亲和层析法纯化胰蛋白酶培训课件
实验报告亲和层析法纯化胰蛋白酶
亲和层析法纯化胰蛋白酶一. 实验目的1.理解亲和层析法的基本原理, 并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；2.掌握利用紫外可见分光光度计测定酶活性和抑制酶活性的原理和方法。
二. 实验原理亲和层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。
这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。
许多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性。
这种分子之间的结合能力做亲和力。
亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。
所以有人称为“生物专一吸附技术”。
在实际工作中, 只要把被识别的分子, 称为配基（Ligand）, 在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（如Sepharose4B）制成亲和吸附剂, 然后装柱。
再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子, 这时绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留, 只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。
当所有的杂质从柱上流走后, 再改变洗脱条件, 使结合在配基上的物质解离下来。
这样, 原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。
本实验为了纯化胰蛋白酶, 采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂。
鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂, 对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用, 但不抑制糜蛋白酶。
在pH=7-8的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合, 而在pH=2-3时, 又能被解离下来。
采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从粗提液中通过一次亲和层析直接获得高纯度的胰蛋白酶制品, 比用经典分离纯化方法简便得多。
纯化效率可达到10-20倍以上。
1.三. 实验方法步骤2.鸡卵粘蛋白的制备取蛋清60ml, 加入等体积的三氯乙酸丙酮溶液（丙酮: 三氯乙酸=40:60）后, 出现大量白色沉淀, 搅匀后室温静置4h以上, 待清蛋白完全沉淀, 3000rpm离心10min, 弃去沉淀, 47ml上清液倒入250ml锥形瓶并用塑料薄膜封好, 置于冰箱中冰浴片刻, 缓慢加入3倍体积(141ml)的预冷丙酮, 搅匀后冰浴4h直到出现沉淀,用真空泵抽去部分上清液, 剩余部分的部分沉淀和上清液全部转移至离心管中, 以3000rpm下离心15min, 弃上清液。
《亲和层析》PPT课件
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5. 多孔玻璃珠(商品为Bio-Glass)
• 它的化学与物理稳定性较好，机械强度高，不但 能抵御酶及微生物的作用，还能耐受高温灭菌和 较剧烈的反应条件。
• 缺点是亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质 有非特异性吸附，而且可供连接的化学活性基团 也少。
• 为了克服上述缺点，作载体用的市售Bio-Glass 的商品都已事先连接了氨烷基(烷基胺)。
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OH
O
偶联
OH
活化
gel
+ CNBr
gel
C NH + RNH2
gel
OH
⑤ 载体应具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸
附的大分子自由通过精。选ppt
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（二）常用载体
• 纤维素 • 琼脂糖凝胶 √ • 聚丙烯酰胺凝胶 √ • 葡聚糖凝胶 • 多孔玻璃珠 √
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1. 纤维素
• 它是自然界中数量最大的大分子生物材料， 取材十分方便。
• 但由于纤维素结构紧密、均一性差，不利 于大分子的渗入。活化后因带有电荷，非 特异性吸附力较强，加上空间位阻等原因， 其应用不如凝胶载体广泛。
• 例如，Sepharose 4B的分子量排阻极限达上百 万，便于大分子通过；载体几乎没有带电基团， 非专一性吸附少。
