蛋白提取步骤
提蛋白质的原理及步骤
蛋白质提取是一项基础实验，通常用于从组织或细胞中提取纯度较高的蛋白质样品，以便进行各种蛋白质研究。
常规的蛋白质提取步骤包括以下几个主要步骤：
1. 细胞或组织的裂解：将待提取的样品裂解以释放出蛋白质。
裂解方法取决于被裂解的细胞类型，可使用机械法、化学法、超声波或高压等方法进行裂解。
2. 蛋白质的分离：将蛋白质与非蛋白质组分进行分离，常用的方法有沉淀、过滤、离心和柱层析等。
3. 蛋白质的纯化：通过进一步的分离和纯化来获得高纯度的蛋白质。
这些步骤通常需要进行多次，每次都使用不同的方法来分离和纯化蛋白质。
提蛋白质的原理是基于蛋白质的化学和物理特性进行分离和纯化。
蛋白质分子量大小、电荷、亲水性等特性不同，容易与不同化学试剂、柱层析介质或生物酶相互作用。
通过调节这些条件和步骤，就可以使不同的蛋白质与其它组分分离出来，并得到纯度较高的蛋白质样品。
虽然蛋白质提取步骤较多，但因为各种蛋白质的特性不同，所以实验时需要根据需要选择不同的提取和分离方法以获得更理想的效果。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤：1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤：1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
wb蛋白提取步骤
wb蛋白提取步骤WB蛋白提取步骤引言：WB蛋白提取是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。
本文将详细介绍WB蛋白提取的步骤，包括细胞裂解、蛋白质提取、浓缩和检测等关键步骤。
一、细胞裂解细胞裂解是WB蛋白提取的第一步，旨在破坏细胞膜、细胞核膜以及其他细胞组分，释放出目标蛋白质。
常用的细胞裂解方法有机械法、化学法和生物学方法等。
其中，最常用的方法是使用细胞裂解缓冲液，通过冷冻-解冻或超声波等方式破坏细胞结构。
二、蛋白质提取蛋白质提取是WB蛋白提取的关键步骤之一。
在细胞裂解后，目标蛋白质以及其他细胞组分被释放到裂解液中。
为了提取目标蛋白质，需要将裂解液进行离心，分离出上清液。
上清液中含有目标蛋白质，可以用于后续的蛋白质浓缩和检测。
三、蛋白质浓缩蛋白质浓缩是WB蛋白提取的重要步骤之一，旨在提高目标蛋白质的浓度，便于后续的蛋白质检测。
常用的蛋白质浓缩方法有醋酸沉淀法、酒精沉淀法和尿素沉淀法等。
在浓缩过程中需要注意控制温度和pH值，以避免蛋白质的降解和聚集。
四、蛋白质检测蛋白质检测是WB蛋白提取的最后一步，用于确定提取的蛋白质是否含有目标蛋白以及其相对丰度。
常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE和免疫印迹等。
其中，SDS-PAGE是一种分离蛋白质的电泳方法，可以根据蛋白质的分子量将其分离成不同的条带；免疫印迹则是通过特异性抗体与目标蛋白质结合，然后使用酶标记的二抗进行检测。
总结：WB蛋白提取是一种重要的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。
其步骤包括细胞裂解、蛋白质提取、蛋白质浓缩和蛋白质检测等。
通过合理选择和操作这些步骤，可以获得高质量的蛋白提取物，为后续的蛋白质研究提供可靠的基础。
参考文献：[1] Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622.[2] Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A.1979;76(9):4350-4354.[3] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.。
全蛋白提取实验报告
实验名称：全蛋白提取实验实验目的：学习掌握全蛋白提取的基本方法，了解蛋白质提取过程中可能遇到的问题及解决方法。
实验时间：2022年X月X日实验地点：实验室实验人员：XXX、XXX、XXX一、实验原理蛋白质是生物体的重要组成部分，提取蛋白质是生物化学、分子生物学等领域的重要实验技术。
全蛋白提取是将细胞或组织中的蛋白质提取出来，以便进行后续的蛋白质定量、纯化、鉴定等实验。
本实验采用组织裂解法提取全蛋白，该方法简单、快速、高效。
二、实验材料1. 实验材料：新鲜组织（如肝脏、肌肉等）2. 实验试剂：裂解液、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、PMSF、SDS-PAGE电泳试剂、考马斯亮蓝R-250染料等3. 实验仪器：玻璃匀浆器、离心机、移液器、电泳仪、凝胶成像系统等三、实验步骤1. 组织处理：将新鲜组织用剪刀剪成小块，称取适量组织放入玻璃匀浆器中。
