2012级《微生物与微生物工程实验》实验报告

5、可溶性淀粉液 称取可溶性淀粉2g，用温水调成浆状，在搅动下缓缓倾入70ml沸水中，然后以30ml水分几次冲洗装淀粉的烧杯，加热至完全透明，定容至100ml。
6、磷酸缓冲液 称取磷酸氢二钠45.23g，柠橄酸8.07g，用水溶解并定容至1000ml，配好后用PH试纸校正至PH=6.0.
7、液体发酵培养基 采用牛肉膏蛋白胨培养基加2％可溶性淀粉，即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaC1 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中，pH调至7．2，121 灭菌15min。
用无菌涂布器涂布。右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基。
2、培养
平板倒置于37℃培养箱中培养随时观察细菌生长情况。
3、产淀粉酶菌的筛选、鉴定
①第二天早上，发现10-2，10-5等平板已有大量菌落，在菌落周围滴加碘液观察水解圈，对有水解圈且水解圈大的菌落进行斜面转接，同时用画线法将该菌落接种在另一干净平板上。
本实验从自然界中分离产淀粉酶的菌株，通过纯化测定水解圈的大小初步确定酶活力的强弱，然后进行液体培养用还原糖法测定酶活力较强的菌株，最后改变碳源，氮源，淀粉含量，PH，菌体浓度等确定最佳培养条件。获得最佳的产酶条件，以期进一步改良，适应于工业生产需求。
2
2.1
2.1.1实验材料
6个盛9ml无菌水的试管，盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶,制霉菌素母液（抑制真菌）。
（3）混合碳源(或氮源)的影响
1、配制LB培养基，共计400mL装在4个锥形瓶中，其中分别加入2%葡萄糖、2%淀粉、2%葡萄糖+1%淀粉、2%葡萄糖+2%淀粉四种不同碳源，灭菌。
2、接种细菌，然后将液体培养基置于摇床上在160r/min,37℃条件下培养24h。
3、从每个培养液中取2ml，装入离心管中，在4000r/min的离心机上离心5min，从每个离心管里吸取1ml上清液测酶活力，剩余菌体稀释15-20倍在分光光度计下测菌体浓度。
2、配制LB培养基，其中加入2%淀粉1%葡萄糖共计400mL，装在4个锥形瓶中，在锥形瓶中分别加入0.5%牛肉膏、蛋白胨、(NH4)2SO4、KNO3、灭菌。接种细菌，然后将液体培养基置于摇床上在160r/min,37℃条件下培养24h。
3、从每个培养液中取2ml，装入离心管中，在4000r/min的离心机上离心5min，从每个离心管里吸取1ml上清液测酶活力，剩余菌体稀释15-20倍在分光光度计下测菌体浓度。
（5）接种量的影响
1、预先配制500ml液体培养基，分装在5个锥形瓶中，灭菌。
（2）V-P试验
试剂：6％α-奈酚酒精溶液为甲液，40％氢氧化钾为乙液。同上法接种培养细菌，于2ml培养液内加入甲液1ml和乙液0.4毫升，摇振混合。试验时强阳性者约于5分钟后，可产生粉红色反应，如无反应，应放在36±1℃下培养4h再进行观察。（长时间无反应，可置室温过夜），次日不变者为阴性。
（3）过氧化氢酶接触试验
2、固体培养基：淀粉6g，酵母膏13g，氯化钠5g，添加1．O％的吐温于1000mL蒸馏水中；最佳培养条件为：初始pH值为7．5；培养温度为37℃，培养时间36h。
3、原碘液 称取碘11g，碘化钾22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500ml，储于棕色瓶中。
4、稀碘液 吸取原碘液2ml，加碘化钾20g并用水定容至500ml，储于棕色瓶中。
学生姓名宋文康
（西北师范大学生命科学学院2012级生物技术）
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自然界中蕴藏着种类丰富的的微生物资源。土壤是微生物生存的大本营，是微生物最为重要的资源库。从自然界中筛选具有特定功能的优良菌种是微生物工作者的一项重要任务，也是一件极其细致和艰辛的工作。获得具有优良形状及潜在产业化生产能力的功能微生物通常需要达到“亿万挑一”的地步。
10、正文文本字体为宋体，数字、英文等为Times New Roman，小四号，1.25倍行距，目录和1-3级标题的字体格式尽量不要调整。
11、本范本仅供参考，框架和标题内容不完备、不合理之处同学可自行修整。
12、实验一和实验二的实验报告内容请参照其他实验课程常规格式和课堂要求撰写，不做特殊要求。
产淀粉酶菌种的分离、筛选、鉴定和产酶条件优化
生命科学wenku.baidu.com院
《微生物与微生物工程实验》
实验报告
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学号：************
年级专业：2012级生物技术
小组成员：曹海锋孙向龙马红兵李鹏辉
指导教师：达文燕孔维宝
完成时间：2014年12月4日
实验报告撰写说明
1、各班根据实际实验内容，确定淀粉酶或蛋白酶的种类。
2、实验方法和实验结果要分开写，切忌混写，即方法部分中不要出现实验结果的内容，结果部分不要介绍方法。
2.2.3产酶菌种的纯种分离方法
1、涂布
待培养基温度降至50℃左右时进行倒平板。将上述每种培养基的五个平板底面分别用记号笔写上10-2、10-3、10-4、10-5和10-6五种稀度，然后用无菌吸管分别由10-2、10-3、10-4、10-5和10-6五管土壤稀释液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在淀粉平板培养基表面中央位置。
固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。
3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。
4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
5、染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。
6、水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。
高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、无菌涂布器、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿（9对）、无菌刻度吸管、酒精灯、试管架1个、接种环1个、接种针1个、接种钩1个、滴管等。
2.1.2试剂药品
1、淀粉培养基: 可溶性淀粉2%、蛋白胨1% 、氯化钠 0. 5%、牛肉膏0. 5%、琼脂粉2% 。（按配制100ml培养基计算）
