最新常规石蜡制片he染色技术幻灯片课件
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组织胚胎学研究方法和技术—石蜡切片与HE染色
结构清晰可辨的组织切片，石蜡切片术
是最常用的经典技术
02 石蜡切片术基本步骤
取材和固定 脱水和包埋 切片和染色 封片ห้องสมุดไป่ตู้
03 HE 染色
最常用的染色方法是苏木精和伊红染色法，简称HE 染色法
原理： 苏木精（Hematoxylin）-- 伊红（Eosin）
碱性染料
酸性染料
嗜碱性
将嗜碱性物质 （本身酸性）
构具有被碱性染料着色的性质称嗜碱性。
光镜技术— 石蜡切片术和HE染色
目录
CONTENT
01 光镜技术概述
02 石蜡切片术
03 HE染色
01 光镜技术概述
应用一般光学显微镜(简称光镜)观察是组织学研究的最基本方法 放大倍数可达1500，分辨率约为0.2μm 光镜下能被分辨的微细结构称光镜结构（LM） 组织学研究需要制备能使光线透过、微细
染成蓝色
中性
细胞核中的染色质、 细胞质中的核糖体
将嗜酸性物质 （本身碱性） 染成红色
嗜酸性
细胞质、膜性结构（线粒体、溶 酶体、滑面内质网）、细胞间质
脑垂体，H&E, x400
特殊染色法
镀银染色法
醛复红染色法
活体染色法
小结
1. 组织学最常见的研究方法是采用光镜观察。 2. 石蜡切片术是光镜观察时标本制备最常用的经典技术。 3. 组织切片常用的染色法是苏木精—伊红染色法，称HE染色。 4. 凡组织结构具有被酸性染料着色的性质称嗜酸性，凡组织结
是最常用的经典技术
02 石蜡切片术基本步骤
取材和固定 脱水和包埋 切片和染色 封片ห้องสมุดไป่ตู้
03 HE 染色
最常用的染色方法是苏木精和伊红染色法，简称HE 染色法
原理： 苏木精（Hematoxylin）-- 伊红（Eosin）
碱性染料
酸性染料
嗜碱性
将嗜碱性物质 （本身酸性）
构具有被碱性染料着色的性质称嗜碱性。
光镜技术— 石蜡切片术和HE染色
目录
CONTENT
01 光镜技术概述
02 石蜡切片术
03 HE染色
01 光镜技术概述
应用一般光学显微镜(简称光镜)观察是组织学研究的最基本方法 放大倍数可达1500，分辨率约为0.2μm 光镜下能被分辨的微细结构称光镜结构（LM） 组织学研究需要制备能使光线透过、微细
染成蓝色
中性
细胞核中的染色质、 细胞质中的核糖体
将嗜酸性物质 （本身碱性） 染成红色
嗜酸性
细胞质、膜性结构（线粒体、溶 酶体、滑面内质网）、细胞间质
脑垂体，H&E, x400
特殊染色法
镀银染色法
醛复红染色法
活体染色法
小结
1. 组织学最常见的研究方法是采用光镜观察。 2. 石蜡切片术是光镜观察时标本制备最常用的经典技术。 3. 组织切片常用的染色法是苏木精—伊红染色法，称HE染色。 4. 凡组织结构具有被酸性染料着色的性质称嗜酸性，凡组织结
常规病理检查重点PPT课件
Ⅱ类：氧化剂类：四氧化锇（奥酸），高锰酸钾，重铬 酸钾等。
Ⅲ类：蛋白变性类：甲醇，乙醇，醋酸等 Ⅳ类：其他：氯化汞，苦味酸等 。
2、按照成分分类：
单一固定液：如甲醛，酒精，醋酸，锇酸，丙酮等 混合固定液：中性甲醛，AF液等
组织固定
常用的固定方法
蒸汽固定法：甲醛或锇酸可产生蒸汽。用于保存可溶性 成分；小而薄的组织，冷冻干燥组织
脱水剂的种类和效果
--非石蜡溶剂的脱水剂：如乙醇和丙酮等，其组
织在脱水后必须再经二甲苯透明才能浸蜡。 --脱水兼石蜡溶剂的脱水剂：如正丁醇等组织在脱 水后即可直接浸蜡，不经过中间溶剂如二甲苯之类 的试剂。
组织处理
2、透明： 用化学试剂，通常为二甲苯将组织内的脱水剂置换出
来的过程称透明。 透明发挥了一个桥梁作用，透明剂可以与包埋剂和脱
片 3-氨丙基三已氧基硅烷（APES） 带电荷玻片或阳玻片
冰冻切片
常用于术中快速病理诊断 组织不经脱水，透明等步骤，对蛋白，脂肪，各种
酶保存好，合适做组织化学，免疫组化等染色，尤 其对不合适石蜡组织的抗体 组织会膨胀，细胞变大，出现与常规切片的一些差 异
常规HE染色
染色的意义和目的： 用染液对组织切片进行处理，使组织中的不
B5固定液
配制：储备液：氯化汞12g+醋酸钠2.5g+蒸馏水 200ml。使用前加2ml甲醛到20ml储备液中 常用于骨髓，淋巴结，脾和其他造血组织的固定。
组织固定注意事项
组织离体后尽早放入固定液中 固定液体的体积应大于标本的4~5倍，甚至20倍 固定的容器口要方便组织固定后取出 组织固定时间不宜太长，一般不超过72小时，固定
Ｚenker氏液固定后，细胞核和细胞浆染色较为 清晰，特别显示骨骼肌的横纹
Ⅲ类：蛋白变性类：甲醇，乙醇，醋酸等 Ⅳ类：其他：氯化汞，苦味酸等 。
2、按照成分分类：
单一固定液：如甲醛，酒精，醋酸，锇酸，丙酮等 混合固定液：中性甲醛，AF液等
组织固定
常用的固定方法
蒸汽固定法：甲醛或锇酸可产生蒸汽。用于保存可溶性 成分；小而薄的组织，冷冻干燥组织
脱水剂的种类和效果
--非石蜡溶剂的脱水剂：如乙醇和丙酮等，其组
织在脱水后必须再经二甲苯透明才能浸蜡。 --脱水兼石蜡溶剂的脱水剂：如正丁醇等组织在脱 水后即可直接浸蜡，不经过中间溶剂如二甲苯之类 的试剂。
组织处理
2、透明： 用化学试剂，通常为二甲苯将组织内的脱水剂置换出
来的过程称透明。 透明发挥了一个桥梁作用，透明剂可以与包埋剂和脱
片 3-氨丙基三已氧基硅烷（APES） 带电荷玻片或阳玻片
冰冻切片
常用于术中快速病理诊断 组织不经脱水，透明等步骤，对蛋白，脂肪，各种