• Sepharose CL是用1,3-二溴丙烷处理的交联琼脂 糖，它的稳定性明显增加，能在pH 3~14中应用。
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3. 聚丙烯酰胺凝胶
• 是由丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺经催化聚合形成 的人工合成载体，是具有网状三维空间结构的凝 胶型高聚物，商品名为Biogel P。
• 将制备的亲和吸附剂装柱平衡， • 当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生
生化实验讲义：实验十一亲和层析最后
实验十一亲和层析纯化胰蛋白酶一、引言前面我们所学的凝胶过滤法、离子交换法以及电泳等一系列分离纯化生物大分子的手段，比起早期采用的盐析法，有机溶剂及等电点沉淀法等，分离效果要好得多。
但是，这些方法中，或是利用生物大分子在一定条件下不同的溶解度、电荷分布、总电荷的不同，或是依据其分子的大小和形状的不同。
一句话，多是利用生物分子间物理和化学性质的差异来进行分离纯化的。
由于这些方法的特异性比较低，加之待分离物质之间的物化性质差异较小，常常要综合不同的分离方法。
经过许多步骤才能使生物分子达到一定的纯度。
这样既费时间，又费试剂，有时最后产品还不能令人满意。
另外，有些生物大分子，往往在生物组织或发酵液中的含量很低，相对地说杂质很多，特别是一些具有生物活性的分子，往往由于分离纯化的步骤很多，时间过长，造成破坏以致失活，产率很低。
这就促使人们去寻求新的方法来解决存在的问题。
亲和层析法是近十多年来迅速地发展并广泛被采用来分离纯化生物大分子的一种十分有效的方法。
它具有分离快速，纯化效率高。
特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。
有时一次被分离物质的纯度可提高几倍，十几倍甚至几百倍。
因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。
二、实验目的与要求1. 理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；2. 理解和掌握亲和层析实验操作技术；3. 学会一种测定蛋白水解酶活力及比活的方法。
三、基本原理简言之，亲的层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。
这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。
许多生物分子都有一种独特的生物学功能。
即它们都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。
如：酶和底物（包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物）的结合。
亲和层析法纯化胰蛋白酶
3鸡卵粘蛋白的分离纯化 鸡卵粘蛋白的分离纯化 3.1 Sephadex G-25 柱脱盐 (1)溶胀 溶胀： 溶胀 称取15g Sephadex G-25放入500ml的烧杯中, 加入200ml 蒸馏水，在室温下溶胀24小时或在沸水浴中溶胀2小时。 (2)装柱 装柱： 装柱 取一支30×3cm 的层析柱，将溶胀好的Sephadex G-25 装柱，自然沉降。 (3) 处理 处理： 用2倍柱床体积的0.5mol/L NaCl 溶液洗柱，2倍体积的 蒸馏水洗去残留的NaCl。
1.1环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基的偶联
↓活化
↓偶联
↓亲和结合
↓洗脱
1.2溴化氰活化载体 与蛋白质配基的偶联
2亲和介质合成 亲和介质合成 2.1琼脂糖凝胶层析介质(Sepharose 4B)的活化 2.1.1 琼脂糖凝胶层析介质的处理 称取10克琼脂糖凝胶层析介质，置于G-3玻璃烧结漏斗内， 用100ml 1.0mol/L NaCl溶液抽洗（少量多次），100ml 蒸 馏水抽洗，抽干后转移到100ml三角瓶中备用。
图2，鸡卵粘蛋白在 ，鸡卵粘蛋白在DEAE-Cellulose柱的分离 柱的分离
3.3透析及丙酮沉淀 透析及丙酮沉淀 (1) 透析： 透析： 将经DEAE-Cellulose柱分离的鸡卵粘蛋白转入透析袋内， 对蒸馏水透析，隔一段时间换一次水，直到渗出液经 BaCl2溶液检查无氯离子存在，即可。 (2) 调pH值： 值 将透析好的鸡卵粘蛋白溶液，用0.1mol/L HCl 精确调 至pH4.0（最好一次调成功），量体积。 (3)丙酮沉淀： 丙酮沉淀： 丙酮沉淀 加入3倍体积的预冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，在 冰箱内静止4小时以上或过夜。
本实验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目的， 从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高 的胰蛋白酶。围绕亲和层析实验所涉及的蛋白质和酶基本 性质及相关技术进行综合训练。其中主要包括亲和层析介 质配基的制备，亲和介质的合成，蛋白质和酶的分离纯化， 酶活性的测定等内容。 通过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备的基本原理 和操作，学习如何进行实验设计，掌握实验过程中的关键 环节，对实验中出现的问题进行科学的分析。使学生在学 习实验技术的同时，自觉培养分析问题和解决问题能力。
