蛋白质生物合成范玉莹
219401796_装载β-乳球蛋白纳米颗粒的海藻酸钠三层复合膜构建及特性
樊文婷，李康静，宋婕，等. 装载β-乳球蛋白纳米颗粒的海藻酸钠三层复合膜构建及特性[J]. 食品工业科技，2023，44（13）：45−52.doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022070353FAN Wenting, LI Kangjing, SONG Jie, et al. Construction and Properties of Alginate-based Trilayer Composite Film Loaded with β-Lactoglobulin Nanoparticles[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(13): 45−52. (in Chinese with English abstract).doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022070353· 研究与探讨 ·装载β-乳球蛋白纳米颗粒的海藻酸钠三层复合膜构建及特性樊文婷1，李康静1，宋 婕1，姜紫菡1，许浩田1，朱俊向1,2，吴 昊1,2,*（1.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛 266109；2.青岛特种食品研究院，山东青岛 266109）摘 要：本文基于层层组装法构建载有β-乳球蛋白纳米颗粒的海藻酸钠-聚乙烯吡咯烷酮-海藻酸钠三层复合膜。
通过调节环境pH 和温度，同时联合芹菜素配体，诱导β-乳球蛋白形成纳米颗粒。
利用粒径、多分散性和Zeta 电位表征，研究β-乳球蛋白纳米颗粒的形成规律和贮藏稳定性。
然后，将β-乳球蛋白纳米颗粒装载到海藻酸钠-聚乙烯吡咯烷酮-海藻酸钠三层复合膜中，研究纳米载量对膜机械特性、透过特性、光学特性和热特性的影响。
结果表明：调整环境pH 为7.1，加热温度为75 ℃，在蛋白/配体摩尔比1:8条件下可得到稳定性较好的β-乳球蛋白纳米颗粒。
实验2 蛋白质的沉淀与透析
4. 蛋白质透析效果检查
1）Cl-的检查：
取洗出液约2ml，
加10%HNO3溶液1~2滴 至酸性，加1%AgNO3 2~3滴，观察有无白色 沉淀。
2）NH4+的检查：
取洗出液2滴加入白瓷板穴中，
加纳氏试剂1滴，观察有无黄红色沉
淀。
一些物理因素（如剧烈震荡、搅拌等）或
化学因素（如重金属离子、有机酸等），会破
坏蛋白质的稳定的构象，引起蛋白质变性。即 使除去了使蛋白质沉淀的因素，蛋白质也不能 再溶于原来的溶剂中, 即为不可逆沉淀作用。
在实验室分离纯化蛋白质的过程中，常利
用透析的方法除去蛋白质溶液中的半透膜作
用，小分子物质可以自由通过与周围的缓冲溶
液进行物质交换，大分子物质（蛋白质）保留
在透析袋中而彼此分离。
【实验步骤】
1. 蛋白质的检查
取卵清蛋白/NaCl 溶液2ml和10%NaOH溶
液1ml，摇匀，加
1%CuSO4溶液1～2滴，
边加边摇。
2. 蛋白质的可逆沉淀作用
1） 球蛋白沉淀
取卵清蛋白/NaCl溶液
2ml，倾斜试管，沿管壁 慢慢加入饱和硫酸铵溶液 2ml，轻轻混匀，静置 5min。
2）清蛋白沉淀
过滤，除去盐
析出的蛋白质。 向滤液中加入
硫酸铵粉末至饱和。
3. 蛋白质的透析
（1）装样：取一段透析袋，将一端夹住，由 开口端加入含有硫酸铵的清蛋白沉淀（不可 装太满，并适当排出空气），夹住袋口。
（2）透析：取10倍以上蛋白质体积的去离子 水，将装好样品的透析袋悬于大烧杯中部。 在烧杯底部放一个磁子，缓慢搅拌以促进溶 液交换。更换洗脱溶液数次（约30min一次）， 至达到透析平衡为止。
脂肪氧合酶催化亚油酸氧化与大豆蛋白相互作用过程中自由基迁移的电子顺磁共振研究(Ⅱ)自由基类型的确
链 ，它在 室温 下稳 定 ，在不 同微 波 功率下检 测 ，在 两个 样 品中均可 观察 到。羟基 自由基 ・ ＯＨ 在两个样 品 中均
可观察 到，它源于 自由基链 反应 和水分子 ，与前述 大豆蛋 白氧化性 修饰的二酪氨酸形 成有 关。醛 自由基一 定源于 大豆蛋 白与 Ｌ ＯＸ催化 Ｌ Ａ氧化 产生的降解产物 的酶促反应 。它包 含在 中场碳 自由基 信号中 ，但稍稍偏 向高场区。 关 键词 ：大 豆 蛋 白： 脂肪 氧 合酶 ；亚 油酸 ； 自由摹 ： 电子 顺磁 共 振
维普资讯
※基础研
艮 品 科 学
２０ ｏ ２， ｏ０ ４ ０＆Ｖ１ ９Ｎ．４ １ ．
脂肪氧合酶催化亚油酸氧化 与大豆蛋白相互作用
过程 中 自由基迁移 的电子顺磁共振研究（Ｉ Ｉ． ） 自由基类型 的确 定
黄 友如 １ ，华 欲 飞 ２ 王雪 峰 １ 顾 建 华 １ ， ， ，陈 义 勇 ｔ
ｎ ａ ｄ￣ ｏ ｙ ｅ ａ ｅ ａ ｄｔ ｅ Ｒ ｅ ｔ ｆ ｅｐ ｏ ｉ ｓ Ｉ ｎ ｅ ｔ ａｅ ｎ ｄｃ ｍｐ ｒ ｗｉ ａ ｄｆｅ ｅ ｔ ｃ ｏ ｖ ｓ Ｔ ｅｅ ｅ ｔ ｐｘｇｎ ， ｓ ｎ ｈ ＥＰ ｓ ｃｒ ｐ ａｏ ｔ ｒ ｔ ｎ ＷＣＣｉ ｖ ｓ ｇ ｔｄａ ｈ ｅ ＇ ｉ ｏ ａｅ ｄ ｈ ｔ ｔ ｉ ｒ ｎ ｍｉ ｗａ ｅ ． ｈ ｆ ｓ ｒ ｃ
（ ． ｐ ｒｍｅ ｔ ｆ ｏｏ ｉａ ｃｅ ｃ ｄＦ ｏ ｎ ｉｅ ｒ ｇ Ｃｈ ｇ ｈ ｓｉ ｔ ｆ ｃ ｎ ｌｇ ， ａ ｇ ｈ ２ ５ ０ ， ｉａ； １Ｄｅ ａｔ ｎ ｌｇｃｌＳ ｉｎ ｅａ ｏ ｄＥ ｇｎ ｅｉ 。 ａ ｓ ｕＩ ｔ ｕｅｏ ｈ ｏｏ ｙ Ｃｈ ｏ Ｂｉ ｎ ｎ ｎ ｎ ｔ Ｔｅ ｎ ｓｕ １ ５ ０ Ｃｈｎ
大豆蛋白—壳聚糖共价复合物制备研究
粮食 与 油 脂
２１ 第 ８ ０ ０年 期
大 豆 蛋 白一 壳聚 王延 青 ， 胡婷婷 ， 贾祥祥 （ 南工业 大学粮 油食 品 学院 ， 河 南郑 州 ４ ０ ５ 河 ５ ０ ２）
摘 要： 通过 干热反应 将 壳寡糖 引入 大豆蛋 白， 成 大豆 蛋 白一 壳寡糖共 价 复合物 ， 用响应 面方 形 采 法对 大豆蛋 白一 壳寡糖 制备 奈件进 行 优化 ， 立 以乳化性 及乳 化稳 定性 为 响应值 回 归方程 。 以乳 建 化 性 为响应值 时 ， 化结 果 为 ： 应 时间 １． ｈ反 应 温度 ４ ．ｃ 壳聚糖 添加 量 ２ ．％；以乳 化稳 优 反 ０４ ， １ Ｃ， ２ ５７ 定性 为响 应值 时 ， 化 结果 为 ： 应 时间 ９６ ， 优 反 ．ｈ 反应 温度 ３ ． ： 壳聚糖 添加 量 ２ ． ８ｑ， ３ ６１ ％。 关键 词 ： 大豆蛋 白；壳聚糖 ； 豆蛋 白一壳聚糖 共价 复合物 大
Ａｂ ｔａ ｔ Ｓ ｙ ｅ ｎｐ ｒ ｔ ｓ ｌｔ ｓｒ ｃ ： ｏ ｂ ａ ｏ ｅｉ ｉｏ ａｅ（Ｓ Ｉ ｎ ｈｔ ｓ ｎ （ ｎ Ｐ ）ａ ｄ ｃ ｉ ａ ＣＨＩ） ｒ ｓ ｄ ａ ｈ ｉ ｔｒａｓｔ ｏ ｗｅｅ ｕ ｅ ｓｔ ｅｍａｎ ｍａｅ ｉｌ ｏ
ｐｅ ａｅ ｏ ｂ ａ ｏｅｎ ｃ ｉ ｓｎｃｎｕ ａ ｏ ｓ ｙｔｅｄｙ ｈ ａ ｒａｔ ｎ Ｒ ｓｏ ｓ ｒａｅ ｔｏ ｏｏ ｙ ｒｐ ｒ ｙ ｅｎｐ ｔｉ— ｈｔ ａ ｊｇｔ ｎ ｒ— ｅｔ ｅｃ ｏ ． ｅｐ ｎｅｓ ｆｃ ｈ ｄ ｌｇ ｓ ｒ ｏ ｏ ｉ ｂ ｈ ｉ ｕ ｍｅ ｗａ ｓｄｔ ｐｉ ｍ ｔｅｐｅ ａｉｇｃ ｎ ｉｏ ｓ ｆ ｏ ｂ ａ ｒｔｉ— ｈｔｓｎｃ ｎｕ ａｉｎ ， ｎ ｅ ｓ ｅ ｏ ｔ ｕ ｏ ｍｕ ｒｐ ｒ ｏ ｄｔ ｎ ｙ ｅｎｐｏｅｎ ｃ ｉ ａ ｏ ｊｇ ｔ ｓ ａ ｄｔ ｙ ｈ ｎ ｉ ｏｓ ｏ ｏ ｈ
