(江苏专用)2020版高考生物总复习考点加强课6课件

（3）参考Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶 若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于 将目的基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细 胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，如用两种限制酶Xba Ⅰ和Sac Ⅰ（两种酶切 出的黏性末端不同）切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因 表达载体，则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取。（分析 如下）
的酵母菌菌落数至少要为
个。
（4）已知质粒在细胞传代过程中有丢失现象，试分析毕赤酵母表达系统的遗传稳
定性高于大肠杆菌表达系统的主要原因是________________________________。
解析 （1）如果要将 HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，HBsAg基因插入的位置应该 在pPIC9K质粒的启动子和终止子之间，pPIC9K质粒的启动子和终止子之间有限制酶 SnaB Ⅰ和Avr Ⅱ的识别位点，所以在 HBsAg基因两侧的A和B位置要接上限制酶 SnaB Ⅰ和Avr Ⅱ的识别序列，可避免质粒和目的基因的自身环化。限制酶SnaB Ⅰ切 割后是平末端，限制酶Avr Ⅱ切割后是黏性末端，而T4DNA连接酶既可连接平末端又 可连接黏性末端，所以步骤1应选用T4DNA连接酶。（2）步骤2是将重组质粒导入大 肠杆菌体内进行扩增，以获得大量重组质粒。pPIC9K质粒是松弛控制型，复制不受
和
，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________________。
[慧眼识图 获取信息]
（1）三种限制酶切割结果分析
（2）表达载体与重组DNA分子分析
答案 （1）Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 （2）甲 、丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游， 二者的目的基因均不能被转录 （3）E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA 连接酶
2.目的基因的检测与鉴定 （1）界定“标记基因”与“DNA分子杂交技术”在目的基因检测中的作用：
①载体上标记基因的标记原理 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没 有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性 基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培 养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基 中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含 该载体，原理如下图所示：
达目的基因产物的有
，不能表达的原因是________________________
_____________________________________________________________________。
图（c）
（ 3 ） DNA 连 接 酶 是 将 两 个 DNA 片 段 连 接 起 来 的 酶 ， 常 见 的 有
化成功，所以要获得16个成功导入该基因的酵母菌菌落，图A中的酵母菌菌落数至少 要为16÷2×15＝120个。（4） 毕赤酵母表达系统中目的基因整合到酵母染色体上， 不易丢失，而大肠杆菌表达系统中质粒在细胞传代过程中有丢失现象，所以毕赤酵母
表达系统的遗传稳定性更高。
答案 （1）SnaB Ⅰ和Avr Ⅱ T4 （2）获得大量重组质粒（扩增） 不确定 （3）Bgl Ⅱ 卡拉霉素 120 （4）目的基因整合到酵母染色体上，不易丢失
宿主细胞控制，所以无法确定1个大肠杆菌复制3次后得到重组质粒的个数。（3）由 步骤4中获得的一段线性DNA两侧序列可知，应选用限制酶Bgl Ⅱ切割重组质粒，该 线性DNA中含卡拉霉素抗性基因，应在培养基中加入卡拉霉素以便筛选转化成功的毕
赤酵母菌。由图可知，图A中的酵母菌菌落数为15个时，用分子杂交技术鉴定有2个转
（1）经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被
酶切后的
产 物 连 接 ， 理 由 是 ______________________________________________________
。
（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的
重组DNA分子，如图（c）所示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表
1.限制酶的选择原则
（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可 选择PstⅠ。 ②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选 择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目 的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶（但要确保质粒上 也有这两种酶的切点），而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因”以及启动 子和终止子。
【 例 证 】 （ 2016·全国 卷 Ⅲ ， 40 ） 图 （ a ） 中 的 三 个 DNA 片 段 上 依 次 表 示 出 了 EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b） 为某种表达载体的示意图（载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的）。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
一套遗传密码子，所以目的基因能在大肠杆菌细胞内表达出相同的蛋白质。
答案 （1）鸟嘌呤脱氧核苷酸和腺嘌呤脱氧核苷酸 （2）BD （3）B和C 8 （ 4）Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ 1 （5）抗四环素 各种生物共用一套遗传密码子