酶保存好，合适做组织化学，免疫组化等染色，尤 其对不合适石蜡组织的抗体 组织会膨胀，细胞变大，出现与常规切片的一些差 异
常规HE染色
染色的意义和目的： 用染液对组织切片进行处理，使组织中的不
B5固定液
配制：储备液：氯化汞12g+醋酸钠2.5g+蒸馏水 200ml。使用前加2ml甲醛到20ml储备液中 常用于骨髓，淋巴结，脾和其他造血组织的固定。
组织固定注意事项
组织离体后尽早放入固定液中 固定液体的体积应大于标本的4~5倍，甚至20倍 固定的容器口要方便组织固定后取出 组织固定时间不宜太长，一般不超过72小时，固定
Ｚenker氏液固定后，细胞核和细胞浆染色较为 清晰，特别显示骨骼肌的横纹
石蜡切片( he)
石蜡制片法（用于免疫组织化学，HE染色）实验原理：HE染色是一种以形态为基础，结合应用化学技术对组织、各种细胞进行染色的实验技术，用于研究组织细胞的生理、病理和化学结构。
基本原理：去氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。
苏木精在碱性溶液中称蓝色，所以细胞核被染成蓝色。
伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。
伊红是细胞浆的良好染料。
石蜡制片法是将材料经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里面进行切片的方法。
此法适用范围，制片手段完备，能将材料切成极薄的片子（可切至2-8微米左右），并能制成连续的片子，这是其它制片法难以达到的，因此在光学显微镜的制片技术上它是最常用的一种方法。
除了一些经不住石蜡切片法中所应用的各种药剂处理的材料不能应用石蜡切片以外，一般的材料都可以用此法制片，但有制作时间较长，操作过程复杂以及材料易发硬或发脆等缺点。
该法多采用旋转式切片机进行切片。
石蜡制片操作程序如下：（一）材料的采集与分割采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察病理解剖，则要取病斑、病症部位。
采下的材料应立即放在标本箱或湿布包起来带回实验室进行分割固定（如有条件也可在试验地采集后进行分割固定）。
为使固定液能迅速的渗透材料，材料要进行分割。
分割时动作要迅速，以防材料萎蔫。
分割块的大小，宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。
（二）杀死与固定利用药剂迅速把细胞杀死，以保持材料本来的状态和结构。
常用的固定有F.A.A固定液、卡诺固定液等。
将固定液放在具塞小瓶中，投入材料，盖好瓶盖。
用F.A.A固定液固定，时间至少24小时。
F.A.A固定液既是良好的固定剂，也是保存剂，因此材料可长期保存在固定液中备用。
《病理检验技术》课件——石蜡切片的HE染色
5～10分钟 5～10分钟 3～5分钟 3～5分钟 3～5分钟 3～5分钟 1～2分钟 1～2分钟 5～8分钟 2～3秒
石蜡切片的HE染色
11.1%的盐酸乙醇 12.流水冲洗 13.0.5%的伊红水溶液 14.蒸馏水稍洗 15.80%的乙醇 16.95%的乙醇 17.无水乙醇(Ⅰ) 18.无水乙醇(Ⅱ) 19.无水乙醇(Ⅲ) 20.二甲苯(Ⅰ) 21.二甲苯(Ⅱ) 22.中性树胶封片
石蜡切片的HE染色
苏木精
一种天然染料，本身不能染色，氧化后变成苏 木红才成为真正的染料，苏木对细胞核的亲和 力需媒染剂的帮助，此时细胞核呈红色，只有 在碱性环境中，苏木才变成蓝色。
伊红Y
人工合成染料，它可能是通过渗透或弥散作用完 成染色的，故与组织结合不牢固，它对细胞质着 色。
染色原理
石蜡切片的HE染色
2.二甲苯脱蜡后按常规 是用无水乙醇洗去二甲 苯。
4.1%盐酸乙醇分 化液分化时间要 根据分化液的新 旧适当调整。
3.苏木精染液要配好，其好 坏决定染色的优劣。要定期 过滤，避免氧化膜及沉淀等 污染切片。
石蜡切片的HE染色
5.盐酸-乙醇分化后用流水冲洗时间要足够， 目的是把酸彻底冲洗干净，使组织返蓝，也 避免切片残留酸液使切片易褪色。
因此，把第16步的无水乙醇改 为苯酚二甲苯(1:3)混合液进行 脱水，可省去第17步的无水乙 醇，脱水时间3～5分钟，可彻 底脱去切片水分
石蜡切片的HE染色
8.苯酚别名石炭酸，为白色针状结晶，配制苯酚 二甲苯前需要将苯酚放入56℃温箱内或水浴加热 溶解。苯酚如被氧化变成红色，不能使用。
9.使用一些二甲苯代替品如松节油代替二甲苯脱 蜡和透明，可避免二甲苯的毒性，但脱蜡和透明 效果会比二甲苯差，需要增加脱蜡和透明时间。
最新实验11生物显微制片技术PPT课件
• 固定：用化学药液浸渍切成小块的新鲜材料，迅 速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细 胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化， 尽可能保持其活体时的结构。此外固定还有使组 织硬化作用，助染作用。此外还有物理方法如干 燥、高热和低温骤冷等方法固定。
• 洗涤与脱水：
• 洗涤：固定后的组织材料需除去留在组织内的固 定液及其结晶沉淀，以免影响以后的染色效果。多 以流水冲洗。
4.2 石蜡切片法（根、茎、叶）
• 显微观察，便于器官的立体重构。 • 硬质材料可用滑走切片机，一般可用手摇切片机。 • 程序：取材（0.5-1cm3）→固定（卡诺、FAA，2-24h，