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
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1 内容摘要 亲和层析包含了一整套复杂底物及其配体与生物大分
子之间相互作用时所形成独特生物学特征。在亲和结合过 程中包括到疏水力、静电力、范德华力及空间阻力等原因 影响。
亲和层析概念能够了解为配基以共价键形式与水不溶 性固体载体共价结合， 形成含有高度专一性亲和吸附剂。 以该介质为填料填充亲和层析柱，从复杂混合物中有针对 性分离某一个成份。
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
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1. 3试验流程
鸡蛋清
Spharose 4B
猪胰脏
↓
↓
↓
提取
↓ 分离纯化
活化 ↓
提取 ↓
↓ 纯卵粘蛋白(CHOM) →←活化Spharose 4B 胰蛋白酶原粗提液
↓ 偶联
↓ 激活
↓
↓
CHOM-Spharose 4B →← 胰蛋白酶提取液
↓ 亲和层析
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
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本试验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目标，
从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高
胰蛋白酶。围绕亲和层析试验所包括蛋白质和酶基础性质
及相关技术进行综合训练。其中主要包含亲和层析介质配
基制备，亲和介质合成，蛋白质和酶分离纯化，酶活性测
定等内容。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
经过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备基础原理和
操作，学习怎样进行试验设计，掌握试验过程中关键步骤，
对试验中出现问题进行科学分析。使学生在学习试验技术
同时，自觉培养分析问题和处理问题能力。
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
实训 亲和色谱纯化胰蛋白酶
实训亲和色谱纯化胰蛋白酶［任务描述］亲和色谱主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。
鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，在pH7.0～8.0的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在pH2.0～3.0时，又能被解离下来。
因此，采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和色谱直接获得活力大于10000BAEE单位/毫克蛋白胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多，纯化效率可达到10～20倍以上。
本次实训任务为纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂-鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂，从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。
［任务实施］一、准备工作1.建立工作小组，制定工作计划，确定具体任务，任务分工到个人，并记录到工作表。
2.收集亲和色谱纯化胰蛋白酶工作中必须信息，掌握相关知识及操作要点，与指导教师共同确定出一种最佳的工作方案。
3.完成任务单中实际操作前的各项准备工作。
（1）材料准备鸡蛋清，新鲜猪胰脏。
（2）试剂与仪器试剂：丙酮、三氯乙酸、HCl、NaOH、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、氯代环氧丙烷、乙腈、甲酸、Tris、CaCl2、KCl、DEAE-纤维素、Sepharose-4B、乙酸二氧六环二甲基亚砜。
主要贮存溶液：①鸡卵粘蛋白色谱液（1L）。
0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液。
②DEAE-纤维素处理液。
0.5mol/L HCl 300mL和0.5mol/L NaOH、0.5mol/L NaCl 各300mL。
③卵粘蛋白洗脱液。
