌａｎｔ；ＰＥＰＣ；ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ与Ｃ３植物相比，Ｃ４植物具有光合效率高、ＣＯ２补偿点低、几乎没有光呼吸等优点，特别在强光、高温、干旱等条件下，Ｃ４植物具有明显的生长优势及较高的水分和营养利用率，生物学产量也较高［１］。
花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其编码的蛋白质以及克隆方法[
专利名称：花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其编码的蛋白质以及克隆方法
专利类型：发明专利
发明人：禹山林,潘丽娟,杨庆利,江燕,闵平,曹玉良
申请号：CN200810002795.4
申请日：20080123
公开号：CN101230353A
公开日：
20080730
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了调控花生籽粒蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列及所编码的蛋白质序列。
本发明还提供了该花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆方法。
本发明基因AhPEPC的mRNA表达分析表明该基因在脂肪含量不同的花生品种间表达差异明显。
申请人：山东省花生研究所
地址：266100 山东省青岛市李沧区浮山路126号山东省花生研究所
国籍：CN
代理机构：北京集佳知识产权代理有限公司
代理人：孙长龙
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植物细菌型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的生物信息学分析
植物细菌型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的生物信息学分析关晶晶;陈锦清;汪小福
【期刊名称】《浙江农业学报》
【年(卷),期】2011(023)002
【摘要】采用生物信息学方法对GenBank中的拟南芥、油菜、大豆、花生和水
稻等11种植物细菌型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的核苷酸和氨基酸序列进行了比对分析,进而对其基因结构、系统进化、理化性质、亚细胞定位、疏水性、功能结构域及蛋白质三级结构等重要参数进行了预测和分析.
【总页数】6页(P203-208)
【作者】关晶晶;陈锦清;汪小福
【作者单位】浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华,321004;浙江省农业科
学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州,310021;浙江省农业科学院病毒学与生物
技术研究所,浙江杭州,310021;浙江省农业科学院农产品质量标准研究所,浙江杭州,310021
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
【相关文献】
1.海水小球藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（Chpepc2）克隆和生物信息学分析[J], 黄希文;施定基;贾晓会;田琪琳;贾睿;何培民
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杨晓娜;陈自宏;陈宏艳;谢雯颖
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C4植物PEPCase单克隆抗体的制备与ELISA检测方法的建立的开题报告
C4植物PEPCase单克隆抗体的制备与ELISA检测方法的建立的开题报告一、研究内容本研究计划制备一种特异性较高的C4植物PEPCase单克隆抗体，并建立ELISA检测方法，用于定量检测C4植物中PEPCase的含量。
二、研究背景C4植物是指一类能够通过层次式光合作用进行固碳的植物，如玉米、甘蔗等。
在C4植物中，PEPCase(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)是一个关键的酶，起着固碳酸化的作用。
因此，PEPCase在C4植物中的含量对于其生长发育和产量具有重要的影响。
目前，用于检测C4植物中PEPCase含量的方法主要有西方印迹和酶联免疫吸附试验(EILSA)两种。
虽然西方印迹可以检测蛋白质，但是其灵敏度低且只能半定量分析，而ELISA虽然具有高灵敏度和特异性，但是目前还没有相应的商用单克隆抗体。
三、研究计划1. 克隆C4植物PEPCase基因，构建表达载体并进行表达纯化；2. 将表达的PEPCase蛋白用于免疫BALB/c小鼠，制备特异性较高的单克隆抗体；3. 优选抗体并进行鉴定。
4. 用所制备的抗体建立ELISA检测方法，并优化反应条件；5. 用所建立的ELISA检测方法检测不同组织中PEPCase的含量，并进行定量分析；6. 将所制备的抗体应用于C4植物中PEPCase含量的变化研究。
四、研究意义本研究通过制备特异性较高的C4植物PEPCase单克隆抗体，并建立ELISA检测方法，可以更准确、快速地定量分析C4植物中PEPCase的含量，为C4植物生长发育及产量的研究和调控提供重要的依据。
同时，所制备的抗体可用于其他相关研究，具有较为广泛的应用前景。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶综述