小麦DREB4蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(３):９~１４ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０３.００２收稿日期:２０２２－０６－２８基金项目:山东省农业良种工程项目(２０１９ＬＺＧＣ０１７０２)ꎻ山东省自然科学基金青年项目(ＺＲ２０２０ＱＣ１１４)ꎻ国家自然科学基金青年项目(３２００１５４２)ꎻ山东省农业良种工程项目(２０２１ＬＺＧＣ０１３)ꎻ小麦玉米国家工程实验室开放课题(２０１８ＬＹＺＷＳ０６)作者简介:李永波(１９８６ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ助理研究员ꎬ主要从事小麦新品种培育研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｌｙｂ９２０３２７＠ｓｉｎａ.ｃｏｍ通信作者:樊庆琦(１９８０ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事小麦新品种培育研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｆａｎｑｉｎｇｑｉ＠１６３.ｃｏｍ楚秀生(１９６３ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ主要从事小麦新品种培育研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｘｓｃｈｕ２００７＠ｓｉｎａ.ｃｏｍ小麦ＤＲＥＢ４蛋白的原核表达及多克隆抗体制备李永波１ꎬ鲁琳１ꎬ方会见２ꎬ崔德周１ꎬ孟福燕３ꎬ黄琛１ꎬ隋新霞１ꎬ樊庆琦１ꎬ楚秀生１ꎬ４(１.山东省农业科学院作物研究所/黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室/山东省小麦技术创新中心/济南市小麦遗传改良重点实验室ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ２.山东鲁研良种有限公司ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ３.郓城县种子公司ꎬ山东郓城㊀２７４７００ꎻ４.烟台大学生命科学学院ꎬ山东烟台㊀２６４０００)㊀㊀摘要:ＤＲＥＢ(ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇ)转录因子在小麦非生物胁迫中起着非常重要的作用ꎬ但由于目前缺乏可识别小麦内源性ＤＲＥＢ蛋白的抗体ꎬ导致其在蛋白水平上的研究进展非常缓慢ꎮ本研究通过分析ＤＲＥＢ４Ａ㊁４Ｂ和４Ｃ三种蛋白序列ꎬ将ＤＲＥＢ４Ａ在大肠杆菌中进行表达ꎬ并利用纯化后的蛋白作为抗原免疫兔子ꎬ在国内外首次获得小麦ＤＲＥＢ４的多克隆抗体ꎮＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果证明ꎬ该抗体可特异性识别小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白ꎮ该抗体介导的免疫组织化学结果显示ꎬＤＲＥＢ４蛋白定位于细胞核内ꎮ本研究为深入研究植物ＤＲＥＢ信号通路提供了有力的检测工具ꎮ关键词:小麦ꎻ非生物胁迫ꎻＤＲＥＢ４转录因子ꎻ多克隆抗体中图分类号:Ｓ５１２.１:Ｑ７８６㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０３－０００９－０６ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＷｈｅａｔＤＲＥＢ４ＰｒｏｔｅｉｎＬｉＹｏｎｇｂｏ１ꎬＬｕＬｉｎ１ꎬＦａｎｇＨｕｉｊｉａｎ２ꎬＣｕｉＤｅｚｈｏｕ１ꎬＭｅｎｇＦｕｙａｎ３ꎬＨｕａｎｇＣｈｅｎ１ꎬＳｕｉＸｉｎｘｉａ１ꎬＦａｎＱｉｎｇｑｉ１ꎬＣｈｕＸｉｕｓｈｅｎｇ１ꎬ４(１.ＣｒｏｐＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＷｈｅａｔＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇｉｎＮｏｒｔｈｅｒｎＨｕａｎｇ￣ＨｕａｉＲｉｖｅｒＰｌａｉｎꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓ/ＳｈａｎｄｏｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｏｆＷｈｅａｔ/ＪｉｎａｎＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＷｈｅａｔＧｅｎｅｔｉｃＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｈａｎｄｏｎｇＬｕｙａｎＳｅｅｄＣｏ.ꎬＬｔｄ.ꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＹｕｎｃｈｅｎｇＣｏｕｎｔｒｙＳｅｅｄＣｏｍｐａｎｙꎬＹｕｎｃｈｅｎｇ２７４７００ꎬＣｈｉｎａꎻ４.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＹａｎｔａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＹａｎｔａｉ２６４０００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＤＲＥＢ(ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ￣ｂｉｎｄｉｎｇ)ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｐｌａｙｓａｖｅｒｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｗｈｅａｔａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ.ＨｏｗｅｖｅｒꎬｄｕｅｔｏｔｈｅｌａｃｋｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｈａｔｃａｎｒｅｃｏｇｎｉｚｅｗｈｅａｔｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＤＲＥＢｐｒｏｔｅｉｎꎬｉｔｓｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓａｔｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｉｓｖｅｒｙｓｌｏｗ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｂｙａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｒｅｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＤＲＥＢ４Ａꎬ４Ｂａｎｄ４ＣꎬｔｈｅＤＲＥＢ４ＡｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄｔｏｅｘｐｒｅｓｓｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉꎬａｎｄｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｕｓｅｄａｓａｎａｎｔｉｇｅｎｔｏｉｍｍｕｎｉｚｅｒａｂｂｉｔｓꎬｔｈｅｎｔｈｅｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｏｆｗｈｅａｔＤＲＥＢ４ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔｔｉｍｅａｔｈｏｍｅａｎｄａｂｒｏａｄ.ＴｈｅＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｕｌｄｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｒｅｃｏｇｎｉｚｅｗｈｅａｔｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＤＲＥＢ４ｐｒｏｔｅｉｎ.Ｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＤＲＥＢ４ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓ.Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅａｐｏｗｅｒｆｕｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｏｏｌｆｏｒｉｎ￣ｄｅｐｔｈｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｐｌａｎｔＤＲＥＢｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＷｈｅａｔꎻＡｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓꎻＤＲＥＢ４ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎻＰｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ㊀㊀干旱㊁盐㊁高温㊁冷等各种非生物胁迫会严重影响小麦产量ꎮＤＲＥＢ蛋白含有一个保守的ＡＰ２结构域ꎬ可以和顺式作用元件ＤＲＥ核心序列(Ａ/ＧＣＣＧＡＣ)发生特异性结合ꎬ通过在转录水平上调控下游基因的表达[１]ꎬ进而应对各种非生物胁迫ꎮ到目前为止ꎬＤＲＥＢ转录因子在拟南芥[２]㊁大豆[３]㊁水稻[４]㊁玉米[５]㊁大麦[６]和小麦[７]等多种植物中被鉴定出来ꎮＤＲＥＢ分为六大类(ＤＲＥＢ１~６)[８]ꎬ其中ꎬＤＲＥＢ１在拟南芥㊁水稻㊁玉米中主要应答冷胁迫[４]ꎬＤＲＥＢ２主要应答干旱㊁盐胁迫[９]ꎬＤＲＥＢ３参与ＡＢＡ和糖信号途径[１０]ꎬＤＲＥＢ４应答干旱㊁冷胁迫及在乙烯与茉莉酸途径中起作用[１１]ꎬＤＲＥＢ５参与应答干旱㊁冷胁迫[１２]ꎬＤＲＥＢ６应答干旱㊁盐胁迫[１３]ꎮ大量研究已验证了ＤＲＥＢ在植物应对非生物胁迫中的功能ꎮ如在小麦中过表达拟南芥ＤＲＥＢ１Ａ㊁大豆ＧｍＤＲＥＢ１或棉花ＧｈＤＲＥＢ基因ꎬ可通过提高根系活力㊁光合作用及渗透调节能力提高小麦的抗旱性[１４－１６]ꎻ在拟南芥中过表达大豆ＧｍＤＲＥＢ２㊁ＧｍＤＲＥＢ３或小麦ＴａＤＲＥＢ３基因ꎬ可提高拟南芥抗旱㊁耐盐㊁耐高温及抗冻性[１ꎬ１７ꎬ１８]ꎻ过表达ＧｍＤＲＥＢ６基因ꎬ可增强大豆的耐盐能力[１９]ꎮ然而ꎬ目前几乎所有关于ＤＲＥＢ的研究是集中在转录水平上的调控ꎬ缺乏蛋白质水平上的调控研究ꎬ且ＤＲＥＢ蛋白发挥生物学功能是否通过磷酸化㊁乙酰化等蛋白水平上的调控尚未可知ꎬ因此ꎬ研究识别内源性ＤＲＥＢ蛋白的特异性多克隆抗体ꎬ对于ＤＲＥＢ在蛋白水平的调控研究具有非常重要的意义ꎮ本研究通过对小麦中已有的ＤＲＥＢ４Ａ㊁４Ｂ和４Ｃ进行序列分析ꎬ选取ＤＲＥＢ４Ａ进行原核表达㊁纯化ꎬ并以其作为抗原ꎬ首次制备出可识别小麦内源ＤＲＥＢ４蛋白的多克隆抗体ꎬ以期为进一步研究植物ＤＲＥＢ４在蛋白水平上的调控机理提供方法学基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料供试小麦品种为济麦３７９ꎬ由山东省审定(鲁审麦２０２１００１７)ꎮ取其幼苗期根㊁叶为材料进行试验ꎮ１.２㊀ＤＲＥＢ４序列分析与合成本研究通过ＤＮＡＭＡＮ８软件对ＮＣＢＩ中提交的ＤＲＥＢ４Ａ(ＡＹ７８１３５４.１)㊁４Ｂ(ＡＹ７８１３５５.１)和４Ｃ(ＡＹ７８１３５６.１)序列进行分析ꎻＤＲＥＢ４Ａ序列的合成由北京擎科生物科技有限公司进行ꎮ１.３㊀ＤＲＥＢ４Ａ载体构建、原核表达及纯化将上述合成的ＤＲＥＢ４Ａ序列与大肠杆菌表达载体ＰＥＴ３０ａ通过同源重组的方法(ｐＥＡＳＹ®－ＢａｓｉｃＳｅａｍｌｅｓｓＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＡｓｓｅｍｂｌｙＫｉｔꎬＣＵ２０１－０２ꎬ北京全式金生物技术股份有限公司)连接ꎬ将连接产物转入ＤＨ５α(北京擎科生物科技有限公司)感受态细胞中ꎬ冰上放置１５ｍｉｎꎬ４２ħ水浴热激９０ｓꎬ再冰上放置２ｍｉｎꎬ加入１ｍＬ无任何抗生素的ＬＢ液体培养基ꎬ３７ħ㊁２１０ｒ/ｍｉｎ水平摇１ｈꎬ然后取１００μＬ菌液ꎬ涂于含有卡那霉素的ＬＢ固体培养基上ꎬ３７ħ过夜培养ꎮ挑取１０个单克隆进行ＰＣＲ检测ꎬ选取２个阳性信号最强的单克隆由北京擎科生物科技有限公司进行测序ꎬ对测序正确的单克隆进行摇菌㊁质粒提取(质粒小提试剂盒ꎬＤＰ１０３ꎬ北京天根生化科技有限公司)ꎮ将提取好的质粒转入ＢＬ２１(ＤＥ３)感受态细胞(ＣＤ７０１－０２ꎬ北京全式金生物技术股份有限公司)中ꎬ剩余步骤同ＤＨ５α感受态细胞转化ꎮ挑单克隆ꎬ置于５ｍＬＬＢ液体培养基中ꎬ３７ħ过夜培养ꎬ然后吸取１ｍＬ菌液ꎬ加入到３００ｍＬＬＢ液体培养基中进行扩大培养ꎬ待菌液ＯＤ值为０.６~０.８时ꎬ加入终浓度为５０ｍｍｏｌ/Ｌ的ＩＰＴＧ(Ｇ５０４２－１Ｇꎬ武汉塞维尔生物科技有限公司)进行诱导表达ꎬ２８ħ过夜培养ꎻ菌液于６０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ收集菌体沉淀ꎬ用１ˑＰＢＳ(ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａｌｉｎｅ)清洗沉淀１次ꎬ然后加入４０ｍＬ１ˑＰＢＳ重悬ꎬ超声破碎(开３ｓꎬ关３ｓꎻ共计３０ｍｉｎ)ꎬ６０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ分别将沉淀㊁上清液进行ＳＤＳ电泳检测ꎮ利用Ｈｉｓ标签蛋白纯化试剂盒(Ｐ２２２６ꎬ上海碧云天生物技术有限公司)对上清液进行纯化ꎬ然后置于透析袋中４ħ过夜透析ꎬ将透析后的蛋白置于０１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀－２０ħ保存备用ꎮ１.４㊀小麦ＤＲＥＢ４多克隆抗体制备选取实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔各１只ꎬ饲养体重至１~２ｋｇ时ꎬ用注射器将充分混匀的１ｍＬ完全弗氏佐剂(液体石蜡ʒ羊毛脂＝２ʒ１)和０.３ｍｇＤＲＥＢ４Ａ融合蛋白对每只兔子进行皮下注射第１针ꎬ标记为第１天ꎻ第１２天ꎬ将充分混匀的１ｍＬ不完全弗氏佐剂(完全弗氏佐剂＋终浓度２０ｍｇ/ｍＬ的卡介苗)和０.１５ｍｇ融合蛋白对每只兔子进行皮下注射第２针ꎻ第２６天ꎬ将充分混匀的１ｍＬ不完全弗氏佐剂和０.１５ｍｇ融合蛋白对每只兔子进行肌肉注射第３针ꎻ第４０天ꎬ将充分混匀的１ｍＬ不完全弗氏佐剂和０.１５ｍｇ融合蛋白对每只兔子进行肌肉注射第４针ꎻ第５３天ꎬ取兔子血清进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证ꎮ１.５㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析利用植物组织蛋白裂解液提取小麦幼苗期根㊁叶部的总蛋白(植物蛋白提取试剂盒ꎬＣＷ０８８５ꎬ康为世纪生物技术有限公司)ꎬ配制１５％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳ꎻ通过湿法转膜ꎬ将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素薄膜上ꎬ然后将膜放入含有２％脱脂奶粉的ＴＢＳ(２５ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌꎬ１３７ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ)中ꎬ封闭１ｈꎻ加入ＤＲＥＢ４多克隆抗体(１ʒ１０００稀释于２％脱脂奶粉中)ꎬ４ħ过夜ꎻ用ＴＢＳＴ(ＴＢＳ＋２０％吐温－２０)洗涤３次后ꎬ向封闭液中加入碱性磷酸酶(ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅꎬＡＰ)标记的二抗ꎬ缓慢摇动２４ｈꎬ然后ＴＢＳＴ洗涤３次ꎬ每次１０ｍｉｎꎻ最后用发色液(ＴＢＳ１０ｍＬꎬ５％ＮＢＴ４５μＬꎬ５％ＢＣＩＰ３５μＬ)进行发色ꎮ１.６㊀免疫组织化学法进行亚细胞定位将小麦叶片下表皮撕下ꎬ置于４％多聚甲醛中ꎬ室温放置２４ｈꎬ弃掉多聚甲醛ꎬ用１ˑＰＢＳ清洗３次ꎬ加入２％脱脂奶粉于３７ħ封闭３０ｍｉｎꎬ然后在４ħ下加入ＤＲＥＢ４多克隆抗体(１ʒ２００稀释于２％脱脂奶粉中)过夜ꎻ用ＰＢＳ洗涤３次后ꎬ加入１μＬ二抗(山羊抗兔－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５抗体)和１０ｍＬＢＳＡꎬ３７ħ继续孵育１ｈꎬ然后用ＴＢＳ清洗３次ꎬ在室温下用４ᶄꎬ６－二脒基－２－苯基吲哚(ＤＡ￣ＰＩꎬＡｎａＳｐｅｃＩｎｃ.ꎬＳａｎＪｏｓｅꎬＣＡꎬＵＳＡ)染色１０ｍｉｎꎬ然后用ＴＢＳ清洗３次ꎬ置于荧光显微镜(ＨＴ７７００ꎬＨｉｔａｃｈｉꎬＴｏｋｙｏꎬＪａｐａｎ)下观察并拍照ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀小麦ＤＲＥＢ４序列分析在普通小麦中ꎬＤＲＥＢ４存在ＤＲＥＢ４Ａ㊁４Ｂ㊁４Ｃ三种转录本ꎬ其中ꎬＤＲＥＢ４Ａ编码３９４个氨基酸ꎬ分子量为４２.８ｋＤａꎻＤＲＥＢ４Ｂ编码３４６个氨基酸ꎬ分子量为３７.７ｋＤａꎻＤＲＥＢ４Ｃ编码６８个氨基酸ꎬ分子量为７.１ｋＤａ(图１)ꎮ三个蛋白氨基酸序列的保守性为６１.２８％ꎬ第１~２５位的氨基酸完全一致ꎬ其中ꎬＤＲＥＢ４Ｂ除第２６~７３位氨基酸缺失外ꎬ其它位置的氨基酸与ＤＲＥＢ４Ａ完全一致ꎮＤＲＥＢ４Ａ㊁４Ｂ和４Ｃ存在序列间的差异ꎬ可能是应对不同非生物胁迫产生的可变剪切所致ꎮ图中深蓝色区域为保守区域ꎮ图１㊀普通小麦ＤＲＥＢ４Ａ、４Ｂ和４Ｃ的氨基酸序列分析２.