0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液含0.3mol/L NaCl，150mL。
④标准胰蛋白酶溶液。
结晶胰蛋白酶以0.001mol/L HCl 配制成1mg/mL 。
⑤亲和色谱柱平衡液。
含0.5mol/LKCl 、0.05mol/L CaCl 2的0.1mol/L pH8.0 Tris-HCl 缓冲液500mL （配1000mL ：12.1g Tris ，37.5g KCl ，5.6g CaCl 2）。
亲和层析蛋白纯化
亲和层析蛋白纯化
亲和层析蛋白纯化是一种常用的蛋白质纯化方法，利用目标蛋白与具有亲和作用的亲和基团结合，将目标蛋白从复杂的混合物中分离出来。
亲和基团通常是与目标蛋白有特异结合的小分子，如金属离子、抗体、亲和标签等。
在亲和层析过程中，将这种具有亲和基团的亲和剂固定在某种固相材料上，如琼脂糖或磁珠等。
将混合物加入亲和剂固定的层析柱中，目标蛋白与亲和基团结合，其他非特异结合的成分则通过柱子流过。
随后，通过改变缓冲条件或添加竞争性亲和剂，将目标蛋白从亲和基团上进行洗脱，最终得到纯化后的目标蛋白。
亲和层析蛋白纯化方法简单易行，纯化效果好，但也有一些局限性，如亲和基团的选择对纯化效果有很大影响，目标蛋白与亲和基团的结合力可能不够牢固，而且纯化过程中可能会有非特异结合的蛋白质被误纯化。
因此，在选择亲和层析方法时需要根据目标蛋白的特性及需求进行合理选择。
1-亲和分离纯化胰酶课件
6-2、测定酶活力试剂与配制
6-2-1、试剂
（1）、Nα-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐 (BAPNA)
（2）、三乙醇胺
（3）、氯 化 钙
（4）、硫 （5）、盐 酸 酸
6-2-2、 试剂的配制
(1）、底物（B）的配制 [ mg/ml ] ： （2）、缓冲溶液（S）[TEA-2]： （3）、0.5 mol/L H2SO4溶液的配制： （4）、样品溶液的配制： 直接按照测定步骤，分别吸取自动部分收集器收集的各管样 品原液。
（1）、表1：酶活力的测定方法与结果表
试剂 / 管 号 缓 冲 液（ml）
0
1
2
3
4
5
6
2.0 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8
样 品 溶 液 (ml)
1.4 1.2 1
A 405 nm
0.8 0.6 0.4 0.2 0 -0.2 0 2 4 6 8 管 号
胰蛋白酶分离效果图 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 -0.2 0 2 4 6 8
管 号
吸光度[280nm]
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 10 -0.2
蛋白质洗脱峰
胰蛋白酶活力峰
亲和层析
分离纯化胰蛋白酶
一
实验原理
我们都知道酶和它的底物或竞争性抑制剂，特异性抗原和抗体， 激素及其受体等具有专一性很强的亲和能力。亲和层析是利用生物分 子间所特有的专一亲和力而设计的一种层析技术。 亲和层析就是在一种载体上，用化学偶联的方法，接上特定的配 基作为固相支持物，然后装柱，并在适当的条件下当样品通过柱子时， 其中与配基具有特异性亲和力的组分被吸附在柱上，然后通过改变洗 脱条件，使得该组分被洗脱分离开来。 亲和层析是具有快速、高效等特点，对于那些分离流程长、难度 大、浓度低、杂质多、采用常规方法难以进行分离的生物分子来说， 亲和层析显示出其独特的优越性。 通过亲和层析，被分离物质的纯度有时一次即可高达数百倍，活 性回收率纯度也非常之高。亲和层析先决条件是，不同的分离对象需 要选择接有专一性配基的固相化亲和载体，有关载体的活化、接臂、 偶联，详见相关一书。
实验2 亲和层析法纯化胰蛋白酶
猪胰蛋白酶的亲和层析制备及测定内容提要利用亲和层析（affinity of chromatography）技术纯化胰蛋白酶是一个综合性实验。
首先从鸡卵清中分离胰蛋白酶的天然抑制剂——鸡卵粘蛋白，并以此为配基，偶联到琼脂糖凝胶（sepharose-4B）上，制成鸡卵粘蛋白的亲和吸附剂，然后通过亲和层析方法从猪胰脏的粗提液中纯化猪胰蛋白酶。
本实验要求掌握亲和层析的原理和方法；凝胶层析和离子交换层析技术；酶活性测定方法和抑制活性测定的原理和方法。
原理亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多醣类等；也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。
近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速。
对于那些分离流程长、浓度低、杂质多、采用常规方法难以进行分离的生物分子来说，亲和层析技术就显示出其独特的优越性。
亲和层析在分离、纯化的效率上可以说是最佳的方法。
亲和层析是由吸附层析发展起来的，主要是根据生物分子与特定的固相化配基（ligand）之间的亲和力而使生物分子得到分离的。
所谓亲和力是指：范德华力、疏水力、静电力、氢键等，它存在于某些分子内部，也是维系着某些分子之间的结合力。
酶与底物、酶与抑制剂、抗原与抗体、激素与激素受体等彼此分子之间的结合力就是亲和力。