材料有空气的需抽气） →洗涤（70%乙醇2次） →脱水 （80 % 、90、100、100%乙醇各0.5h）→透明（乙醇+ 二甲苯等量混合15min，二甲苯0.5h 2次）→透蜡（二甲 苯+石蜡各半35-37 ℃,0.5-48h ，石蜡56-60 ℃,0.5-1h 2 次）→包埋（凝30min）→切片（8μm，水面展开）→贴 片（涂粘片剂，滴水1滴）→展片（40-45℃）→烘干 （37 ℃，24h ）。
4 植物组织制片技术实例
4.1 徒手切片 重要的是切下一小片平而薄的组织，而不是切下完整的组织
片； 左手持材料或夹持物（莴苣茎、胡萝卜根、泡沫塑料等），
右手平稳持刀（刀片或手术刀），用臂力不用腕力； 刀刃平置经削平的平面上，轻轻压住刀片，以均匀的力量平
稳的动作，从刀刃的右侧斜向左侧切削，不可挤压材料或 拉锯式切割； 材料切面上和刀刃上保持有水，以免材料干枯； 切片可简易染色1-2min，0.1%亚甲基蓝，0.5%中性红，1% 番红（木质化细胞壁及核染成红色）I2-KI溶液（淀粉粒 蓝色，核呈黄色）
• 洗涤与脱水：
• 洗涤：固定后的组织材料需除去留在组织内的固 定液及其结晶沉淀，以免影响以后的染色效果。多 以流水冲洗。
4.2 石蜡切片法（根、茎、叶）
• 显微观察，便于器官的立体重构。 • 硬质材料可用滑走切片机，一般可用手摇切片机。 • 程序：取材（0.5-1cm3）→固定（卡诺、FAA，2-24h，
材料有空气的需抽气） →洗涤（70%乙醇2次） →脱水 （80 % 、90、100、100%乙醇各0.5h）→透明（乙醇+ 二甲苯等量混合15min，二甲苯0.5h 2次）→透蜡（二甲 苯+石蜡各半35-37 ℃,0.5-48h ，石蜡56-60 ℃,0.5-1h 2 次）→包埋（凝30min）→切片（8μm，水面展开）→贴 片（涂粘片剂，滴水1滴）→展片（40-45℃）→烘干 （37 ℃，24h ）。
4 植物组织制片技术实例
4.1 徒手切片 重要的是切下一小片平而薄的组织，而不是切下完整的组织
片； 左手持材料或夹持物（莴苣茎、胡萝卜根、泡沫塑料等），
右手平稳持刀（刀片或手术刀），用臂力不用腕力； 刀刃平置经削平的平面上，轻轻压住刀片，以均匀的力量平
稳的动作，从刀刃的右侧斜向左侧切削，不可挤压材料或 拉锯式切割； 材料切面上和刀刃上保持有水，以免材料干枯； 切片可简易染色1-2min，0.1%亚甲基蓝，0.5%中性红，1% 番红（木质化细胞壁及核染成红色）I2-KI溶液（淀粉粒 蓝色，核呈黄色）
《石蜡切片技术》课件
2 不足
制备石蜡切片需要复杂的操作和专业设备，同时样本可能发生失真和伪影。
石蜡切片技术的发展前景
科技创新
随着科技的
石蜡切片技术在不同领域的应 用将促进跨学科的合作和创新。
新发现
通过石蜡切片技术，我们将有 机会发现更多细胞和组织的奥 秘，推动科学的发展。
总结和展望
《石蜡切片技术》是一项重要的科学技术，它在医学和科学研究中发挥着重要作用。我们相信随着技术的不断 发展，石蜡切片技术将为我们带来更多的新发现和突破。
《石蜡切片技术》PPT课 件
欢迎来到《石蜡切片技术》的世界！让我们一起探索这个令人着迷的技术， 揭开它的奥秘！
技术背景
在科学研究和医学领域中，石蜡切片技术起着重要作用。了解其背景将有助于我们深入了解该技术的重要性和 应用。
石蜡切片技术的定义与原理
1
定义
石蜡切片技术是一种用于制作细胞切片的方法，它可以保持细胞结构的完整性。
2
原理
该技术的原理是将固定的组织样本浸入石蜡中，使其固化，然后使用显微切片机 切割出薄片。
3
挑战
石蜡切片技术需要严格的控制温度和时间，以确保薄片的质量和细胞结构的完整 性。
石蜡切片制备方法
石蜡切片技术有多种制备方法，包括冷冻切片、热切片和冷热切片等。每种 方法都有其适用的情况和优缺点。
石蜡切片技术的应用领域
医学研究
石蜡切片技术在病理学和生 物医学研究中广泛应用，有 助于揭示疾病发生的机制。
植物学
通过石蜡切片技术，科学家 可以观察植物的细胞结构、 组织构造和生长过程。
材料科学
该技术也用于材料科学中， 用于观察材料的结构和性能。
石蜡切片技术的优势与不足
1 优势
制备石蜡切片需要复杂的操作和专业设备，同时样本可能发生失真和伪影。
石蜡切片技术的发展前景
科技创新
随着科技的
石蜡切片技术在不同领域的应 用将促进跨学科的合作和创新。
新发现
通过石蜡切片技术，我们将有 机会发现更多细胞和组织的奥 秘，推动科学的发展。
总结和展望
《石蜡切片技术》是一项重要的科学技术，它在医学和科学研究中发挥着重要作用。我们相信随着技术的不断 发展，石蜡切片技术将为我们带来更多的新发现和突破。
《石蜡切片技术》PPT课 件
欢迎来到《石蜡切片技术》的世界！让我们一起探索这个令人着迷的技术， 揭开它的奥秘！
技术背景
在科学研究和医学领域中，石蜡切片技术起着重要作用。了解其背景将有助于我们深入了解该技术的重要性和 应用。
石蜡切片技术的定义与原理
1
定义
石蜡切片技术是一种用于制作细胞切片的方法，它可以保持细胞结构的完整性。
2
原理
该技术的原理是将固定的组织样本浸入石蜡中，使其固化，然后使用显微切片机 切割出薄片。
3
挑战
石蜡切片技术需要严格的控制温度和时间，以确保薄片的质量和细胞结构的完整 性。
石蜡切片制备方法
石蜡切片技术有多种制备方法，包括冷冻切片、热切片和冷热切片等。每种 方法都有其适用的情况和优缺点。
石蜡切片技术的应用领域
医学研究
石蜡切片技术在病理学和生 物医学研究中广泛应用，有 助于揭示疾病发生的机制。
植物学
通过石蜡切片技术，科学家 可以观察植物的细胞结构、 组织构造和生长过程。
材料科学
该技术也用于材料科学中， 用于观察材料的结构和性能。
石蜡切片技术的优势与不足
1 优势