２㊀小麦ＤＲＥＢ４Ａ的原核表达鉴于ＤＲＥＢ４Ａ的氨基酸序列最长ꎬ选其进行后续分析ꎮ首先ꎬ将人工合成的ＤＲＥＢ４Ａ序列与表达载体ＰＥＴ３０ａ连接后ꎬ在大肠杆菌中进行表达ꎬ上清液中的蛋白纯化后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测ꎮ结果显示ꎬ在大约５０ｋＤａ处出现清晰的蛋白条带(图２)ꎬ与预期的蛋白分子量相符ꎬ表明ＤＲＥＢ４Ａ成功表达ꎮ１１㊀第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀李永波ꎬ等:小麦ＤＲＥＢ４蛋白的原核表达及多克隆抗体制备图２㊀小麦ＤＲＥＢ４Ａ的原核表达及纯化２.３㊀ＤＲＥＢ４多克隆抗体的制备本研究以上述获得的纯化ＤＲＥＢ４Ａ融合蛋白为抗原免疫兔子ꎬ从兔血清中获取了ＤＲＥＢ４多克隆抗体ꎮＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示ꎬ该抗体在目的蛋白位置清楚地识别到ＤＲＥＢ４Ａ蛋白(图３)ꎮ图３㊀ＤＲＥＢ４多克隆抗体对ＤＲＥＢ４Ａ融合蛋白的识别２.４㊀ＤＲＥＢ４多克隆抗体对小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白的识别及特异性检测为了进一步验证该抗体能否识别小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白ꎬ分别提取小麦苗期根㊁叶总蛋白进行免疫识别ꎮＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示ꎬ仅在３７ｋＤａ处检测到清晰的蛋白条带ꎬ这与预测的ＤＲＥＢ４Ｂ蛋白分子量一致(图４)ꎮ表明该抗体可以识别小麦内源性ＤＲＥＢ４Ｂ蛋白ꎬ而且特异性好ꎬ可以用于后续植物ＤＲＥＢ分子机理的相关研究ꎮ图４㊀小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白检测２.５㊀ＤＲＥＢ４亚细胞定位分析ＤＲＥＢ４定位于细胞核中(图５)ꎬ与前人报道的ＤＲＥＢ转录因子核定位的结果一致[２０]ꎬ进一步证实了该抗体特异性较好ꎬ可用于开展免疫组织或细胞化学研究的可行性ꎮ对照为前血清ꎮ图５㊀利用免疫组织化学法进行的㊀㊀㊀ＤＲＥＢ４亚细胞定位分析结果３㊀讨论与结论ＤＲＥＢ是一类抗非生物胁迫的转录因子ꎬ目前主要用于抗逆转基因植物的培育及相关分子机理的解析[２１]ꎮ小麦ＤＲＥＢ４蛋白是一种对动物和人类无危害的蛋白ꎬ将其用于粮食作物抗逆性转基因改良有着广阔的市场前景[２２]ꎮＤＲＥＢ４在小麦中存在三种转录形式(ＤＲＥＢ４Ａ㊁４Ｂ和４Ｃ)[２３]ꎬ其中ꎬＤＲＥＢ４Ａ编码的多肽链最长ꎬ涵盖的蛋白信２１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀息最丰富ꎬ推测由此蛋白作为抗原产生的抗体可识别ＤＲＥＢ４的所有三种形式ꎬ因此本研究利用ＤＲＥＢ４Ａ蛋白作为抗原ꎬ进行了ＤＲＥＢ４多克隆抗体的制备ꎮ经过抗原上清蛋白的纯化㊁免疫注射ꎬ最终研制出能识别小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白的多克隆抗体ꎮ尽管从植物中已克隆出多种类型的ＤＲＥＢ基因ꎬ但由于其抗体类型匮乏以及识别内源性蛋白抗体的空白ꎬ导致有关ＤＲＥＢ在蛋白水平上的调控机理研究进展相对缓慢ꎮ目前ꎬ只有拟南芥ＤＲＥＢ１Ａ的抗体制备成功ꎬ且仅对大肠杆菌中表达的拟南芥ＤＲＥＢ１Ａ融合蛋白进行了检测[２４]ꎮ本研究首次开发了特异性识别小麦内源ＤＲＥＢ４蛋白的多克隆抗体ꎬ既丰富了植物ＤＲＥＢ的抗体类型ꎬ也为进一步推动ＤＲＥＢ在蛋白水平上的研究提供了方法学基础ꎮ利用本研究制备的ＤＲＥＢ４多克隆抗体检测小麦苗期根㊁叶内源性ＤＲＥＢ４蛋白时ꎬ仅识别到了ＤＲＥＢ４Ｂ蛋白条带ꎬ与预测的该抗体能识别小麦中ＤＲＥＢ４三种蛋白形式的结果不一致ꎬ这可能是因为ＤＲＥＢ４具有组织器官以及不同发育阶段表达特异性ꎬ在小麦苗期根㊁叶中主要以ＤＲＥＢ４Ｂ的形式表达ꎬ而在花㊁籽粒等其它组织器官以及不同发育阶段中则以其它形式表达ꎻ另外ꎬＤＲＥＢ４在不同小麦品种中的表达形式也可能存在一定的差异ꎬ本研究所用小麦品种济麦３７９为抗旱节水型品种ꎬ在其苗期根㊁叶中主要以ＤＲＥＢ４Ｂ的形式表达ꎬ但在其它类型的小麦品种中以哪种形式表达还有待进一步研究ꎮ传统ＤＲＥＢ基因亚细胞定位是采用构建ＤＲＥＢ－ＧＦＰ过表达载体转入组织或细胞中的方法进行定位[２０]ꎬ而本研究是利用该抗体对内源ＤＲＥＢ４进行免疫定位ꎬ与传统方法相比可避免因过表达造成目的蛋白移位的现象ꎮ综上所述ꎬ本研究通过对ＤＲＥＢ４Ａ进行大肠杆菌表达㊁纯化ꎬ并以此作为抗原成功制备出可识别小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白的高度特异性多克隆抗体ꎬ可为深入研究植物ＤＲＥＢ４在蛋白水平上参与非生物胁迫的调控机理奠定方法学基础ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＮｉｕＸꎬＬｕｏＴꎬＺｈａｏＨꎬｅｔａｌ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｗｈｅａｔＤＲＥＢｇｅｎｅｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＴａＤＲＥＢ３ｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓ[Ｊ].Ｇｅｎｅꎬ２０２０ꎬ７４０:１４４５１４. [２]㊀ＳｔｏｃｋｉｎｇｅｒＥＪꎬＧｉｌｍｏｕｒＳＪꎬＴｈｏｍａｓｈｏｗＭＦ.ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＣＢＦ１ｅｎｃｏｄｅｓａｎＡＰ２ｄｏｍａｉｎ￣ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣ｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒｔｈａｔｂｉｎｄｓｔｏｔｈｅＣ￣ｒｅｐｅａｔ/ＤＲＥꎬａｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇＤＮＡｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｔｈａｔｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｒｅ￣ｓｐｏｎｓｅｔｏｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｗａｔｅｒｄｅｆｉｃｉｔ[Ｊ].Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡꎬ１９９７ꎬ９４(３):１０３５－１０４０. [３]㊀ＭｉｚｏｉＪꎬＯｈｏｒｉＴꎬＭｏｒｉｗａｋｉＴꎬｅｔａｌ.ＧｍＤＲＥＢ２Ａꎻ２ꎬａｃａｎｏｎｉｃａｌＤＥＨＹＤＲＡＴＩＯＮ￣ＲＥＳＰＯＮＳＩＶＥＥＬＥＭＥＮＴ￣ＢＩＮＤＩＮＧＰＲＯＴＥＩＮ２￣ｔｙｐｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎｓｏｙｂｅａｎꎬｉｓｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙｒｅｇｕ￣ｌａｔｅｄａｎｄｍｅｄｉａｔｅｓｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ.ꎬ２０１３ꎬ１６１(１):３４６－３６１.[４]㊀ＤｕｂｏｕｚｅｔＪＧꎬＳａｋｕｍａＹꎬＩｔｏＹꎬｅｔａｌ.ＯｓＤＲＥＢｇｅｎｅｓｉｎｒｉｃｅꎬＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ.ꎬｅｎｃｏｄｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒｓｔｈａｔｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｄｒｏｕｇｈｔ￣ꎬｈｉｇｈ￣ｓａｌｔ￣ａｎｄｃｏｌｄ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪ.ꎬ２００３ꎬ３３(４):７５１－７６３.