双相电泳简易操作指南

目录

第一章样品制备 2

1.1 一般性原则 2

1.2 样品制备程序 3 1.

2.1 培养细胞样品处理方法 3

1.2.2 组织样品处理方法 3

1.2.3文献报道较多的裂解液配方 4

第二章第一向等电聚焦（IEF） 7

2.1 IPG胶条的水化和电泳 7

2.1.1 仪器 7

2.1.2 试剂 7

2.1.3 实验步骤 7

2.2 IPG胶条的平衡 9

2.2.1 仪器 10

2.2.2 试剂 10

2.2.3 实验步骤 10

第三章第二向SDS电泳 12

3.1 垂直SDS-PAGE 12

3.1.1 溶液 12

3.1.2 灌胶步骤 12

3.1.3 电泳步骤 14

第四章 2-DE胶蛋白质点的检测 15

4.1 考马斯亮兰染色 15

4.1.1 经典的考马斯亮兰染色程序 15

4.1.2 Neuhoff胶体考染法 15

4.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法 16

4.2 硝酸银染色 16

Appendix I Troubleshooting 18

Appendix II Solutions 23

2DE分析流程：

样品制备（Sample preparation）

固相pH梯度胶条的水化（IPG strip rehydration）

第一向等电聚焦（IEF）

第一向胶条的平衡（ IPG strip equilibration）

第二向SDS电泳（SDS-PAGE）

检测染色（Detection/Staining）

第一章样品制备（Sample Preparation）

1.1一般性原则：

样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响2-DE结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。

根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，早期常使用NP-40、TritonX-100等非离子去垢剂，近几年较多的改用如CHAPS与Zwittergent系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂（如EDTA、PMSF or Protease inhibitor cocktails）以及核酸酶。

样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG胶条；这样都会造成2-DE的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。

核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防

止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。

因此，处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。

1.2样品制备程序：

1.2.1培养细胞（culture cell）样品处理方法：

培养动物组织细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接加入裂解缓冲液（Lysis buffer）抽提总蛋白。裂解缓冲液有多种配方，本实验室主要采用如下成份：

(A) 7M Urea，2M Thiourea，4％（w/v）CHAPS，40mM Tris-Base，40mM DTT，2％ Pharmalyte pH 3-10.

其他常用的裂解缓冲液如下：

(B) 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3-10, 1%(w/v) DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor;

(C) 加入0.3-1% SDS在95o C煮样品5mins，冷却后加入至少5倍体积的（A）或（B）裂解液。

总蛋白抽提程序：

（1）培养细胞的收集；

（2）用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞3次（室温，1000g，各2min）；（3）将细胞分装到1.5ml Eppendof管中，吸干残留的PBS；

（4）加入裂解缓冲液（1.5x106个细胞大约加入100µL裂解液），在室温振荡1h，使其充分溶解；

（5）4o C，40,000g，离心1h；

（6）吸取上清并用Brandford法定量蛋白，然后分装至Eppendof管里保存在-78o C备用。

1.2.2组织样品处理方法：

对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言，同样没有一种通用的程序。但遵循的原则基本相同。下面列出一种对植物树叶总蛋白的方法。

三氯醋酸－丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation）提取植物树叶总蛋白程序：

（1）在液氮中研碎叶片；

（2）悬浮于含10％三氯醋酸（TCA）和0.07%β-巯基乙醇(可用DTT