文献综述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶综述[摘要]磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶( PEPC)广泛存在于高等植物、藻类及大多数细菌中, 催化C4光合作用固定CO2的第一步反应。
在过去的10年中关于 PEPC分子的一级结构研究已取得显著的进展, 最近, 通过X- 射线衍射分析阐明了大肠杆菌和米C4型PEPC分子的三维结构, 就这些研究进展进行总结。
关键词: 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶大肠杆菌 PEPC 玉米 C4型 PEPC 分子结构一、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的分子结构[1]PEPC (EC4.1.1.31)以 Mg2+或 Mn2+为辅助因子,催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和HCO3-生成草酰乙酸( OAA)和无机磷酸的不可逆性反应。
PEPC广泛存在于光合生物, 如植物、藻类、蓝细菌和光合细菌中, 还存在于很多非光合细菌和原生动物中。
PEPC催化的反应为细胞各种组分的生物合成提供四碳二羧酸, 参与维持柠檬酸循环, 在初级代谢中有重要的补给作用, 在C4植物和CAM 植物的光合作用中催化大气中CO2固定的第一步反应, 是C4光合作用途径中最重要的酶之一。
所有已知的PEPC均是四聚体,四个相同亚基的分子量大约为95~110k Da。
大多数 PEPC是变构酶, 其活性调控方式为变构作用。
不同种类生物的PEPC有多种变构效应物。
把C4光合作用特异性的PEPC基因导入C3植物中,以期提高C3光合作用效率, 是目前植物基因工程的一个研究热点。
研究结果发现在转基因植物中PEPC的活性也如同在C4植物中一样, 受代谢产物如苹果酸, 6-磷酸葡萄糖(Gluc6-P)和可逆性磷酸化的共价修饰调控。
由于PEPC的变构调控方式和机理很复杂,使PEPC的转基因操作得不到预期的结果, 为此PEPC的分子特性需要通过基因工程改造使之更适合转基因操作的要求。
对PEPC分子结构的研究可以为基因工程改造PEPC的分子特性提供理论依据、为提高C3光合作用固定CO2的效率和作物的产量提供有益的启示。
磷酸烯醇丙酮酸羧化酶蛋白参与植物抗病
磷酸烯醇丙酮酸羧化酶蛋白参与植物抗病磷酸烯醇丙酮酸羧化酶蛋白（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）是植物中一种重要的酶类，参与了植物的生长发育以及病害抗性方面的调节。
磷酸烯醇丙酮酸羧化酶蛋白在植物中广泛分布，包括了细胞质、叶绿体以及线粒体等亚细胞结构中，其主要作用是在CO2固定途径中转移CO2，供给植物进行合成反应，同时也可以调节植物的碳和氮的代谢，在植物的生长发育及逆境环境中发挥重要的作用。
同时，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶蛋白也可以参与植物的光合作用、呼吸等多种代谢通路中。
除了上述的生理作用外，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶蛋白在植物的病害防御中也扮演着重要的角色。
研究表明，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶蛋白的表达水平和活性发生了改变，可以影响植物对病原体的抗性。
在一些非生物胁迫和生物胁迫（如病原菌、真菌、病毒等）的情况下，植物的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶蛋白的活性明显增加，这有助于植物增加对外来病原体的抵抗力。
例如，在棉花的病毒侵染中，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶蛋白的表达水平发生显著变化，同时也与棉花的病毒感染程度密切相关。
研究发现，植物中磷酸烯醇丙酮酸羧化酶蛋白的活性会受到多种因素的影响。
在病原体的攻击下，植物可能会释放出一些前体物质，如异戊酸和丙酮酸等，此时磷酸烯醇丙酮酸羧化酶蛋白将会被激活，从而增强植物的抗病能力。
同时，在植物的光合作用过程中，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶蛋白的活性也会发生变化，促进植物的碳代谢及胁迫响应等过程。
除此之外，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶蛋白的表达水平也可以受到基因调控的影响。
目前研究表明，植物中有多种转录因子在调控磷酸烯醇丙酮酸羧化酶蛋白基因的表达水平，从而影响其活性和功能。
这也为我们深入研究植物的病害抗性机制提供了一定的理论依据。
总之，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶蛋白在植物的生长发育及病害抗性等方面都发挥着重要的作用。
未来需要继续加强对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶蛋白的机制研究，深入分析其在植物中的功能及其调节机制，为植物的病害防治以及生长发育等过程提供重要的科学依据。
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作 物 学 报
第 31 卷
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)的主要作 用是参与 C4 代谢途径的 CO2 固定作用 。 其主要分 布在 C4 植物的叶肉细胞的叶绿体内 , 形成 CO2 的浓 缩机制为维管束鞘细胞的 C3 途径提 供 CO2 。 近些