最新第二章 常规制片技术1幻灯片课件
第一季度目标完成率排名 (一)
省份
宁夏 黑龙江
新疆 吉林 湖南 河北 江苏 深圳 山东 安徽 甘肃 浙江 河南 辽宁 陕西
目标
3520 20000 7000 11760 7350 12100 12350 8200 9510 5900 2850 6980 11600 21050 10850
完成
4460 24410 7400 11710 7300 11560 11460 7535 8480 5050 2400 5790 9600 17055 8350
一季度各区各机型销量
10000 8000 6000 4000 2000
0 华东 华北 东北 华南 西北 西南
880 9G 9T 390
9G
第一季度9G各区提货比例
西北 12% 华南 14%
西南 5%
东北 31%
华东 11%
华北 27%
华东 华北 东北 华南 西北 西南
9G全国各区本仓库存比例
西8北% 西10南%
完成率
126.70% 122.05% 105.71% 99.57% 99.32% 95.54% 92.79% 91.89% 89.17% 85.59% 84.21% 82.95% 82.76% 81.02% 76.96%
名次
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
第一季度目标完成率排名 (二)
• 脱水时应注意： (1)每向后转移前，须先将组织块上的液体用吸水 纸吸干，以免影响后续乙醇的浓度;
（2）在高浓度或无水乙醇中，每级停留的时间不宜 太长，否则可使组织收缩变脆，影响切片；
（3）如需过夜，应停留在70%乙醇中，也可长期保 存，可防止因时间倒不开而影响后续步骤。
最新常规石蜡制片HE染色技术PPT课件
五、浸蜡
（一）浸蜡目的
浸蜡是将透明过的组织块在熔化的石 蜡中浸渍的过程。目的是用石蜡代替组织 块中的二甲苯，在随后温度下降中，使较 软的组织块变成有一定硬度的组织蜡块， 以便切片机切片
（二）浸蜡的步骤
第1杯熔蜡(软蜡)(熔点54℃以下) 1小时
第2杯熔蜡(硬蜡)(58~60℃)
1小时
第3杯熔蜡(硬蜡)(58~60℃)
2．切片刀与磨刀 石蜡切片常用的切片刀为平楔型切 片刀，也有一次性切片刀
非一次性使用的切片刀在切片前需 要研磨，以保持其锋利；研磨Байду номын сангаас可分为 手工研磨刀和机械研磨刀（磨刀机）两 种
（二）石蜡切片过程
1．修块 2．蜡块和切片刀固定 3．调整蜡块切面和切片刀角度(10°以内) 4. 调整刀台与标本台距离 5. 修整蜡块切面，暴露完整组织切面 6. 调整切片厚度调节器(厚度为6~8μm) 7. 正式切片 8．切片展平 9．贴片和烘片
四、透明
（一）透明意义及透明剂
组织脱水后，内部仅含脱水剂，但大多数脱 水剂不能与石蜡相溶，石蜡仍不能浸入组织内进 行包埋和切片。为此，需要一种既能溶于脱水剂 又能溶于包埋剂（石蜡）的溶剂，以便逐步将脱 水剂置换成包埋剂。这一过程往往使组织呈半透 明状，故称透明
二甲苯为石蜡包埋法中最常用的透明剂；它 透明能力强，但易使组织收缩、变脆，故组织块 的透明时间不宜太长，小组织块以30分钟为宜， 较大组织块适当延长但不超过2小时
5ml
0.2 mol/L PB（pH 7.4）
～100ml
第二节 固定后处理及切片
一、组织修整
固定结束后，将受挤压或不需要的 部分组织修切或整形，同时选择好包埋 面，称组织修整。修整可在冲洗前、也 可放在冲洗后
石蜡切片的制作及HE染色课件
02
取材的大小和厚度也会影响后续 的切片制作，一般而言，组织块 的大小应为2-3cm³，厚度在24mm之间。
固定
固定是为了防止组织自溶和腐败，保 持组织细胞的形态和结构。常用的固 定剂有甲醛、乙醇、丙酮等。
固定时需要将组织放入适当的固定液 中，固定时间一般为1-24小时，具体 时间根据组织类型和大小而定。
04
石蜡切片制作及HE染色的质量控制
切片厚度控制
切片厚度
石蜡切片的厚度应控制在2-5微米之间， 过薄或过厚都会影响染色效果和显微镜 观察。
VS
切片均匀度
确保切片厚薄均匀，无裂痕或气泡，以提 高染色和观察的准确性。
染色浓度与时间控制
染色浓度
根据组织类型和染色需求，选择合适的染色浓度，以达到最佳染色效果。
01
02
03
04
防止脱片
在染色过程中要保持切片的湿 润，避免脱片。
控制染色时间
染色时间不宜过长或过短，应 根据实际情况进行调整，以达
到最佳染色效果。
注意染液浓度
染液的浓度要适中，过浓或过 淡都会影响染色效果。
避免污染
在染色过程中要保持染缸的清 洁，避免污染影响染色效果。
03
石蜡切片HE染色结果分析
浸蜡
浸蜡是为了将石蜡渗透到组织中，使组织变得硬固，以便 切片。常用的石蜡有固体石蜡和液体石蜡。
浸蜡时需要将组织放入适当的石蜡中，时间一般为1-2小 时，具体时间根据组织类型和大小而定。
包埋
包埋是将组织用石蜡包裹起来，以便 切片。包埋时需要将组织放入包埋盒 中，并确保组织平整、无气泡。
包埋盒需要用标签标记清楚，以便后 续的切片和观察。
染色时间
染色时间的长短也会影响染色效果，时间过短会使染色不明显，时间过长则可能导致染 色过度。
取材的大小和厚度也会影响后续 的切片制作，一般而言，组织块 的大小应为2-3cm³，厚度在24mm之间。
固定
固定是为了防止组织自溶和腐败，保 持组织细胞的形态和结构。常用的固 定剂有甲醛、乙醇、丙酮等。
固定时需要将组织放入适当的固定液 中，固定时间一般为1-24小时，具体 时间根据组织类型和大小而定。
04
石蜡切片制作及HE染色的质量控制