[５]㊀ＱｉｎＦꎬＫａｋｉｍｏｔｏＭꎬＳａｋｕｍａＹꎬｅｔａｌ.Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ￣ａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆＺｍＤＲＥＢ２ＡｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｈｅａｔｓｔｒｅｓｓｅｓｉｎＺｅａｍａｙｓＬ.[Ｊ].ＰｌａｎｔＪ.ꎬ２００７ꎬ５０(１):５４－６９. [６]㊀ＸｕｅＧＰ.ＡｎＡＰ２ｄｏｍａｉｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＨｖＣＢＦ１ａｃｔｉ￣ｖａｔｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｏｌｄ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｓｉｎｂａｒｌｅｙｔｈｒｏｕｇｈｉｎ￣ｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈａ(Ｇ/ａ)(Ｃ/ｔ)ＣＧＡＣｍｏｔｉｆ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｉｍ.Ｂｉｏ￣ｐｈｙｓ.Ａｃｔａꎬ２００２ꎬ１５７７(１):６３－７２.[７]㊀ＳｈｅｎＹＧꎬＺｈａｎｇＷＫꎬＨｅＳＪꎬｅｔａｌ.ＡｎＥＲＥＢＰ/ＡＰ２￣ｔｙｐｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍｗａｓａＤＲＥ￣ｂｉｎｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎｄｕｃｅｄｂｙｃｏｌｄꎬｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎａｎｄＡＢＡｓｔｒｅｓｓ[Ｊ].Ｔｈｅｏｒ.Ａｐｐｌ.Ｇｅｎｅｔ.ꎬ２００３ꎬ１０６(５):９２３－９３０.[８]㊀ＳａｋｕｍａＹꎬＬｉｕＱꎬＤｕｂｏｕｚｅｔＪＧ.ＤＮＡ￣ｂｉｎｄｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅＥＲＦ/ＡＰ２ｄｏｍａｉｎｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＲＥＢｓꎬｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃ￣ｔｏｒｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ￣ａｎｄｃｏｌｄ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍｕｎ.ꎬ２００２ꎬ２９０(３):９９８－１００９.[９]㊀ＣｈｅｎＨꎬＬｉｕＬꎬＷａｎｇＬꎬｅｔａｌ.ＶｒＤＲＥＢ２ＡꎬａＤＲＥＢ￣ｂｉｎｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｆｒｏｍＶｉｇｎａｒａｄｉａｔａꎬｉｎｃｒｅａｓｅｄｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｈｉｇｈ￣ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].Ｊ.ＰｌａｎｔＲｅｓ.ꎬ２０１６ꎬ１２９(２):２６３－２７３.[１０]ＮｉｕＸꎬＨｅｌｅｎｔｊａｒｉｓＴꎬＢａｔｅＮＪ.ＭａｉｚｅＡＢＩ４ｂｉｎｄｓｃｏｕｐｌｉｎｇｅｌ￣ｅｍｅｎｔ１ｉｎａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄａｎｄｓｕｇａｒｒｅｓｐｏｎｓｅｇｅｎｅｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２００２ꎬ１４(１０):２５６５－２５７５.[１１]ＳｕｎＳꎬＹｕＪＰꎬＣｈｅｎＦꎬｅｔａｌ.ＴＩＮＹꎬａｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ(ＤＲＥ)￣ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ￣ｌｉｋｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｃｏｎ￣ｎｅｃｔｉｎｇｔｈｅＤＲＥ￣ａｎｄｅｔｈｙｌｅｎｅ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２００８ꎬ２８３(１０):６２６１－６２７１.[１２]ＤｏｎｇＣＪꎬＬｉｕＪＹ.ＴｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＥＡＲ￣ｍｏｔｉｆ￣ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏ￣ｔｅｉｎＲＡＰ２.１ｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｓａｎａｃｔｉｖｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｐｒｅｓｓｏｒｔｏｋｅｅｐｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｎｄｅｒｔｉｇｈｔｃｏｎｔｒｏｌ[Ｊ].ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌ.ꎬ２０１０ꎬ１０:４７.３１㊀第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀李永波ꎬ等:小麦ＤＲＥＢ４蛋白的原核表达及多克隆抗体制备[１３]ＬｉｎＲＣꎬＰａｒｋＨＪꎬＷａｎｇＨＹ.ＲｏｌｅｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＲＡＰ２.４ｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｌｉｇｈｔ￣ａｎｄｅｔｈｙｌｅｎｅ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｐｒｏｃｅｓ￣ｓｅｓａｎｄｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｐｌａｎｔꎬ２００８ꎬ１(１):４２－５７.[１４]ＰｅｌｌｅｇｒｉｎｅｓｃｈｉＡꎬＲｅｙｎｏｌｄｓＭꎬＰａｃｈｅｃｏＭꎬｅｔａｌ.Ｓｔｒｅｓｓ￣ｉｎ￣ｄｕｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｗｈｅａｔｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＤＲＥＢ１Ａｇｅｎｅｄｅｌａｙｓｗａｔｅｒｓｔｒｅｓｓｓｙｍｐｔｏｍｓｕｎｄｅｒｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｇｅｎｏｍｅꎬ２００４ꎬ４７(３):４９３－５００.[１５]ＺｈｏｕＹꎬＣｈｅｎＭꎬＧｕｏＪꎬｅｔａｌ.ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｏｙｂｅａｎＤＲＥＢ１ｅｎｈａｎｃｅｓｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｗｈｅａｔｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄ[Ｊ].Ｊ.Ｅｘｐ.Ｂｏｔ.ꎬ２０２０ꎬ７１(６):１８４２－１８５７. [１６]刘洋洋ꎬ郭栋ꎬ楚秀生ꎬ等.转ＤＲＥＢ基因小麦新品系抗旱生理指标测定[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０１３ꎬ４５(３):３８－４１. [１７]ＣｈｅｎＭꎬＸｕＺꎬＸｉａＬꎬｅｔａｌ.Ｃｏｌｄ￣ｉｎｄｕｃｅｄｍｏｄｕｌａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｅｓｏｆｔｈｅＤＲＥ￣ｂｉｎｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｇｅｎｅꎬＧｍＤＲＥＢ３ꎬｉｎｓｏｙｂｅａｎ(ＧｌｙｃｉｎｅｍａｘＬ.)