年来利用生物技术已将编码该酶的基因(ppc)转移 到 C3 作物中并得到了超量表达[ 1 , 2] , 因此 , PEPCase 成为改善 C3 作物光合作用重点关注的酶 。 对多种 植物的 ppc 序列和结构 已进行了详尽 解析[ 3 ～ 8] , 为 转 C4 基因作物的改造研究奠定了重要基础 。
根据已报道甘蔗的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基 因 cDNA 全长序 列 , 设计 1 对引物 , 序 列为 P1 :5′ACT TCT AGA ATG GCG TCC GAG CGG CAC C-3′, P2 :5′-GTA GGT ACC CTA GCC GGT GTT CTG CA-3′。
以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增 。 所用的 Taq 酶 为 Takara LA Taq , 反应程序采用两步法进行 , 94 ℃预 变性 5 min , 94 ℃变性 30 s 、70 ℃复性 30 s 、70 ℃延伸 3 min , 30 个循环 , 然后 70 ℃延伸 10 min 。 1.4 PCR 产物的克隆
(1 中国农业大学农学与生物 技术学 院 , 北 京 100094 ;2 中 国农业 科学 院作 物科 学研究 所 , 北 京 100081 ;3 北京 师范 大学 生命 科学 学院 , 北 京 100875)
摘 要 :为揭示 C4 野生植物稗草(Echinochloa crusgalli)PEPCase 的结构和功能特点 , 探索改善 作物高光效 新途径 , 克隆了 稗草(E.crusgalli)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)的 cDNA 全长 , 测序及同源性比较分析结果证实 , 稗草 ppc 的 cDNA 全长为 2 886 bp, 编码 961 个氨基酸(GenBank 登录 号 :AY251482);核苷酸序 列与谷 子(Setaria italica)C3 型 、高 粱(Sorghum bicolor)C3-2 型 、玉米(Z ea mays)C3-2 型 、水稻(Oryza sativa)C3 型 磷酸 烯醇 式丙 酮酸 羧化 酶基 因的 同 源率 分别 达 94.8 %、 93.2%、93.0%和 89.7 %。 推导的氨基酸序列中 C 末端第 771 位氨 基酸是丙氨 酸(A), 表 明是一个 C3 型基因 。 与 其他植 物几种不同形式 PEPCase 进行的多重序列比对与系统进 化分析 结果也 证实 , 此基因 的核苷 酸序列 及其编 码的氨 基酸序 列与所有参与对比的 C3 型 序列的同源性均远远高于与 C4 型的同源性 。 与玉米 、高粱 C3-2 型 PEPCase 的同源性 分别高达 96.5%、96.4%, 与高粱 、玉 米的 C3-1 型 PEPCase 的同 源性 分 别为 84.3 %、83.8%, 而 与 谷子 、玉米 、甘蔗 和 高粱 的 C4 型 PEPCase 的一致性相对较低 , 分别为 82.2%、79.1 %、77.1 %和 76.6 %。 因此 进一步 推论新克 隆的 稗草 ppc 基 因属 于 C3-2 型 。 对其编码的蛋白序列进行了结构域 、活性位点和功能位点预测 。
基金项目 :国家重点基础研究和发展规划(973)项目 :作物高效抗旱的分子生物学及遗传学基础(2003CB114300);作物 抗旱的遗传学基 础 (2003CB114301)。 国家研究与开发专项(863):优质 、抗逆转基因新品种(系)的选育与转基因技术创新研究(JY03-B-11)。
作者简介 :张桂芳 , 女 , 博士 , 作物生理专业 。 ＊通讯作者 :赵明 , 男 , 博士 , 作物栽培专业 。Tel :010-68918752. Received(收稿日期):2004-10-20 , Accepted(接受日期):2005-01-18.
取光 照 4 h 后 的 稗 草 绿 叶 , 基 本 参 照 Trizol (Gibeco 公司)说明书方法提取总 RNA 。 cDNA 合成 反应 参 照 试 剂 盒 ImProm-ⅡTM Reverse Transcriptase (Promega 公司)程序 。 1.3 PCR 引物的设计与 PCR 合成
关键词 :稗草 ;磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 ;基因克隆与分析 中图分类号 :S451
Cloning and Characterization of Phosphoenolpyruvate Carboxylase Gene from
Echinochloa crusgalli
ZHANG Gui-Fang1, 3 , ZHAO Ming2, ＊ , DING Zai-Song2 , ZHANG Li1 , XIAO Jun-Tao1
PCR 产物经 1.0 %琼脂糖凝胶电 泳检查后 , 切 下目标带 , 用 PCR 产物纯化试剂盒(北京博大泰克 公司产 品)回收 DNA , 回收 的 PCR 产物与 pUCm-T
vector(上海 Sangon 公司)连接 。 1.5 测序及序列分析
第 31 卷 第 10 期 2005 年 10 月 1365～ 1369 页
作 物 学 报 ACTA AGRONOMICA SINICA
Vol.31, No.10 pp.1365 -1369 Oct., 2005
稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因的克隆与分析