亲和力是很弱的，只有在彼此分子挨得很近的条件下才显示出来。
所以要求两分子之间的结合具有高度特异的分子基础，即分子间的互补结构。
利用这种具有亲和力的生物分子间可逆的结合和解离的原理发展起来的层析，就称为亲和层析。
它相对于建立在物理化学原理（如分子颗粒大小、分子带电荷状况等）的分离方法而言，可称为“生物专一吸附”的层析分离方法。
在亲和层析过程中，被分离的生物分子在一定的条件下，有选择性地，即高度特异地被结合到共价偶联的不溶性载体的配基亲和吸附剂上，改变原有条件，如选用竞争性抑制剂、底物、辅助因子或采用不同pH的缓冲液、高浓度盐、变性剂等，又可有选择性地从亲和吸附上把被分离物质洗脱下来。
实验报告亲和层析法纯化胰蛋白酶
亲和层析法纯化胰蛋白酶一．实验目的1.理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；2.掌握利用紫外可见分光光度计测定酶活性和抑制酶活性的原理和方法。
二．实验原理亲和层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。
这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。
许多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性。
这种分子之间的结合能力做亲和力。
亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。
所以有人称为“生物专一吸附技术”。
在实际工作中，只要把被识别的分子，称为配基（Ligand），在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（如Sepharose4B）制成亲和吸附剂，然后装柱。
再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子，这时绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留，只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。
当所有的杂质从柱上流走后，再改变洗脱条件，使结合在配基上的物质解离下来。
这样，原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。
本实验为了纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂。
鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。
在pH=7-8的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在pH=2-3时，又能被解离下来。
采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从粗提液中通过一次亲和层析直接获得高纯度的胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多。
纯化效率可达到10-20倍以上。
三．实验方法步骤1.鸡卵粘蛋白的制备取蛋清60ml，加入等体积的三氯乙酸丙酮溶液（丙酮：三氯乙酸=40:60）后，出现大量白色沉淀，搅匀后室温静置4h以上，待清蛋白完全沉淀，3000rpm 离心10min，弃去沉淀，47ml上清液倒入250ml锥形瓶并用塑料薄膜封好，置于冰箱中冰浴片刻，缓慢加入3倍体积(141ml)的预冷丙酮，搅匀后冰浴4h直到出现沉淀,用真空泵抽去部分上清液，剩余部分的部分沉淀和上清液全部转移至离心管中，以3000rpm下离心15min，弃上清液。
亲和层析法纯化胰蛋白酶
亲和层析法纯化胰蛋白酶实验一鸡卵粘蛋白的分离纯化1鸡卵粘蛋白的基本性质1.1鸡卵粘蛋白的组成分子量: 28000Da分子组成:四个分子量相近的亚基组成糖蛋白糖基部分:D-甘露糖, D-半乳糖, 葡萄糖胺, 唾液酸1. 2.鸡卵粘蛋白的提取2.1提取：每组发给50毫升的鸡卵清加入一定体积的10% pH1.15 TCA溶液(轻轻搅拌一边搅拌一边加入),搅匀后用pH试纸检查pH值,待pH稳定在3.5± 0.2后放置4℃冰箱过夜.2.2离心：转移50毫升离心杯中,于3000rpm 离心15min。
2.3过滤：倾出上清液，滤纸过滤，滤去上浮脂类物质和不溶物2.4调pH值：用1mol/L HCl 将溶液精确调至pH3.5。
量取体积。
2.5丙酮沉淀：缓缓加入三倍体积预冷的丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，放置冰箱内静止4小时。
2.6离心：虹吸出部分上清，将沉淀部分转移到50ml离心杯中，于3000 rpm离心15min。
2.7除残留丙酮：弃去上清液，将盛有沉淀的离心杯至于真空干燥器中。
抽去残留丙酮。
（沉淀物的颜色由白变成透明胶状物即可）2.8溶解：加入25ml蒸馏水或20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液溶解，滤纸过滤，收集滤液，备用。