（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。 ②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构 ，应至少含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶pst Ⅰ因其会破坏标记基因而不 宜选择。 ③所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止 一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重 组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。 ④所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图乙中HindⅢ会破坏启动子 ，EcoRⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子 与终止子之间。
质粒的个数
。
（3）步骤4中应选用限制酶
切割重组质粒以获得一段线性DNA，然后
将其导入毕赤酵母菌细胞。为了确认毕赤酵母菌转化是否成功，应在培养基中
加入
以便筛选。除此以外，还可以用分子杂交技术鉴定上图中的毕赤
酵母菌转化是否成功，过程如下图所示：
根据图中显示结果推算，若要获得16个成功导入该基因的酵母菌菌落，则上图A中
（3）若利用PCR技术增加目的基因的数量，由图2可知，A、B、C、D 4种单
链DNA片段中应选取
作为引物（DNA复制子链的延伸方向5′→3′）。
该DNA分子在PCR仪中经过4次循环后会产生等长的目的基因片段
个
（4）为了使目的基因和质粒定向连接并且有利于受体细胞的筛选，提高重组效率
，应该选择的限制酶是
②“标记基因”筛选后为何还需应用“DNA分子杂交技术”确认目的基因是否转入 ？ 经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定的标记基因的质粒，然而，该质粒上 是否成功嵌入了目的基因，还不能确定，故仍需使用“目的基因”作探针，利用 DNA分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。 （2）使用“目的基因”作探针，运用“分子杂交技术”检测目的基因是否转录出 特定mRNA。 （3）采用“抗原—抗体杂交技术”，从转基因生物中提取蛋白质（作抗原）与相 应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。 （4）采用抗虫、抗病毒等“接种实验”进行目的基因成功表达的“个体生物学” 水平的检测。
2.（2018·淮中、南师附中、海门、天一四校联考）基因表达载体的构建是基因工 程的核心。图1为限制酶EcoRⅠ的识别序列，图2表示目的基因及限制酶切点， 图3表示目的基因上的DNA片段，图4表示质粒。回答下列问题：
（1）若用图1所示的限制酶EcoRⅠ切割外源DNA，就其特异性而言，切开的
是
之间相连的化学键。
解析 （1）限制酶EcoRⅠ识别序列为GAATTC，切割位点在G与A之间，切开的是 鸟嘌呤脱氧核苷酸和腺嘌呤脱氧核苷酸之间相连的磷酸二酯键。（2）决定氨基酸的 密码子在mRNA上，A错误；DNA聚合酶和DNA连接酶都可作用于②磷酸二酯键处 ，解旋酶作用于①氢键处，B正确；假设只用这个片段中的3个碱基对，排列出的 DNA片段一定小于64种，C错误；该片段含2个游离的磷酸基团，重组质粒是环状 DNA ， 不 含 游 离 的 磷 酸 基 团 ， D 正 确 。 （ 3 ） 由 于 DNA 复 制 时 子 链 的 延 伸 方 向 为 5′→3′，所以选C和B作为引物。该DNA分子在PCR仪中经过3次循环后会产生2个等 长的目的基因片段，经过n次循环后产生等长的目的基因片段为2n—2n个，4次循环 后会产生等长的目的基因片段8个。（4）为了使目的基因和质粒定向连接应该选择 双酶切，质粒上至少要有一个标记基因存在，所以用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ。用限制 酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ同时对质粒进行切割，若顺时针方向PstⅠ与EcoRⅠ之间 的片段为a，EcoRⅠ与HindⅢ之间的片段为b，HindⅢ与PstⅠ之间的片段为c，则只 有任意两个位点被切断且每次机会相等时，形成的片段有a、b＋c、b、a＋c、c、a ＋b，其中含有完整抗四环素基因的DNA片段只有b＋c这1种。（5）经以上分析，重 组质粒构建时，抗青霉素基因被破坏，只保留了抗四环素基因，所以为了筛选出含 重组质粒的受体菌，受体细胞中应不含标记基因抗四环素基因。由于所有生物共用
（1）如果要将 HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在 HBsAg基因两侧的A和B
位置接上限制酶
的识别序列，这样设计的优点是可避免质粒和目的
基因的自身环化。步骤1应选用
（选填“E·coli”或“T4”）DNA连接酶。
（2）步骤2的目的是
。已知大肠杆菌每20 min分裂一次，若1
个大肠杆菌中导入了10个重组质粒，则1 h后可从1个大肠杆菌的后代中得到重组
（2）图3为目的基因中的某一片段，下列有关叙述正确的是
源自文库
（多选）
。
A.若图中的ACT能决定一个氨基酸，则ACT可称为一个密码子
B.DNA聚合酶和DNA连接酶都可作用于②处，解旋酶作用于①处
C.若只用这个片段中的3个碱基对，排列出的DNA片段有64种
D.就游离的磷酸基而言，该片段与重组质粒相比多了2个游离的磷酸基
。如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ同时
对质粒进行切割，假设同时只有任意两个位点被切断且每次机会相等，则形成含
有完整抗四环素基因的DNA片段有
种。
（5）如果大肠杆菌是受体细胞，则其体内应不含
基因，以利于筛选出含
重组质粒的受体菌。目的基因能在大肠杆菌细胞内表达出相同的蛋白质，其遗传
学基础是_____________________________________________________。
1.（2018·南京、盐城、连云港二模）人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，接种乙肝疫 苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。下图为“转基因酵母乙肝疫苗”的生产过 程示意图，该过程所用酵母菌为毕赤酵母菌，其体内无天然质粒，科学家改造出 了下图所示的pPIC9K质粒（松弛控制型，复制不受宿主细胞控制）用作载体，其 与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的 基因整合于染色体中以实现表达。请回答下列问题：