切片厚度控制
切片厚度
石蜡切片的厚度应控制在2-5微米之间， 过薄或过厚都会影响染色效果和显微镜 观察。
VS
切片均匀度
确保切片厚薄均匀，无裂痕或气泡，以提 高染色和观察的准确性。
染色浓度与时间控制
染色浓度
根据组织类型和染色需求，选择合适的染色浓度，以达到最佳染色效果。
01
02
03
04
防止脱片
在染色过程中要保持切片的湿 润，避免脱片。
控制染色时间
染色时间不宜过长或过短，应 根据实际情况进行调整，以达
到最佳染色效果。
注意染液浓度
染液的浓度要适中，过浓或过 淡都会影响染色效果。
避免污染
在染色过程中要保持染缸的清 洁，避免污染影响染色效果。
03
石蜡切片HE染色结果分析
浸蜡
浸蜡是为了将石蜡渗透到组织中，使组织变得硬固，以便 切片。常用的石蜡有固体石蜡和液体石蜡。
浸蜡时需要将组织放入适当的石蜡中，时间一般为1-2小 时，具体时间根据组织类型和大小而定。
包埋
包埋是将组织用石蜡包裹起来，以便 切片。包埋时需要将组织放入包埋盒 中，并确保组织平整、无气泡。
包埋盒需要用标签标记清楚，以便后 续的切片和观察。
染色时间
染色时间的长短也会影响染色效果，时间过短会使染色不明显，时间过长则可能导致染 色过度。
1 HE染色ppt课件
染色后的水洗：为洗去未与切片结合的染液
分化后的水洗：为了中止分化作用
六、分化的作用
苏木素染色后，用水洗去未结合在 切片中残 余的染液，但是对细胞核中结合过多的染料和细 胞浆中吸附的染料必须用分化液 0.5％盐酸酒精脱 去，才能保证细胞核和细胞浆染色的分明，把这 个过程称为染色的分化作用。
分化步骤的准确也是染色成败的关键，若分 化失当则必然引起染色不匀或过淡，过深等现象， 因此分化后一定要镜检，观察胞核是否清晰，胞 浆呈淡白色。否则需再次分化，不然一旦复染后， 组织会呈紫蓝色即“蓝盖红”现象。
七、返蓝的作用
分化之后苏木精在酸性条件下处红色离子状 态，在碱性条件下则处于蓝色离子状态，而呈蓝 色，所以分化后用水洗去酸而中止分化，再用弱 碱水使苏木素染上细胞核变成蓝色，称蓝化作用， 一般分用自来水浸洗变蓝，也可用稀氨水或温水。
八、染色后的脱水与透明
伊红染色后，用浓度递增的酒精脱水，95％95％-无水-无水（各级1-3分钟），由低→高是为 了逐渐脱去组织中的水份，为二甲苯进入细胞创 造条件，否则组织切片透明度达不到光学显微镜 观察时透光度的要求，在显微镜下不可能看到清 晰的细胞和组织结构。
九、细胞着色
细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、 钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染 成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈 反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈 亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。 着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生 活周期及病理变化而改变。例如，细胞在新生时期胞 浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退 行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透 明变性时，伊红着色由浅变深。
课件1 HE染色
石蜡切片和HE染色
石蜡切片和H E染色文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-石蜡切片和HE染色1、取材颈椎脱臼处死小鼠，打开腹腔，剪去肝组织（或其他组织）。
切取得组织不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm*5mm*2mm或10*mm*10mm*2mm为宜。
取下所需要的肝组织，切成一小块2-3mm厚。
注意事项：⑴取材动作要迅速，不宜作太久的拖延一面组织细胞的成分、结构等发生变化。
⑵切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。
2、固定将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入4%多聚甲醛中固定，固定30-50min。
注意事项：⑴一半固定液，都以新配好为好，配好后应储存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用⑵有些混合固定液的成分之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，失去时就没有作用了⑶固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20-30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液⑷材料固定完成后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外加上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，一面相互混淆。
标签上注明固定液、材料来源、日期等。