[Ｊ].Ｊ.Ｅｘｐ.Ｂｏｔ.ꎬ２００９ꎬ６０(１):１２１－１３５.[１８]ＣｈｅｎＭꎬＷａｎｇＱＹꎬＣｈｅｎｇＸＧꎬｅｔａｌ.ＧｍＤＲＥＢ２ꎬａｓｏｙｂｅａｎＤＲＥ￣ｂｉｎｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎬｃｏｎｆｅｒｒｅｄｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｈｉｇｈ￣ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍｕｎ.ꎬ２００７ꎬ３５３(２):２９９－３０５.[１９]ＴｕＴＱꎬＶａｃｉａｘａＰꎬＬｏＴＴＭꎬｅｔａｌ.ＧｍＤＲＥＢ６ꎬａｓｏｙｂｅａｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎬｎｏｔａｂｌｙａｆｆｅｃｔｓｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆｔｈｅＮｔＰ５ＣＳａｎｄＮｔＣＬＣｇｅｎｅｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｓａｕｄｉ.Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｓｃｉ.ꎬ２０２１ꎬ２８(１２):７１７５－７１８１.[２０]倪志勇.小麦ＤＲＥＢ转录因子的分子生物学特性分析及功能鉴定[Ｄ].杨凌:西北农林科技大学ꎬ２００８.[２１]ＳａｒｋａｒＴꎬＴｈａｎｋａｐｐａｎＲꎬＭｉｓｈｒａＧＰꎬｅｔａｌ.ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｕｓｅｏｆＤＲＥＢｆｏｒｉｍｐｒｏｖｅｄａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒ￣ａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｃｒｏｐｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＰｌａｎｔｓꎬ２０１９ꎬ２５(６):１３２３－１３３４.[２２]ＣａｏＢꎬＨｅＸꎬＬｕｏＹꎬｅｔａｌ.Ｓａｆｅｔｙａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ￣ｂｉｎｄｉｎｇ(ＤＲＥＢ)４ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥ.ｃｏｌｉ[Ｊ].ＦｏｏｄａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ５０(１１):４０７７－４０８４.[２３]徐兆师.小麦抗逆相关转录因子基因的克隆与鉴定[Ｄ].北京:中国农业科学院ꎬ２００５.[２４]范玉清ꎬ刘恒ꎬ任伟.拟南芥ＤＲＥＢ１Ａ转录因子的原核表达和多克隆抗体制备[Ｊ].植物生理学通讯ꎬ２００７ꎬ４３(３):５３３－５３７.４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀。
多肽的合成后加工与转运
（取自网络图片资源）
练习题
• 请回答mRNA、tRNA、rRNA的结构特点和主要 功能。
• 遗传密码子的主要特点有哪些？
• 计算合成由100个氨基酸组成的一条肽链，至少需 要消耗多少高能磷酸键？
• 什么是信号肽？有什么结构上的特点？它的功能 是什么？
亚基聚合、辅基连接、疏水脂链的共价连接等。
胰岛素原（86肽）
A肽（21）
C肽（33）
B肽（30）
S
S
S
胰岛素（51肽） 胰岛素的翻译后加工
（三）、蛋白质的转运
• 蛋白质的靶向输送
将蛋白质定向输送到最终发挥生物功能的细 胞靶部位过程称为蛋白质靶向输送，也称定位。
不同类型的蛋白质其定位机制不同,要通过特定 的转运系统才能运输到各自部位。整个过程主要通 过肽链的特异氨基酸信号序列引导完成。
① 去甲酰化：
fMet-肽
甲酰化酶
甲酸 + Met-肽
② 去蛋氨酰基：
蛋氨酸氨基肽酶
Met-肽
Met + 肽
2、氨基酸的修饰： 由专一性的酶催化修饰，包括糖基化、羟基化、
磷酸化、甲酰化等。 3、多肽链的水解修饰： 由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除。 4、二硫键的形成： 由专一性的氧化酶催化，将-SH氧化为-S-S-。 5、高级结构的修饰:
生命科学学院生物化学教研室
蛋白质生物合成
主讲人： 宋 慧
主要内容
☆ 蛋白质合成体系 ☆ 蛋白质合成过程 ☆ 蛋白质合成后加工与转运
•翻译：蛋白质的生物合成，即翻译。是将mRNA中
4种核苷酸的排列序列，通过遗传密码破译的方式解读 为蛋白质中氨基酸排列顺序的过程 。
蛋白质自组装的机制和调控
蛋白质自组装的机制和调控蛋白质自组装，是指一种自然界中普遍存在的现象。
在无外界干预的情况下，蛋白质分子通过静电相互作用、氢键键合、范德华力等相互作用力发生的全息性加性作用，即可自发地形成特定的结构。
蛋白质的自组装机制和调控在现代生物学、材料科学等领域具有极为重要的意义。
蛋白质自组装机制的基本原理是通过氢键与范德华力的相互作用驱动蛋白质间的分子间力作用。
氢键是指在蛋白质分子中，带有电负性较大的原子与带有电荷正性的原子之间，通过共享氢原子所形成的一种氢键作用。
如羟基、胺基等化合物上的氢原子都可以与另一分子上的氧、氮等原子形成氢键，进而加强分子之间的物理互作用。
范德华力是一种分子间非共价力，是因为偶极子、感生偶极子、瞬时偶极子、极性分子之间的非共价吸引而引起的。
蛋白质分子间的范德华力作用可以发生在任何距离之间，是蛋白质自组装所必需的一种重要作用力。
在自组装初期，蛋白质分子并不是随机地聚合在一起，而是根据其亲水性和疏水性，形成了很多小团块，逐渐聚合形成一个大的分子聚集体。
这些小团块称为核心区域。
核心区域在自组装过程中逐渐壮大，成为分子聚集体的主体。
通过静电相互作用、氢键键合、范德华力等相互作用力作用，核心区域将相互结合在一起并增长。
当一定大小的核的聚集体形成后，聚集体自发地向周围进行扩散，逐渐形成类似雪花的晶体结构。
蛋白质自组装的过程受到多种因素的调控。
首先，温度的变化可以直接影响分子的热运动，改变蛋白质自组装的速率和动力学。
其次，离子浓度的增加可以阻抑蛋白质自组装的速率，因为离子的存在会减弱分子间的相互作用力。
此外，还有pH值、水的浓度等因素也都会对蛋白质自组装产生影响。
蛋白质自组装机制和调控在许多领域中发挥着重要作用。
在生物学和医学中，研究蛋白质自组装对于研究生物大分子的结构和功能，以及生物大分子相关疾病的发病机理有着重要的意义。
例如，淀粉样蛋白沉积病的发病机理与蛋白质自组装过程密切相关。
此外，利用蛋白质自组装特性，可以制备出一系列高性能材料，如纳米颗粒、超级分子、生物传感器等，广泛应用于电子、光电子、信息技术、医学等领域。
人教版生物选修3专题1、4《蛋白质工程的崛起》名师课件
( 38°54′ N, 121°35′ E )
12、不要像个落难者，告诉别人你的不幸。逢人只说三分话，不可全抛一片心。
13、人生的路，靠的是自己一步步去走，真正能保护你的，是你自己的选择。而真正能伤害你的，也是一样，自己的选择。
14、不要那么敏感，也不要那么心软，太敏感和太心软的人，肯定过得不快乐，别人随便的一句话，你都要胡思乱想一整天。
4、有些路看起来很近，可是走下去却很远的，缺少耐心的人永远走不到头。人生，一半是现实，一半是梦想。
5、你心里最崇拜谁，不必变成那个人，而是用那个人的精神和方法，去变成你自己。
6、过去的事情就让它过去，一定要放下。学会狠心，学会独立，学会微笑，学会丢弃不值得的感情。
7、成功不是让周围的人都羡慕你，称赞你，而是让周围的人都需要你，离不开你。
酸序列与胰制岛备素B链的B28-B29相比，发生颠倒。因此， 将效胰胰岛岛素素。B方链该改案速为效B胰28岛赖素氨已酸通-B过2临9脯床氨实酸验，。获得单体速
二、蛋白质工程的基本原理
基因修饰主要是指利用生物化学方法修改
DNA序列，将目的基因片段导入宿主细胞内，
资料：基因修饰
或者将特定基因片段从基因组中删除，从而达 到改变宿主细胞基因型或者使得原有基因型得
到加强的作用。基因修饰目前已经广泛应用于
人类生活的各个领域，例如，在医学上，可以
利用基因修饰的方法抑制某些病毒类宿主细胞
内的病毒复制，从而达到治疗的目的；在农业
上，利用基因修饰的方法，人们已经成功地改
变了农作物和畜禽的生产特性，从而达到改良
以及传播优良品种的目的。
任务一