3鸡卵粘蛋白的分离纯化3.1 Sephadex G-25 柱脱盐(1)溶胀：称取15g Sephadex G-25放入500ml的烧杯中, 加入200ml 蒸馏水，在室温下溶胀24小时或在沸水浴中溶胀2小时。
(2)装柱：取一支30×3cm 的层析柱，将溶胀好的Sephadex G-25装柱，自然沉降。
(3) 处理：用2倍柱床体积的0.5mol/L NaCl 溶液洗柱，2倍体积的蒸馏水洗去残留的NaCl。
(4)平衡：用20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，流速控制在1.0-1.5 ml/min。
紫外检测仪检测柱内平衡状态，直到仪器绘出稳定的基线。
(5)上样：将柱内的缓冲液液面流至于胶面相切，取20ml鸡卵粘蛋白提取液上样，待样液液面流至于胶面相切，加入2-3ml缓冲液冲洗层析柱内壁，待溶液液面流至于胶面相切，然后加入缓冲液距胶面高度约2-3cm，以同样的流速洗脱。
亲和层析优秀课件
第一节 亲和层析概述
• 利用生物分子间专一的亲和力而进行分离 的一种层析技术
• 配体固定化的问题 • 在生物分离中有广泛的应用
历史
• 1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉 酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的 实例。
• 但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配 体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。
• 目前主要用于分离与核酸有关的物质，如用寡聚 脱氧胸腺核苷酸纤维素作固定相分离细胞提取液 中的mRNA。
• 市售纤维素商品为无定形微纤维、微晶纤维素以 及珠状纤维素。
2. 琼脂糖凝胶
• 是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相互结合的链 状多糖，用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。
• 琼脂糖浓度有2%、4%、6%几种，相应的商品称 为Sepharose2B、4B和6B(Pharmacia)和 Ultrogels A-2，A-4，A-6(LKB)。这类载体能使 吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能 基团，结构疏松孔径大，流速快。
• 用免疫层析柱进行各种类型的免疫检测被称为免 疫检测法，特别适用于检测含量低微的样品[4]， 免疫检测法利用被标记的抗体或模拟分析物来进 行间接的被分析物的分析。常用标记如酶标记、 荧光标记、化学荧光等。
固定化金属离子亲和层析
• 是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸 附蛋白质的分离系统。
• 目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组 氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚 基，十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合， 这是IMAC用于蛋白质分离纯化的根据[5,6]。
• 1967年Axen等用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋 白质的方法，并成功地制备了固定化酶。此技术 的出现，解决了配体固定化的问题，使得亲和层 析技术得到了快速的发展。
亲和层析法纯化胰蛋白酶
亲和层析法纯化胰蛋白酶1.3实验流程鸡蛋清Spharose4B猪胰脏↓↓↓提取↓活化提取分离纯化↓↓↓纯卵粘蛋白(CHOM) →←活化Spharose4B胰蛋白酶原粗提液↓↓偶联激活↓↓CHOM-Spharose4B→←胰蛋白酶提取液↓亲和层析↓酶促动力学←纯胰蛋白酶→酶活性测定↓酶蛋白含量测定实验一鸡卵粘蛋白的分离纯化1鸡卵粘蛋白的基本性质1.1鸡卵粘蛋白的组成分子量: 28000Da分子组成:四个分子量相近的亚基组成糖蛋白糖基部分:D-甘露糖, D-半乳糖, 葡萄糖胺, 唾液酸1. 2.鸡卵粘蛋白的提取2.1提取：每组发给50毫升的鸡卵清加入一定体积的10% pH1.15 TCA溶液(轻轻搅拌一边搅拌一边加入),搅匀后用pH试纸检查pH值,待pH稳定在3.5±0.2后放置4℃冰箱过夜.2.2离心：转移50毫升离心杯中,于3000rpm 离心15min。
2.3过滤：倾出上清液，滤纸过滤，滤去上浮脂类物质和不溶物2.4调pH值：用1mol/L HCl 将溶液精确调至pH3.5。
量取体积。
2.5丙酮沉淀：缓缓加入三倍体积预冷的丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，放置冰箱内静止4小时。
2.6离心：虹吸出部分上清，将沉淀部分转移到50ml离心杯中，于3000 rpm离心15min。
2.7除残留丙酮：弃去上清液，将盛有沉淀的离心杯至于真空干燥器中。
抽去残留丙酮。