标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。
3、脱水50%→70%→80%→95%→100%→100%酒精。
每个0.5h。
注意事项：⑴脱水必须在有盖的玻璃瓶中进行，防止吸收空气中的水分⑵在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂⑶在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体⑷在高浓度或酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。
⑸如需过夜，应停留在70%酒精中⑹脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色浑浊现象。
4、透明1/2二甲苯+1/2无水乙醇（20min）→纯二甲苯Ⅰ（15min）→纯二甲苯Ⅱ（25min）。
常规组织病理技术ppt课件
46
缺点： ●经酒精固定的标本对核的染色不良，也不利于 染色体的固定。 ●要证明细胞含的脂肪和类脂质时，不能用酒精 固定。 ●如要证明组织内的色素时，不宜以酒精作为固 定剂。 ●不适用于固定大块组织。 ● 酒精价格较贵。
47
80%-95%的酒精作为固定剂为好 高浓度酒精组织硬化显著,放置过久组织 收缩明显且质脆,不但影响制片, 组织形态也 不好。 很少单独使用
甲醛氧化 --- 蚁酸与血红蛋白结合—福尔马林色素 避免长时间固定， 固定后流水冲洗
●尿酸结晶可被溶解。
44
甲醛固定液的配制:
（1）10% formalin
市售甲醛（浓度为37~40%） 1份
水
9份
(2)中性甲醛 以PH7.2-7.4PBS为溶液配制的甲醛固定液
45
优点： ● 如要证明尿酸结晶和保存糖类，则须用 100%酒精固定。 ●在已用别种固定液后，可用70%酒精较 久的保存组织。 ● 酒精既有固定作用，又有脱水作用。
染色
常规染色 染色的目的：增加组织在显微镜下的分辨率
HE染色 主要用以显示各种组织、细胞的一般形
态结构以及疾病过程中病变的发生、发展及修 复的过程。
常规染色 特殊染色
79
（一）染色原理
1、细胞核染色原理：核酸阴离子+苏木素阳离子→蓝色
2、细胞浆染色原理：蛋白质阳离子+伊红阴离子→伊红色
PH值低于蛋白质等电点
传统病理学技术
常规组织病理技术
（formalin固定 石蜡切片 HE）
现代新技术
7
免疫组化
HE
乳腺导管
8
免疫荧光
HE
9
结肠癌 EB病毒原位分子杂交
10
缺点： ●经酒精固定的标本对核的染色不良，也不利于 染色体的固定。 ●要证明细胞含的脂肪和类脂质时，不能用酒精 固定。 ●如要证明组织内的色素时，不宜以酒精作为固 定剂。 ●不适用于固定大块组织。 ● 酒精价格较贵。
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80%-95%的酒精作为固定剂为好 高浓度酒精组织硬化显著,放置过久组织 收缩明显且质脆,不但影响制片, 组织形态也 不好。 很少单独使用
甲醛氧化 --- 蚁酸与血红蛋白结合—福尔马林色素 避免长时间固定， 固定后流水冲洗
●尿酸结晶可被溶解。
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甲醛固定液的配制:
（1）10% formalin
市售甲醛（浓度为37~40%） 1份
水
9份
(2)中性甲醛 以PH7.2-7.4PBS为溶液配制的甲醛固定液
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优点： ● 如要证明尿酸结晶和保存糖类，则须用 100%酒精固定。 ●在已用别种固定液后，可用70%酒精较 久的保存组织。 ● 酒精既有固定作用，又有脱水作用。
染色
常规染色 染色的目的：增加组织在显微镜下的分辨率
HE染色 主要用以显示各种组织、细胞的一般形
态结构以及疾病过程中病变的发生、发展及修 复的过程。
常规染色 特殊染色
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（一）染色原理
1、细胞核染色原理：核酸阴离子+苏木素阳离子→蓝色
2、细胞浆染色原理：蛋白质阳离子+伊红阴离子→伊红色
PH值低于蛋白质等电点
传统病理学技术
常规组织病理技术
（formalin固定 石蜡切片 HE）
现代新技术
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免疫组化
HE
乳腺导管
8
免疫荧光
HE
9
结肠癌 EB病毒原位分子杂交
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病理制片和染色技术PPT课件
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2、AAF液 配制 : 纯酒精85ml+醋酸 5ml+甲醛10ml
第48页/共186页
第27页/共186页
5）尽可能避免使组织膨胀或收缩。 6）能使细胞内的成分（蛋白质）凝固或 沉淀下来。 7）增加细胞内含物的折光程度，易于鉴 别。增加媒染作用和染色能力。 8）使组织变硬，适于制片，但又不使材 料太坚硬而松脆。 9）使组织充分固定，便于保存。
第28页/共186页
第二节
介绍几种常见固定液
第2页/共186页
第一章 病理技术的应用范围
第3页/共186页