任务二
任务三
任务四
任务五
任务六
身体健康，学习进步。 8、生活本来很不易，不必事事渴求别人的理解和认同，静静的过自己的生活。心若不动，风又奈何。你若不伤，岁月无恙。
蛋白质合成与翻译调控的分子生物学研究方法
蛋白质合成与翻译调控的分子生物学研究方法蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它们在细胞中扮演着重要的角色。
蛋白质的合成和翻译调控是分子生物学研究的重要方向之一。
本文将介绍蛋白质合成和翻译调控的分子生物学研究方法。
一、蛋白质合成的分子生物学研究方法1. 蛋白质合成的体外翻译系统体外翻译系统是一种在离体条件下合成蛋白质的方法。
它可以用来研究蛋白质合成的机制、调控和功能。
体外翻译系统通常由细胞提取物、核酸、氨基酸、能量和其他必需的因子组成。
这些因子可以在离体条件下模拟细胞内的蛋白质合成过程。
2. 蛋白质合成的体内研究方法体内研究方法是通过对活体细胞中蛋白质合成的研究来了解蛋白质合成的机制和调控。
这些方法包括放射性同位素标记、荧光标记、质谱分析和基因敲除等技术。
这些技术可以用来研究蛋白质的合成速率、稳定性和功能。
二、翻译调控的分子生物学研究方法1. 转录后修饰转录后修饰是指在RNA转录后对RNA分子进行修饰的过程。
这些修饰可以影响RNA的稳定性、转运和翻译。
转录后修饰包括剪接、RNA编辑、RNA甲基化和RNA降解等。
2. 转录后调控转录后调控是指在RNA转录后对RNA分子进行调控的过程。
这些调控可以影响RNA的翻译速率和效率。
转录后调控包括RNA结构、RNA结合蛋白和RNA干扰等。
3. 翻译后修饰翻译后修饰是指在蛋白质合成后对蛋白质分子进行修饰的过程。
这些修饰可以影响蛋白质的稳定性、功能和互作。
翻译后修饰包括磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化等。
4. 翻译后调控翻译后调控是指在蛋白质合成后对蛋白质分子进行调控的过程。
这些调控可以影响蛋白质的稳定性、功能和互作。
翻译后调控包括蛋白质结构、蛋白质结合蛋白和蛋白质降解等。
三、总结蛋白质合成和翻译调控是分子生物学研究的重要方向之一。
体外翻译系统和体内研究方法可以用来研究蛋白质合成的机制、调控和功能。
转录后修饰、转录后调控、翻译后修饰和翻译后调控是研究翻译调控的重要方法。
【初中生物】中科院：预处理显著提高蛋白质鉴定率
【初中生物】中科院：预处理显著提高蛋白质鉴定率2021年11月30日，国际学术期刊《分子与细胞蛋白质组学》molecular&cellularproteomics在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所系统生物学重点实验室曾嵘研究组与美国范德堡大学定量科学中心石瑜研究组的最新合作研究成果，揭示了稳定同位素化学标记高精度质谱数据中高丰度、高频率噪音离子的去除可以显著提高蛋白质鉴定率。
在定量蛋白质组学研究中，稳定同位素标记结合高精度质谱仪可以在一次实验中对多个样品进行相对定量比较。
该策略比未标记量化具有更高的准确性。
另一方面，与SILAC等体内标记方法相比，体外化学标记具有更高的样本通量和通用性，这使得体外化学标记在定量蛋白质组学中得到广泛应用。
对于通过该策略获得的肽二级质谱，报告离子用于定量，而其他离子用于识别肽。
然而，报告的离子及其相关离子不包含肽序列信息，这将降低数据库搜索和识别的灵敏度和准确性。
由于定量是基于数据库识别的，因此在数据库搜索之前对质谱数据进行预处理尤为重要。
在曾嵘研究员和石瑜教授的共同指导下，盛泉虎，李荣霞和戴捷等人对稳定同位素化学标记数据首先进行了高丰度、高频率离子的分析，然后进行了16种不同组合的数据预处理，最后用5种不同搜索引擎进行了数据库搜索分析。
研究表明，在高精度质谱数据中，存在大量稳定同位素标签相关的高丰度、高精度离子。
结合各种预处理方法，判别和去除这些离子可以提高四标数据16.3%的鉴定谱图，13.9%的鉴定肽段以及6.6%的双肽段鉴定蛋白质。
对于八标复杂数据，预处理方法则可提高50.2%的鉴定谱图，39.5%的鉴定肽段以及25.2%的双肽段鉴定蛋白质。
这表明，标记通道的增加，在提高样品通量的同时，也引入了更多的伴生离子，判别和去除这些离子可以更显著提高鉴定的敏感性。
曾荣研究集团以组学大数据和系统生物学平台为基础，经过多年的努力，自主开发了一系列蛋白质组学数据分析技术。
荧光共振能量转移(FRET)体系的构建及其验证
荧光共振能量转移(FRET)体系的构建及其验证钱月娇;冯钰斌;钱学文;朱传君;李鸽;卢多;陈飞虎【摘要】目的构建携带FRET体系( YFP-CFP对)的一组原核表达工程质粒,在大肠杆菌( E. coli)中高效表达后,验证该体系FRET信号作为细胞内监测蛋白相互作用指标的可行性.方法分别构建 N端、C端以及两端分别编码 YFP和(或) CFP 的 6 个原核表达工程质粒: pNYFP、 pCYFP、pNCFP、 pCCFP、 pYFP-CFP、 pCFP-YFP.设计 YFP-CFP 和CFP-YFP作为阳性对照,而等量的YFP与CFP混合的体系(YFP + CFP)作为阴性对照.将过表达的工程蛋白通过镍柱、分子筛层析柱进行初步纯化后使用酶标仪检测相同摩尔浓度纯化蛋白的FRET信号.在此基础上,进一步用酶标仪检测表达工程蛋白的菌液中的FRET信号.结果通过测序验证,成功构建了6个原核表达的工程质粒.酶标仪检测的结果显示在体外纯化蛋白条件和菌液条件下均可产生明确的FRET信号.结论成功构建了FRET体系的原核表达工程质粒,不仅验证了蛋白条件下的可行性,而且验证了菌液条件下的可行性,为在活细胞条件下对蛋白-蛋白相互作用进行实时的动态研究,提供一个非常便利的实验方法.【期刊名称】《安徽医科大学学报》【年(卷),期】2018(053)012【总页数】7页(P1821-1827)【关键词】荧光共振能量转移;蛋白-蛋白相互作用;活细胞;原核表达;工程质粒;蛋白纯化【作者】钱月娇;冯钰斌;钱学文;朱传君;李鸽;卢多;陈飞虎【作者单位】安徽医科大学药学院,合肥 230032;安徽医科大学药学院,合肥230032;安徽医科大学药学院,合肥 230032;安徽医科大学药学院,合肥 230032;安徽医科大学药学院,合肥 230032;中国医学科学院药物研究所,北京协和医学院,北京100032;安徽医科大学药学院,合肥 230032【正文语种】中文【中图分类】R966荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)，是较早发展起来的一门技术[1]。
山东省淄博市淄川般阳中学高中生物 第四章 第一节 基因指导蛋白质的合成课件2 新人教版必修2
7min+8min
小组合作一
3.成果展示、汇报交流
小组 展示
组间 交流
教师 指导
正确 结论
会出现两条不同 序列的肽链
发现
追 问
理解
转录的模板是 DNA的一条链
都合理吗？
2.自主探究、合作学习 （二）遗传信息的转录和翻译
小组合作二
给予学生素材： 已知序列的多肽链，1空白DNA，1空白mRNA链，若干空白tRNA 要求：根据知识，利用该多肽链，推出原始DNA链
过程与方法： 比较转录和翻译，运用数学方法， 分析碱基与氨基酸的对应关系
情感态度和价值观： 体验基因表达过程的和谐美，基因表 达原理的逻辑美和简约美
重点：遗传信息的转录和翻译过程 难点：遗传信息的翻译过程
二、学情分析
知识
1.分泌蛋白的合成 2.核酸的知识储备 3.DNA结构与复制 4.基因的相关知识
D.3000和6000
补充 对密码子表 做补充
四、教学过程 1.创设情境、导入新课 2.自主探究、合作学习 3.成果展示、汇报交流 4.归纳总结、提升拓展 5.反馈训练、巩固落实
约8min
4.归纳总结、提升拓展
（一）归纳总结
观看转录翻译动画
（二）拓展提升
利用图示和习题突破加深对翻 译特点的理解
完成转录翻译比较表
输入
基因 指导 蛋白 质的 合成
遗传信息 的翻译
一、教材分析
高中生物必修1
《遗传信息的携带者-核酸》
高中生物必修2
《基因的本质》
必修2 第4章第1节
遗
遗
传
传
信
信
息
息
的
的
转
蛋白质合成演示图的制作方法
蛋白质合成演示图的制作方法
范淑秋
【期刊名称】《生物学通报》
【年(卷),期】1995(030)007
【摘要】蛋白质合成演示图的制作方法范淑秋（福建省三明市第一中学３６５００１）“基因对性状的控制”历来是教学难点。
笔者的自制教具——蛋白质合成演示图能形象直观地将蛋白质的生物合成这一微观的动态过程展示给学生，对于突破这一难点有一定的帮助。
１材料小黑板一块（１２...