（沉淀物的颜色由白变成透明胶状物即可）2.8溶解：加入25ml蒸馏水或20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液溶解，滤纸过滤，收集滤液，备用。
3鸡卵粘蛋白的分离纯化3.1 Sephadex G-25 柱脱盐(1)溶胀：称取15g Sephadex G-25放入500ml的烧杯中, 加入200ml 蒸馏水，在室温下溶胀24小时或在沸水浴中溶胀2小时。
(2)装柱：取一支30×3cm 的层析柱，将溶胀好的Sephadex G-25装柱，自然沉降。
《亲和层析》幻灯片
固定化金属离子亲和层析
• 1975年，Poroth首次提出“固定化金属螯 合亲和层析(Immobilized MetalChelated Affinity Chromatography)〞 的概念，首次成功地在琼脂糖上偶联了螯 合剂亚氨基二乙酸(IDA)钠。IDA的钠盐与 金属离子如Cu++螯合后，可与生物分子如 蛋白质结合，不同的蛋白质与金属离子结 合力不同，从而将蛋白质别离。
• 染料配体与很多蛋白以及酶的活性位点相互作用， 以模仿这些生物分子的底物、辅助因子或结合剂 的形式进展。
四、亲和层析载体
载体在亲和层析中的作用：使配体固定化、 提供结合的空间环境
〔一〕亲和层析对载体〔基质〕的要求 极低的非特异吸附性 大量的化学基团能被有效的活化，而且容易和配体
结合 有较好的理化稳定性和生物惰性 有高度的水不溶性和亲水性。载体的亲水性往往是
亲和力
• 生物分子间存在很多特异性的相互作用， 如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑 制剂、激素－受体等等，它们之间都能够 专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲 和力。
固相化 (Immobilise)
配体Ligand:亲和层析中能被某一生 物大分子识别和可逆结合的生物专一性物 质。即被固定在基质上的分子称为配体。
• 特异性配体：一般是指只与单一或很少种类的蛋 白质等生物大分子结合的配体。配体一般为复杂 的生命大分子物质〔如抗体、受体和酶的类似底 物等〕，它具有较强的吸附选择性和较大的结合 力。
• 通用性配体：一般是指特异性不是很强，能和某 一类的蛋白质等生物大分子结合的配体。配体一 般为简单的小分子物质〔如金属、染料、以及氨 基酸等〕，它本钱低廉，具有较高的吸附容量。
《亲和层析》幻灯片
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1鸡卵粘蛋白的基本性质
1.1鸡卵粘蛋白的组成
分子量: 28000Da
分子组成:
四个分子量相近的亚基组成糖蛋白
糖基部分:
D-甘露糖, D-半乳糖, 葡萄糖胺, 唾液酸
亲和层析法纯化胰蛋白酶
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1.2化学稳定性
耐热: 在80℃条件下,理化性质不发生改变
耐有机溶剂: 在50%的丙酮溶液中,能保持良好的溶解度
消光系数法测亲和定层析鸡法纯卵化胰粘蛋白蛋酶 白含量
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生物活性测定 胰蛋白酶比活性测定 鸡卵粘蛋白抑制活性测定
亲和介质合成技术 载体-Sepharose 4B的前处理 载体 -Sepharose 4B的活化 活化载体-Sepharose 4B的偶联
亲和层析法பைடு நூலகம்化胰蛋白酶
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第二部分 实验方法
实验一 鸡卵粘蛋白的分离纯化
2.2离心： 转移50毫升离心杯中,于3000rpm 离心15min。
2.3过滤： 倾出上清液，滤纸过滤，滤去上浮脂类物质和不溶物
2.4调pH值： 用1mol/L HCl 将溶亲液和层精析法确纯化调胰蛋至白酶pH3.5。量取体积。10
2.5丙酮沉淀：缓缓加入三倍体积预冷的丙酮，搅匀，用 塑料薄膜封严，放置冰箱内静止4小时。
耐沉淀剂: 在10%的TCA的溶液中不发生沉淀.
1.3等电点性质
等电点: pI在3.9-4.5之间
溶液中的状态: 在pH3.0的溶液中稳定, 在pH8.0的溶液中
容易分解
鸡卵粘蛋白在10%的TCA不同pH值的溶液中的溶解状态
见表1。
亲和层析法纯化胰蛋白酶
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表1，鸡卵粘蛋白在10%TCA溶液中的溶解度
亲和层析法纯化胰蛋白酶
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1. 3实验流程
鸡蛋清
Spharose 4B
猪胰脏
↓
↓
↓
提取
↓ 分离纯化
活化 ↓
提取 ↓
↓ 纯卵粘蛋白(CHOM) →←活化Spharose 4B 胰蛋白酶原粗提液
↓ 偶联
↓ 激活
↓
↓
CHOM-Spharose 4B →← 胰蛋白酶提取液
↓ 亲和层析
↓ 酶促动力学 ← 纯胰蛋白酶 → 酶活性测定
装柱，自然沉降。
(3) 处理：
用2倍柱床体积的0.5mol/L NaCl 溶液洗柱，2倍体积的