➢帮 助 临 床 查 明 死 因 （ 原 因 不 明 的 死 亡 ） ➢手 术 后 病 变 标 本 ， 以 明 确 诊 断 （ 临 床 活检） ➢提供教学、科研的资料
第4页/共186页
第一节 组织制片的概述
第5页/共186页
组织制片技术的应用，从1665 年由HOOk发现细胞开始，已有300 多年的历史。最早应用冰冻切片；随 后又进一步利用石蜡的硬度，以石蜡 包埋组织，制成石腊切片；后来又利 用明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等物质 的韧性，以其包埋组织而制作切片。
第40页/共186页
6、丙酮
丙酮又名醋酮或本酮，极易挥发、 易燃的无色液体，能与水、醇、氯仿、 醚及多种溶液混合。
第41页/共186页
特性：
1）它可以作固定剂，又可作脱水剂，穿 透速度快，可使蛋白质沉淀凝固，2毫米 以下的组织固定半小时至1小时即可。 2）可引起组织较强的收缩使之变硬，对 核固定不佳。 3）对某些酶的固定很好，如碱性磷酸酶、 酸性磷酸酶等。 4）丙酮一般多与氯化汞、甲醛混合液使 用，先用低浓度丙酮再经高浓度丙酮固定 以减少组织收缩和过度硬化。
2、AAF液 配制 : 纯酒精85ml+醋酸 5ml+甲醛10ml
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第27页/共186页
5）尽可能避免使组织膨胀或收缩。 6）能使细胞内的成分（蛋白质）凝固或 沉淀下来。 7）增加细胞内含物的折光程度，易于鉴 别。增加媒染作用和染色能力。 8）使组织变硬，适于制片，但又不使材 料太坚硬而松脆。 9）使组织充分固定，便于保存。
第28页/共186页
第二节
介绍几种常见固定液
第2页/共186页
第一章 病理技术的应用范围
第3页/共186页
➢帮 助 临 床 查 明 死 因 （ 原 因 不 明 的 死 亡 ） ➢手 术 后 病 变 标 本 ， 以 明 确 诊 断 （ 临 床 活检） ➢提供教学、科研的资料
第4页/共186页
第一节 组织制片的概述
第5页/共186页
组织制片技术的应用，从1665 年由HOOk发现细胞开始，已有300 多年的历史。最早应用冰冻切片；随 后又进一步利用石蜡的硬度，以石蜡 包埋组织，制成石腊切片；后来又利 用明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等物质 的韧性，以其包埋组织而制作切片。
第40页/共186页
6、丙酮
丙酮又名醋酮或本酮，极易挥发、 易燃的无色液体，能与水、醇、氯仿、 醚及多种溶液混合。
第41页/共186页
特性：
1）它可以作固定剂，又可作脱水剂，穿 透速度快，可使蛋白质沉淀凝固，2毫米 以下的组织固定半小时至1小时即可。 2）可引起组织较强的收缩使之变硬，对 核固定不佳。 3）对某些酶的固定很好，如碱性磷酸酶、 酸性磷酸酶等。 4）丙酮一般多与氯化汞、甲醛混合液使 用，先用低浓度丙酮再经高浓度丙酮固定 以减少组织收缩和过度硬化。
HE染色ppt课件
整理ppt
9
几种常见的染色问题
脱蜡：
切片中白色的区域脱蜡不彻底，染色液由 于石蜡斑点的残留而不能渗透着色。
整理ppt
原因：①烤( 烘) 片温度
太低，脱蜡前没有充分烤 ( 烘) 干。 ②二甲苯脱蜡时 间不足， 或二甲苯使用过 久，造成脱蜡不尽。
对策：①用无水乙醇去
掉玻璃片上的水分，重新
二甲苯脱去石蜡。 ②切
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原因：盖玻片上可能有封固切
片的封固剂。
对策：移去盖玻片， 重新用干
净的盖玻片封片。
盖玻片上有封固剂所致切片组织模糊不清
整理ppt
18
封片后镜下则会出现类似色素的 点状结晶或类似“裸核”样的改变
整理ppt
原因：切片封片前放置在
空气中时间太长， 以至于 二甲苯挥发切片干燥所致。
对策：移去组织切片上的
整理ppt
8
（3） 脱水。染色后通过各级酒精脱水，从低浓度到高浓度。低浓度 酒精对伊红有分化作用，切片经过低浓度时要短，向高浓度逐渐延长 脱水时间，脱水不彻底，使切片发雾，在显微镜下组织结构模糊不清。
（4）透明与封片。切片染色脱水后必须经二甲苯处理，使切片透明， 才能用树胶封片。应引起注意的是，二甲苯纯度不纯使切片透明不够， 会影响切片质量。
染色
细胞核
分化和蓝化
水解
渗透作用或者 弥散作用完成 负电荷色酸 （染料有色部分）
染色
伊红
正电荷色酸
（染料无色部分）
整理ppt
4
试剂
苏木素染液（细胞核着色） 盐酸乙醇分化液 稀氨水 伊红染液 二甲苯 梯度浓度乙醇
整理ppt
5
染色步骤
3 × 5min
100% min
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70%酒精
2~5小时(可长期保存组织)
80%酒精
2~5小时
90%酒精
2~5小时
95%酒精（Ⅰ） 2~5小时
95%酒精（Ⅱ） 2~5小时
无水酒精（Ⅰ） 30分钟
无水酒精（Ⅱ） 30分钟
无水酒精（Ⅲ） 30分钟
（三）脱水注意事项
1．组织脱水必须掌握由低浓度逐步 过渡到高浓度的原则
2．脱水时间要适度 3．组织脱水要彻底干净
2. 固定液 动物血液量的2倍 动物体重（g）×7%×20（ml）
无论是局部灌注固定，还是全身灌 注固定，在灌注完毕后，必须立即将组 织块、器官或整个动物再放入同样的固 定液中进行后固定
（三）固定注意事项及影响因素
1．组织块不宜过大
2．软组织或较大块组织可先经2~3小时固定后， 再修整成小块重投入新配制的固定液内继续固定
