温敏雄性核不育水稻可育花药与不育花药的钙分布

温敏雄性核不育水稻可育花药与不育花药的钙分布
摘要：用焦锑酸盐沉淀法研究了温敏雄性核不育水稻在减数分裂时期和单核早期可育花药与不育花药的钙分布，结果表明：在减数分裂时期，可育花药小孢子母细胞和药室内的钙颗粒很少，而不育花药小孢子母细胞中分布许多的钙颗粒，特别是药室中的钙颗粒异常丰富，小孢子母细胞减数分裂异常，细胞质收缩退化，在单核早期，可育花药花粉内的钙颗粒极少，花粉表面分布许多钙颗粒，而不育花药花粉内分布许多钙颗粒，药室内的钙颗粒仍然非常丰富，可育花药维管束鞘细胞体积大且形状规则，细胞内的钙颗粒很少，而不育花药维管束鞘细胞体积小且形状不规则，细胞内的钙颗粒较多。

关键词：温敏雄性核不育；水稻；花药；钙
Ca2+作为植物生长发育过程中的必须元素之一，通过特定的时空分布参与调控植物生长发育的诸多发育过程，许多研究表明，Ca2+在雄性不育中具有重要的作用，不同类型的雄性不育，其花粉败育的方式不同，Ca2+的分布与作用也不同，如光敏型雄性不育的水稻与小麦，花粉败育发生在小孢子形成大液泡以后的小孢子晚期，花粉细胞质内Ca2+的异常积累可能是导致花粉败育的一个重要因素，而在花粉败育发生在小孢子母细胞减数分裂时期的非生态类型的雄性核不育白菜中，花粉内Ca2+过低导致花粉败育，温敏雄性核不育水稻是生态型两系不育水稻的一种，其育性转换主要由温度控制，不育系对温度的敏感期是小孢子母细胞形成至单核花粉期，且花粉败育主要发生在小孢子母细胞减数分裂时期，那么Ca2+在温敏雄性核不育水稻温度敏感时期的花药中分布特征及其在花粉败育中的作用如何?本研究以典型的温敏核不育系亲本培矮64S为实验材料，用焦锑酸盐沉淀法着重研究小孢子母细胞减数分裂时期与单核早期的可育花药与不育花药的钙分布特点，为探讨钙在温敏雄性不育水稻中花粉败育的作用提供基础。

1材料与方法
实验材料为温敏雄性核不育系水稻一培矮64S.4月底播种，幼苗长到5叶期移栽到盆中，当幼穗发育进入雌雄蕊原基形成期(幼穗长1cm左右)时，一部分植株在23℃左右、水深淹没处于育性转换温度敏感期的幼穗的人工冷水池中处理12d，然后置于自然的高温生长条件下，另一部分植株一直置于自然的高温不育的生长条件下生长。

参照Tian等方法，分别取发育早期的高温不育花药和低温可育花药，迅速投入含2.5％戊二醛、2％焦锑酸钾、0.1 tool/L磷酸缓冲溶液配置的前固定液中室温下固定3h，用含2％焦锑酸钾、0.1 mol/L磷酸缓冲液配置的洗涤液清洗3次，每次30min，材料转入含1％锇酸、2％焦锑酸钾、0.1 mol/L磷酸缓冲液配置的后固定液中4℃下固定16h左右，洗涤液清洗3次，每次30min，丙酮脱水，Spurr树脂包埋，包埋材料用LEICA切片机进行超薄切片，切片经2％醋酸铀染色用JEMl230透射电子显微镜于80kV条件下观察和拍照。

2结果与分析
2.1小孢子母细胞减数分裂时期可育花药与不育发药的钙分布
在可育花药中，减数分裂的小孢子母细胞核体积大，位于细胞中央，核显现染色体，细胞质浓厚，细胞器丰富，在小孢子母细胞与其周围的胼胝质壁中的钙颗粒均很少(图1a)，这时花药药壁已分化完全，由表皮，药室内壁，中层和绒毡层4层细胞组成，表皮细胞含有一个大液泡，细胞体积大，药室内壁细胞和中层细胞均具有大液泡，体积较少，绒毡层细胞位于药室最内层，细胞体积较大，细胞质浓厚，表皮细胞的细胞核和细胞间隙中的钙颗粒较多，其它三层细胞中的钙颗粒均很少(图1b)，这时，维管束幼嫩，尚未分化形成导管，维管束鞘细胞体积大且形状规则，其中的钙颗粒很少(图1c)。

在不育花药中，减数分裂的小孢子母细胞核位于中央，细胞质浓厚，细胞器丰富；小孢子母细胞与其周围的胼胝质壁中均分布许多钙颗粒，其中在药室内的钙颗粒非常丰富(图1d)，随着花粉发育，小孢子母细胞中的细胞器变得模糊不清，细胞内出现吞噬泡，细胞质收缩退化(图1e)，在药壁组织中，表皮、药室内壁、中层细胞核中分布许多钙颗粒，绒毡层细胞中的钙颗粒较少(图1f)，维管束幼嫩，尚未分化形成导管，维管束鞘细胞体积小且形状不规则，其中分布少量的钙颗粒(图1g)。