蒸馏水洗去残留的NaCl亲。和层析法纯化胰蛋白酶
12
(4)平衡： 用20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，流速控制在1.0-
1.5 ml/min。紫外检测仪检测柱内平衡状态，直到仪器绘 出稳定的基线。
图1 Sephadex G-25分子筛层析分离图谱
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3.2 Cellulose离子交换柱层析分离
(1)溶胀：
称取20g DEAE-Cellulose放入500ml的烧杯中, 加入150ml
蒸馏水，在室温下溶胀24小时。
(2)装柱：
取一支20×3cm 的层析柱，将溶胀好的DEAE-
和操作，学习如何进行实验设计，掌握实验过程中的关键
环节，对实验中出现的问题进行科学的分析。使学生在学
习实验技术的同时，自觉培养分析问题和解决问题能力。
亲和层析法纯化胰蛋白酶
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2实验目的方法 掌握蛋白质分离纯化的基本原理与操作技术 掌握亲和层析的基本原理及亲和介质合成技术 掌握胰蛋白酶活性及抑制活性测定的原理和方法 掌握消光系数法测定蛋白质的原理及计算方法
溶液pH 值
等于3.5
鸡卵粘蛋白 沉淀5% 溶解95%
鸡卵清蛋白 沉淀95% 溶解5%
低于3.5 沉淀↑
溶解↓
沉淀↑
溶解↓
高于3.5 沉淀↓
溶解↑
沉淀↓
溶解↑
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1. 2.鸡卵粘蛋白的提取 2.1提取： 每组发给50毫升的鸡卵清加入一定体积的10% pH1.15
TCA溶液(轻轻搅拌一边搅拌一边加入),搅匀后用pH试纸检 查pH值,待pH稳定在3.5± 0.2后放置4℃冰箱过夜.
亲和层析法纯化胰蛋白酶
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3鸡卵粘蛋白的分离纯化
3.1 Sephadex G-25 柱脱盐
(1)溶胀：
称取15g Sephadex G-25放入500ml的烧杯中, 加入200ml
蒸馏水，在室温下溶胀24小时或在沸水浴中溶胀2小时。
(2)装柱：
取一支30×3cm 的层析柱，将溶胀好的Sephadex G-25
1.0ml/min。紫外检测仪检测柱内平衡状态，直到仪器绘出 稳定的基线。
(5)上样： 将经Sephadex G-25柱脱盐的卵粘蛋白溶液上样，用
2.6离心：虹吸出部分上清，将沉淀部分转移到50ml离心 杯中，于3000 rpm离心15min。
2.7除残留丙酮：弃去上清液，将盛有沉淀的离心杯至于 真空干燥器中。抽去残留丙酮。（沉淀物的颜色由白变成 透明胶状物即可）
2.8溶解：加入25ml蒸馏水或20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲 液溶解，滤纸过滤，收集滤液，备用。
↓
亲酶和层蛋析白法含纯化量胰测蛋白定酶
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1. 4要求掌握的技术
柱层析技术
Sephadex G-25 分子筛层析
DEAE-Cellulose 离子交换层析
CHOM –Sepharose 4B 亲和层析
蛋白质提取技术
10%TCA 提取鸡卵粘蛋白
3.5%乙酸,pH 3.0提取胰蛋白酶原
蛋白含量测定技术
消光系数法测定胰蛋白酶含量
亲和层析法纯化胰蛋白酶
本实验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目的，
从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高
的胰蛋白酶。围绕亲和层析实验所涉及的蛋白质和酶基本
性质及相关技术进行综合训练。其中主要包括亲和层析介
质配基的制备，亲和介质的合成，蛋白质和酶的分离纯化，
酶活性的测定等内容。
通过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备的基本原理
Cellulose装柱，自然沉降。
(3) 再生：
用200ml 0.5mol/L NaCl –0.5mol/L NaOH 混合溶液洗柱，
再用蒸馏水洗至流出液的pH值达到pH8.0。用200ml
0.5mol/L HCl溶液洗柱，再用蒸馏水洗至流出液的pH值达
到pH6.0。
亲和层析法纯化胰蛋白酶
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(4) 平衡： 用20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，流速控制在
(5)上样： 将柱内的缓冲液液面流至于胶面相切，取20ml鸡卵粘蛋 白提取液上样，待样液液面流至于胶面相切，加入2-3ml 缓冲液冲洗层析柱内壁，待溶液液面流至于胶面相切，然 后加入缓冲液距胶面高度约2-3cm，以同样的流速洗脱。 (6)收集：
在检测仪上观察到开亲始和层出析法现纯化峰胰蛋时白酶进行收集。见图1 13