脱水剂必须具有下列特性：1）脱水剂 能与水按任意比例混合；2）脱水剂高浓度 时不含水分；3）脱水剂也能与透明剂按任 意比例互相混合
脱水剂中最常用的是酒精。
一般从70%酒精开始脱水，逐步 升高酒精浓度；脱水时间根据组织块 的种类、大小、及使用的固定液种类 等因素而定
（二）脱水步骤和时间
以18mm×18mm，厚约2~3mm的组织块 为例，其脱水步骤和参考时间如下
10ml 30ml 60ml
75ml 25ml 5ml
4．Helly 液
重铬酸钾
2.5g
升汞
5g
蒸馏水
100ml
（以上是Helly储存液）
甲醛液(37%~40%) (临用时加入) 5ml
5．1%多聚甲醛-1.25%戊二醛固定液
多聚甲醛
1g
蒸馏水
50ml
在通风橱内加热使之完全溶解，然后冷却
25%戊二醛
四、透明
（一）透明意义及透明剂
组织脱水后，内部仅含脱水剂，但大多数脱 水剂不能与石蜡相溶，石蜡仍不能浸入组织内进 行包埋和切片。为此，需要一种既能溶于脱水剂 又能溶于包埋剂（石蜡）的溶剂，以便逐步将脱 水剂置换成包埋剂。这一过程往往使组织呈半透 明状，故称透明
液极难渗入内部的组织标本） （1）局部灌注固定（肺、肝、肾、脑等） （2）全身灌注固定 （小鼠、大鼠、兔、
狗、猴、人） 4. 微波固定法
灌注过程
充分暴露心脏 针尖插入左心室或升主动脉中 快速灌注生理盐水 剪开右心耳（或右心房）放血 换灌固定液，先快后慢输入
用量
1. 生理盐水 大鼠需用80-100ml、兔150-200ml、 猫200-250ml、猴300-500ml、 狗800-1000ml
用多种具有固定作用的试剂混合配 制的固定液，达到各试剂在固定作用中 具有的优缺点平衡目的
常用混合固定液
1．酒精-甲醛液（A-F 液） 95%或无水酒精（A） 37%~40%甲醛液（F）
2．Carnoy液 冰醋酸 氯仿 无水酒精
3．Bouin 液 饱和苦味酸水溶液 甲醛液（37%~40%） 冰醋酸
90ml 10ml
常规石蜡制片he染色技 术
第二章
光镜标本的基本制作技术
动物致死方法
1．断头法 2．击头法 3．麻醉法 4．股动脉放血法 5．空气栓塞法
细胞标本制备
1. 印片法 2. 穿刺法 3. 沉淀法 4. 培养细胞标本制备
二、取材及注意事项
1．材料保持新鲜 2．组织块免受挤压 3．组织块力求小而薄 4．尽量保持组织的原有形态 5．选取好组织块的切面 6．动物品种的选择和熟悉取材的解剖位置 7．切除不需要的部分 8．保持材料的清洁
1．水洗涤法：凡用水配制、或含铬、锇 等的固定液所固定的组织块，需用水洗涤
2．酒精洗涤法：凡用酒精、或酒精混合 液、或含有苦味酸等固定液固定的组织块， 多采用酒精洗涤
三、组织脱水
（一）脱水意义与脱水剂
因水和石蜡不能相溶，而组织经固定及 水洗后含有水分，所以不能直接用石蜡进行 包埋。需用某些溶剂逐步置换组织块中的水 分，称脱水
固定小块组织(15×15×2mm)10小时左右
经它长期固定的组织，需经24~48小时的自 来水流水冲洗
甲醛单纯固定液的常用配方
10%甲醛水溶液 37%-40%甲醛液 自来水或蒸馏水
10ml 90ml
10%甲醛生理盐水溶液
37%-40%甲醛液 氯化钠
10ml 0. 85g
自来水或蒸馏水
90ml
2．多聚甲醛：一种渗透速度极快的 甲醛聚合物，在热水中可解聚成甲醛单体 而溶解，在接近水的沸点时溶解极快；也 可溶解于弱碱中。多聚甲醛溶液实际上是 新配制的甲醛液，宜临用前配制
5ml
0.2 mol/L PB（pH 7.4）
～100ml
第二节 固定后处理及切片
一、组织修整
固定结束后，将受挤压或不需要的 部分组织修切或整形，同时选择好包埋 面，称组织修整。修整可在冲洗前、也 可放在冲洗后
二、组织洗涤
洗去渗入组织内的固定液，再进行下一 步骤的操作；否则会妨碍染色效果，或引起 沉淀、结晶而影响观察，也可能会继续发生 化学反应造成后道操作困难
3．固定液的量是组织块大小的5-20倍为宜，在 固定组织的瓶底垫上脱脂棉、数层纱布或滤纸
4．固定时间的长短视固定剂的种类、温度、 组织块的大小而定
四、固定液
（一）单纯固定液
1．甲醛（福尔马林）：商品甲醛的浓度是 37% ~ 40%的甲醛水溶液。常用甲醛的固定液浓 度是10%，而实际甲醛浓度只有4%
4．酒精：单纯固定液为80%~95%的浓 度，不必水洗而直接脱水。多用于组织化学 中的糖原固定
酒精固定的组织易变硬和发脆、组织收 缩较大，所以不易长时间停留其中（70%酒 精除外）
可作为配制混合固定液的基本成分
5 ．其它固定液 丙酮 醋酸 三氯醋酸 氯化汞
苦味酸 重铬酸钾 铬酸 锇酸
（二）混合固定液
4%多聚甲醛单纯ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ定液的常用配方
多聚甲醛
4g
蒸馏水（或0.2 mol/L PB）
50ml
在通风橱内加热使之完全溶解，然后冷却
0.2 mol/L PB（或蒸馏水）
～100ml
3．戊二醛：一种常用的醛类固定 剂，能较好的保存组织结构，但其穿透 力弱，作为单纯固定液多用于电镜技术 中。市售的戊二醛是25%的溶液，使用 时需配制成1%~6%的不同浓度
三、组织固定法
固定是使要观察的组织构造尽量 接近它取材前的状态
（一）固定目的
1．标本不发生离开身体后或死后变化 2．随后处理中，标本不易损坏 3. 组织块硬化 4．使组织内各种结构产生不同的折光
率，或对染料具有不同的亲和力
（二）固定方法
1．蒸气固定法（较细小而薄的标本） 2．小块组织固定法（直接投入固定液中） 3．注射、灌注固定法（体积过大或固定