2，2单核早期可育花药与不育发药的钙分布
在可育花药中，单核早期花粉的细胞核位于中央，核膜之间的间隙局部扩张成一大的“泡状”物，细胞器丰富，花粉壁尚未完全形成，这时花粉细胞质中的钙颗粒仍然非常少，而花粉表面分布许多钙颗粒(图2a)，在药壁组织中，表皮、药室内壁细胞和中层细胞均具有大液泡，细胞体积较少，绒毡层细胞径向加厚，细胞中出现丰富的细胞器，表皮和药室内壁细胞核中分布丰富的钙颗粒，中层和绒
毡层细胞中的钙颗粒均很少，但绒毡层内切向壁上分布许多钙颗粒，药室内的钙颗粒也很少(图2b)，这时维管束已分化形成导管，有许多钙颗粒分布，维管束鞘细胞体积大，钙颗粒很少(图2c)，
在不育花药中，单核早期花粉与可育花药形态相似，然而，钙分布出现明显的异常：花粉细胞质和细胞核中分布许多钙颗粒，特别是核膜扩张形成的“大泡”中分布非常丰富的钙颗粒(图2d)，这时，表皮和药室内壁细胞均具有大液泡，细胞核中的钙颗粒丰富，而液泡和细胞质中的钙颗粒较少，中层细胞中的液泡变小，细胞径向变薄，绒毡层细胞径向加厚，中层和绒毡层细胞中均分布一些钙颗粒，药室内的钙颗粒变得非常丰富(图2e、)，维管束鞘细胞体积小且形状不规则，其中分布许多钙颗粒，维管束内分化形成的导管中也有许多钙颗粒(图1g)。

3讨论
温敏核不育水稻属于两用不育系水稻，其育性表现主要受控于温度，已有的研究表明，水稻温敏不育系对温度的敏感期在于小孢子母细胞形成至单核花粉期，其中减数分裂期对温度最敏感，本研究发现，温敏不育水稻在减数分裂时期小孢子母细胞的细胞质呈现出收缩退化等迹象。

钙是植物生长发育过程中不可缺少的元素之一，ca2+作为植物的第二信使广泛参与并调节着植物体内的生理生化反应，钙信使系统起作用的最初事态是细胞内Ca2+浓度在时间和空间上的变化，通过与钙调蛋白的结合直接激活了蛋白激酶的活性或间接地调控其它酶类蛋白的活性，将外部刺激转换成对植物细胞代谢活动的调控，雄性不育是杂种优势利用的基础，对雄性不育机理的探索非常活跃，Ca2+在雄性不育中的作用是研究热点之一，Tian等在光敏核不育水稻花药中首次发现了Ca2+与花粉育性转换有关：可育花药发育晚期小孢子细胞质中的Ca2+很少；而不育花药的小孢子细胞质中却积累丰富的Ca2+，从而提出小孢子细胞质内Ca2+的异常积累可能是导致花粉败育的一个重要因素，随后孟祥红等在光敏胞质不育小麦也发现类似现象，最近，谢潮添等在白菜细胞核雄性不育花药的钙分布研究中发现，花粉内过低的Ca2+导致花粉败育：可育小孢子从四分体释放出后，细胞质中的钙颗粒明显增加，为大液泡的形成做准备；而在不育花药中，
小孢子细胞质中的钙颗粒很少，阻碍小孢子形成大液泡，从而使细胞体积不能与花粉外壁同步膨大，产生了明显的质壁分离现象，最终通过细胞质收缩方式败育，本文对温敏雄性核不育水稻花药发育过程中钙分布的研究结果表明：减数分裂时期，可育花药中的小孢子母细胞内Ca2+很少，而不育花药中的小孢子母细胞内Ca2+相对丰富，以细胞质收缩的方式败育；单核早期，可育花药中的花粉细胞内的钙离子仍然很少，而不育花药中的花粉内分布丰富的Ca2+，随着发育的进行，花粉细胞质收缩退化，形成空瘪的花粉粒，同时，可育花药药室内的Ca2+很少，而不育花药药室内积累异常丰富的Ca2+，因此，水稻温敏雄性核不育系在温度敏感的小孢子母细胞形成至单核花粉期，Ca2+在不育花药的小孢子母细胞和单核花粉的细胞质内大量积累，产生Ca2+中毒，导致细胞内生理生化代谢紊乱，同时药室内异常丰富的Ca2+可能使花粉渗透调节失常，最终导致小孢子母细胞或花粉的细胞质收缩败育。

药隔维管束组织输送水分和养料供给花粉发育需要，药隔组织的异常会引起输导功能障碍，影响物质供应，导致雄性不育，吴钿等指出温度敏感的雄性核不育基因除了导致花药壁各层的发育异常，影响花粉粒的形成和成熟过程外，也影响药隔维管束导管、筛管和维管束鞘的发育，在本研究结果也证实温敏雄性核不育水稻不育系花药的药隔维管束鞘细胞体积小且形状不规则，药隔组织中分布许多的Ca2+颗粒；在可育系花药中，药隔维管束细胞的体积大且形状规则，药隔组织中的Ca2+颗粒较少，与利容千等对水稻红莲一粤泰不育系与保持系花药中Ca分布的研究结果相似，因此，药隔组织中细胞的异常结构和钙的异常分布均可能影响其正常功能的发挥，从而影响花药壁细胞功能和花粉的发育，其原因有待探讨。