测定时按时间在严格无菌条件下从每个培养液中取4ml，装入离心管中，在4000r/min的离心机上离心5min，从每个离心管里吸取2ml上清液测酶活力，剩余菌体稀释30倍在分光光度计下测菌体浓度；
（2）碳源(或氮源)种类及浓度的影响
1、配制分别含葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉四种碳源2%的LB培养基，灭菌。
2.2.2培养基的设计、配制、分装和灭菌
淀粉培养基: 可溶性淀粉2%、蛋白胨1% 、氯化钠 0. 5%、牛肉膏0. 5%、琼脂粉2% 。（按配制100ml培养基计算）
液体发酵培养基 ：采用牛肉膏蛋白胨培养基加2％可溶性淀粉，即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaC1 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中，pH调至7．2，121 灭菌15min。
淀粉酶在工业酶制剂生产中占有十分重要的地位 ，广泛应用于粮食加工 、食品工业 、酿造、发酵 、纺织品工业和医药行业 ，居市场份额第一。但是，我国的α一淀粉酶制剂的品种和生产菌株都很单一，α一 淀粉酶酶活也较国外同行业低 。淀粉酶的生产主要依靠微生物发酵。生产菌种选育近年来尽管转导转化和基因克隆等分子生物学技术已经广泛应用，但是这些方法成本较高，目前投入商业化生产的α一淀粉酶生产菌株几乎都是通过从自然界中分离得到的野生型菌株。因此不断从自然界中分离淀粉酶产生菌，并探索其最佳发酵条件有重要意义 。
配制固体培养基
配制200ml淀粉培养基，配好后装在锥形瓶中用封口膜封住，连同实验所需其他仪器放入灭菌锅中灭菌。
灭菌完成后配制土壤稀释液
称取土样lg，放入盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将锥形瓶加塞、包扎、摇匀（无菌室里），利用恒温水浴装置80℃左右水浴，水浴锅温度恒定后维持20min（制悬液时就应先开始加热），制成10-1g/ml的土壤悬液。用一支lml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液。
8、3%过氧化氢溶液。
2.1.3仪器设备
冰箱、高压灭菌锅、摇床、721分光光度计、恒温水浴锅、电加热器、酒精灯、试管、接种环、锥形瓶、量筒、移液管、洗耳球、玻璃棒、烧杯、PH试纸。
2.2
2.2.1含菌土样的采集
在西苑餐厅背面选取一个采样点，产去表层5cm，取5-15cm处。用无菌器具规范采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。
图*：&&&&&&&&&&&
表*：&&&&&&&&&&&
表
头
部
分
6、分析与论部分内容可结合本实验实际结果和课程所学理论知识展开讨论；结论部分只做文字性总结，不出现图表。
7、第5、6部分必须认真思考撰写，内容不可缺。
8、第7部分内容要小组成员讨论决定，结果直接决定成绩的高低，请认真对待。
9、内容定稿后请更新目录：菜单栏/引用/更新目录/只更新页码。
挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果。
2.2.6菌种的液体培养及产酶条件优化
（1）菌种生长曲线的测定方法
1、菌种的活化
将保藏的菌种洗脱接种到一个装有50ml液体培养基的锥形瓶里，放在摇床上在160r/min,37 条件下培养24h。
2、生长曲线的测定
将培养好的菌种分别接种在3个装150ml培养基的锥形瓶中，每个里面接4ml。接种完成后按设定的0，2，4，6，8，10，12，14，16，20，22，24，28，30，34，38，40，44h测定菌种浓度，同时在160r/min,37 的摇床上培养。
（4）pH值的影响
1、预先配制500ml液体培养基，分装在5个锥形瓶中，灭菌。
2、用1M NaOH和1M HCl对培养基进行调配，用pH试纸测定培养基pH，分别将pH调至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,接种细菌，然后将液体培养基置于摇床上在160r/min,37℃条件下培养24h。
3、从每个培养液中取2ml，装入离心管中，在4000r/min的离心机上离心5min，从每个离心管里吸取1ml上清液测酶活力，剩余菌体稀释15-20倍在分光光度计下测菌体浓度。
3、实验方法部分内容要尽量详细介绍。
4、2.2.6部分要根据各班实际实验设计内容详细说明培养基的组成及培养条件。
5、实验结果部分内容根据实际实验结果撰写；图和表都必须要有标题，根据内容顺序按表1、表2…或图1、图2…按顺序列出；图的标题在图下方，横纵坐标轴需要时都要有标题和单位；表的标题在表上方，须绘制成三线表。如下所示：
7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。
8、脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。
9、复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。至此，革兰氏染色结束。
10、在油镜下观察。
2.2.5菌种的常规生理生化鉴定
（1）甲基红试验
挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用液体培养基，培养于36±1°C或30°C（以30°C较好）1-5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1-2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。 甲基红为酸性指示剂，pH范围为4.4~6.0，其pK值为5.0。故在pH5.0以下，随酸度而增强红色，在pH5.0以上，则随碱度而增强黄色，在pH5.0或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间，重复试验。
②将接好的斜面和平板放在恒温培养箱中培养。
③待下午时所转接细菌已长出菌落，再进行三点法培养（在接种针上粘上该细菌，在干净灭菌的平板上分三个地方点三点）。
④同时配好液体培养基，灭菌，将该细菌接种到液体培养基中，每个接3瓶。⑤将接种好的固体和液体培养基放在培养箱中培养。
2.2.4产酶菌种的革兰氏染色观察
1、取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。
2、涂片：液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。