亲和层析法纯化胰蛋白酶培训课件

耐沉淀剂: 在10%的TCA的溶液中不发生沉淀.
1.3等电点性质
等电点: pI在3.9-4.5之间
溶液中的状态: 在pH3.0的溶液中稳定, 在pH8.0的溶液中
容易分解
鸡卵粘蛋白在10%的TCA不同pH值的溶液中的溶解状态
见表1。
亲和层析法纯化胰蛋白酶
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表1，鸡卵粘蛋白在10%TCA溶液中的溶解度
亲和层析法纯化胰蛋白酶
本实验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目的，
从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高
的胰蛋白酶。围绕亲和层析实验所涉及的蛋白质和酶基本
性质及相关技术进行综合训练。其中主要包括亲和层析介
质配基的制备，亲和介质的合成，蛋白质和酶的分离纯化，
酶活性的测定等内容。
通过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备的基本原理
1鸡卵粘蛋白的基本性质
1.1鸡卵粘蛋白的组成
分子量: 28000Da
分子组成:
四个分子量相近的亚基组成糖蛋白
糖基部分:
D-甘露糖, D-半乳糖, 葡萄糖胺, 唾液酸
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1.2化学稳定性
耐热: 在80℃条件下,理化性质不发生改变
耐有机溶剂: 在50%的丙酮溶液中,能保持良好的溶解度
图1 Sephadex G-25分子筛层析分离图谱
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3.2 Cellulose离子交换柱层析分离
(1)溶胀：
称取20g DEAE-Cellulose放入500ml的烧杯中, 加入150ml
蒸馏水，在室温下溶胀24小时。
(2)装柱：
取一支20×3cm 的层析柱，将溶胀好的DEAE-
2.6离心：虹吸出部分上清，将沉淀部分转移到50ml离心 杯中，于3000 rpm离心15min。
2.7除残留丙酮：弃去上清液，将盛有沉淀的离心杯至于 真空干燥器中。抽去残留丙酮。（沉淀物的颜色由白变成 透明胶状物即可）
2.8溶解：加入25ml蒸馏水或20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲 液溶解，滤纸过滤，收集滤液，备用。
2.2离心： 转移50毫升离心杯中,于3000rpm 离心15min。
2.3过滤： 倾出上清液，滤纸过滤，滤去上浮脂类物质和不溶物
2.4调pH值： 用1mol/L HCl 将溶亲液和层精析法确纯化调胰蛋至白酶pH3.5。量取体积。10
2.5丙酮沉淀：缓缓加入三倍体积预冷的丙酮，搅匀，用 塑料薄膜封严，放置冰箱内静止4小时。
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1. 3实验流程
鸡蛋清
Spharose 4B
猪胰脏
↓
↓
↓
提取
↓ 分离纯化
活化 ↓
提取 ↓
↓ 纯卵粘蛋白(CHOM) →←活化Spharose 4B 胰蛋白酶原粗提液
↓ 偶联
↓ 激活
↓
↓
CHOM-Spharose 4B →← 胰蛋白酶提取液
↓ 亲和层析
↓ 酶促动力学 ← 纯胰蛋白酶 → 酶活性测定
装柱，自然沉降。
(3) 处理：
用2倍柱床体积的0.5mol/L NaCl 溶液洗柱，2倍体积的
蒸馏水洗去残留的NaCl亲。和层析法纯化胰蛋白酶
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(4)平衡： 用20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，流速控制在1.0-
1.5 ml/min。紫外检测仪检测柱内平衡状态，直到仪器绘 出稳定的基线。
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3鸡卵粘蛋白的分离纯化
3.1 Sephadex G-25 柱脱盐
(1)溶胀：
称取15g Sephadex G-25放入500ml的烧杯中, 加入200ml
蒸馏水，在室温下溶胀24小时或在沸水浴中溶胀2小时。
(2)装柱：
取一支30×3cm 的层析柱，将溶胀好的Sephadex G-25
↓
亲酶和层蛋析白法含纯化量胰测蛋白定酶
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1. 4要求掌握的技术
柱层析技术
Sephadex G-25 分子筛层析
DEAE-Cellulose 离子交换层析
CHOM –Sepharose 4B 亲和层析
蛋白质提取技术
10%TCA 提取鸡卵粘蛋白
3.5%乙酸,pH 3.0提取胰蛋白酶原
蛋白含量测定技术
消光系数法测定胰蛋白酶含量
溶液pH 值
等于3.5
鸡卵粘蛋白 沉淀5% 溶解95%
鸡卵清蛋白 沉淀95% 溶解5%
低于3.5 沉淀↑
溶解↓
沉淀↑
溶解↓
高于3.5 沉淀↓
溶解↑
沉淀↓
溶解↑
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1. 2.鸡卵粘蛋白的提取 2.1提取： 每组发给50毫升的鸡卵清加入一定体积的10% pH1.15
TCA溶液(轻轻搅拌一边搅拌一边加入),搅匀后用pH试纸检 查pH值,待pH稳定在3.5± 0.2后放置4℃冰箱过夜.
1.0ml/min。紫外检测仪检测柱内平衡状态，直到仪器绘出 稳定的基线。
(5)上样： 将经Sephadex G-25柱脱盐的卵粘蛋白溶液上样ຫໍສະໝຸດ Baidu用
Cellulose装柱，自然沉降。
(3) 再生：
用200ml 0.5mol/L NaCl –0.5mol/L NaOH 混合溶液洗柱，
再用蒸馏水洗至流出液的pH值达到pH8.0。用200ml
0.5mol/L HCl溶液洗柱，再用蒸馏水洗至流出液的pH值达
到pH6.0。
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(4) 平衡： 用20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，流速控制在
消光系数法测亲和定层析鸡法纯卵化胰粘蛋白蛋酶 白含量
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生物活性测定 胰蛋白酶比活性测定 鸡卵粘蛋白抑制活性测定
亲和介质合成技术 载体-Sepharose 4B的前处理 载体 -Sepharose 4B的活化 活化载体-Sepharose 4B的偶联
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第二部分 实验方法
实验一 鸡卵粘蛋白的分离纯化
和操作，学习如何进行实验设计，掌握实验过程中的关键
环节，对实验中出现的问题进行科学的分析。使学生在学
习实验技术的同时，自觉培养分析问题和解决问题能力。
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2实验目的方法 掌握蛋白质分离纯化的基本原理与操作技术 掌握亲和层析的基本原理及亲和介质合成技术 掌握胰蛋白酶活性及抑制活性测定的原理和方法 掌握消光系数法测定蛋白质的原理及计算方法
(5)上样： 将柱内的缓冲液液面流至于胶面相切，取20ml鸡卵粘蛋 白提取液上样，待样液液面流至于胶面相切，加入2-3ml 缓冲液冲洗层析柱内壁，待溶液液面流至于胶面相切，然 后加入缓冲液距胶面高度约2-3cm，以同样的流速洗脱。 (6)收集：
在检测仪上观察到开亲始和层出析法现纯化峰胰蛋时白酶进行收集。见图1 13