【总页数】1页(P39)
【作者】范淑秋
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】Q－34
【相关文献】
1.演!演?演……——以《鹬蚌相争》为例谈以演促读教学 [J], 汪家燕
2.演角色就是演性格——演《百花公主》中公主一角的体会 [J], 袁祁利
3.中国博物馆界第一幅辅助陈列展示图——战国宴乐渔猎攻战图壶展示图 [J], 傅振伦
4.演形为下演心为上——我演《十里湾》中的陈广发 [J], 鲁智云
5.贯彻党的十七大精神促进新农村文化建设陕西省首届农民戏剧节分会场演出活
动安排迎奥运田园欢歌颂盛世高唱秦腔发展一村一品建设和谐农村秦人情系灾区秦腔传递爱心“写农民,演农民,在农村演,农民演,农民看” [J],
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草履虫、一些纤毛虫(ciliate)细胞核基因组，如嗜 热四膜虫(ThermophAilus tetrahymena) 草履虫核细胞核基因组 假丝酵母核基因组 一些动物的线粒体，果蝇线粒体
圆柱念珠菌(Candida cylindracea)细胞核基因组 酵母线粒体
➢遗传密码的特点
9
无标点与 不重叠
第二套遗传密码
tRNA分子上决定 其携带氨基酸的区 域叫做第二套遗传 密码，包括反密码 子和受体臂上核苷 酸序列。这样保证 蛋白质合成的忠实 性。（P398，4th edition）
29
➢氨酰-tRNA合成酶的作用
1. 对底物氨基酸和tRNA的特异性，保证遗传 信息准确翻译。
2. 一旦tRNA与错误的氨基酸相连，形成的氨 酰-tRNA会被该合成酶水解掉。具有校正活 性，保证翻译的正确性。
11 摆动现象
反平行配对 过程，密码 子的第一、 二位碱基严 格遵守碱基 配对原则， 而第三位配 对并不严格， 因此导致摆 动配对。
12
➢原核和真核生物mRNA的异同
原核生物
真核生物
不同点
多顺反子mRNA；单顺反子mRNA；
富含嘌呤的SD序 5’端甲基鸟苷酸帽
列；
子；
3’端PolyA尾巴；
相同点 阅读顺序5’3’； ORF之间存在非编码区；
13 原核生物核糖体识别mRNA上的起始密码子
小亚基
5’
S-D序列
3’
mRNA在原核和真核生物中的结构不同导致核糖体 识别起始密码子的方法不同。
14
2、tRNA——搬运氨基酸
Ser 5’
Tyr 5’
每一种氨基酸都有至少一种tRNA负责运载，表示方式 如：Ser-tRNA Ser ；Tyr-tRNA Tyr
连续阅读顺序：mRNA 5’ →3’ 肽链合成：N端→C端 开放读码框架（open reading frame, ORF） 阅读框移位（frame shift），蛋白功能 改变，称为移码突变。
简并性 P394
一种氨基酸有两个或多个密码子 同义密码子 密码上第一、二位上碱基不变，第三位 碱基可改变，如：UCU、UCC、UCA、UCG 都代表Ser 减少突变频率，保持遗传稳定性
10
➢遗传密码的特点
摆动性 mRNA上密码子与tRNA上的反密码子
P395（密码 进行反平行配对，产生摆动现象
子和反密码子配 对原则）
反密码子除A、G、U、C外，第一位
常为I（次黄嘌呤）
降低基因突变的危害，保证遗传稳定
通用性
一般情况下，病毒、原核及真核生物 共用一套密码 但存在不同生物或不同亚细胞器之间 的密码子略有不同
大亚基与tRNA的结合
22
A位 (aminoacyl site)：氨酰tRNA的结合部位 P位 (peptidyl site)：肽酰tRNA的结合部位 E位 (exit site)：脱肽酰tRNA的部位
（空载tRNA离开）
大小亚 基的空隙
23
二、蛋白质的合成过程
➢氨基酸的活化 ➢肽链合成的起始 ➢肽链合成的延长 ➢肽链合成的终止
细胞质 核糖体
24
1、氨基酸的活化——氨基酸与tRNA的结合
25 氨酰-AMP-E + tRNA → 氨酰-tRNA + AMP
26
27
➢氨酰-tRNA合成酶的专一性
每一种氨 酰－tRNA 合成酶识 别一种特 定的氨基 酸，但是 能识别一 种或多种 tRNA （由 第二套遗 传密码决 定）
28
代表一个氨基酸 • 起始密码：AUG（又编码甲硫氨酸或甲酰甲硫
氨酸）；GUG • 终止密码：UAA、UGA、UAG； AGA、AGG
➢非标准遗传密码
8
密码子 标准编码 UGA 中止
UGA 中止
AGR AGA AUA
UAA
精氨酸 精氨酸 异亮氨酸
中止
UAG GUG AAA CUG CUN
中止 缬氨酸 赖氨酸 亮氨酸 亮氨酸
非标准编码 所属的生物
色氨酸
人、牛、酵母线粒体，支原体(Mycoplasma)基因 组，如Capricolum
半胱氨酸
中止 丝氨酸 蛋氨酸
一些纤毛虫(ciliate)细胞核基因组，如游纤虫属 (Euplotes) 大部分动物线粒体，脊椎动物线粒体 果蝇线粒体 一些动物和酵母线粒体
谷氨酰胺
谷氨酸 丝氨酸 天冬氨酸 中止 苏氨酸
供能
蛋白质 产物
5
1、mRNA——蛋白质合成模板
氨基酸密码的发现（1961，M.Nirenberg）
• 大肠杆菌无细胞体系（去除细胞壁、细胞膜，DNA 酶处理）
• 人工合成Poly(U)—— mRNA
• 14C标记氨基酸 • ATP、GTP供能
UUU苯丙氨酸 AAA赖氨酸 CCC脯氨酸
6
7 • 密码子：三联体密码（43=64个遗传密码子），
tRNA 的二 级结构（三 叶草型）
与蛋白质合 成有关的位 点
15
氨基酸接受位点 氨酰-tRNA合成酶识别位点
mRNA结合位点
16 tRNA的三级结构（倒L-型）
17
3、核糖体——蛋白质合成的场所
rRNA + 蛋白质 核糖体（核蛋白体）
大亚基 小亚基
➢核糖体小亚基的组成（原核）
18
嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）的30S亚 基的三维分子结构图。 分子中的淡蓝色部分为 蛋白质，淡橙色部分为 RNA单链。
➢核糖体大亚基的组成（原核）
19
死海盐盒菌（Haloarcula marismortui）的50S亚基 的三维分子结构图。分子 中的淡蓝色部分为蛋白质， 淡橙色及黄色部分为RNA 单链。分子核心的亮绿色 部分为亚基的活性中心。
➢核糖体大小亚基的组成
20
沉降系数以 时间表示
1S=10-13秒Biblioteka 21遗传信息的中心法则
2
复制
转录 DNA DNA
RNA
翻译 蛋白质
逆转录 复制
翻译
RNA RNA
本章主要内容
3
蛋白质合成体系 蛋白质的合成过程 蛋白质合成后的加工 蛋白质的定向转运 蛋白质合成的抑制剂
4
一、蛋白质合成体系
模板 载体
氨基酸 原料
mRNA、tRNA、rRNA 酶、蛋白质因子、ATP、GTP
30
2、肽链合成的起始
原 大、小亚基
核 生
mRNA
物 fMet-tRNA fMet
IF-1，2，3 GTP，Mg2+
真 大、小亚基
核 生
mRNA
物 Met-tRNA Met
9种eIF GTP，Mg2+
起始复合体
➢起始复合物的形成过程（原核生物为例） 31
mRNA与小亚基定位结合