2. 裂解：向匀浆器中加入适量的裂解液，加入磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和PMSF，冰上裂解30min。
3. 离心：将裂解后的匀浆液以12000g离心15min，取上清液。
4. 蛋白质定量：采用考马斯亮蓝R-250法对蛋白质进行定量。
5. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，观察蛋白质条带。
四、实验结果与分析1. 蛋白质定量结果：根据考马斯亮蓝R-250法，测定蛋白质浓度为X mg/mL。
2. SDS-PAGE电泳结果：观察蛋白质条带，可见明显的蛋白质条带，表明全蛋白提取成功。
五、讨论1. 裂解液的选择：本实验采用裂解液提取蛋白质，裂解液的选择对蛋白质提取效果有很大影响。
本实验中，裂解液中含有磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和PMSF，能有效抑制蛋白质降解，提高蛋白质提取效率。
2. 蛋白质定量：本实验采用考马斯亮蓝R-250法进行蛋白质定量，该方法操作简便、灵敏度高，适用于蛋白质含量较高的样品。
3. SDS-PAGE电泳：本实验采用SDS-PAGE电泳分离蛋白质，该方法能有效地分离蛋白质，便于观察蛋白质条带。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤:1、细胞总蛋白提取A对于悬浮细胞：离心收集细胞，每106细胞加250 Ul RlPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B对于贴壁细胞：a用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b加入适当体积的RIPA （使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min,期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80 C 冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200 μ l ）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80 C短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20 C保存，避免反复精品佳作，安心下载，放心使用冻融。
遇到失意伤心事，多想有一个懂你的人来指点迷津，因他懂你，会以我心，换你心，站在你的位置上思虑，为你排优解难。
一个人，来这世间，必须懂得一些人情事理，才能不断成长。
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一个女子，一生所求，莫过于找到一个懂她的人，执手白头，相伴终老。
蛋白提取原理
蛋白提取原理
蛋白质是生命体内最基本的物质之一，它参与了生物体内的几乎所有生命活动。
因此，蛋白质的提取和纯化对于生物学研究、食品加工、药物开发等领域具有重要意义。
蛋白提取的原理主要包括细胞破碎、蛋白质溶解和分离纯化三个步骤。
首先，细胞破碎是蛋白提取的第一步。
细胞膜的破裂是蛋白质提取的前提条件，只有将细胞完全破碎，才能使蛋白质充分暴露在溶液中，有利于后续的溶解和分离。
常用的细胞破碎方法包括机械破碎、超声波破碎、冻融破碎等，这些方法可以有效地破坏细胞壁和细胞膜，释放细胞内的蛋白质。
其次，蛋白质的溶解是蛋白提取的关键步骤。
细胞破碎后，蛋白质通常以固体形式存在于细胞溶液中，需要将其溶解到溶液中。
蛋白质的溶解受到多种因素的影响，如pH值、离子强度、温度等。
在蛋白质的溶解过程中，需要选择合适的缓冲液和溶解条件，以保证蛋白质的完整性和活性。
最后，蛋白质的分离纯化是蛋白提取的最终目的。
在蛋白质溶液中，通常含有大量的杂质和其他蛋白质，需要通过分离纯化的方
法将目标蛋白质从混合溶液中分离出来。
常用的分离纯化方法包括离心、凝胶过滤、离子交换、亲和层析等，这些方法可以根据蛋白质的特性和目的进行选择，最终得到纯度较高的目标蛋白质。
总之，蛋白提取的原理是一个复杂的过程，需要综合运用生物化学、生物物理学、分子生物学等多个学科的知识。
只有深入理解蛋白提取的原理，才能选择合适的方法和条件，从而获得高质量的蛋白质样品。
希望本文对您有所帮助，谢谢阅读！。
osboren分级提取蛋白法
osboren分级提取蛋白法OSBORN分级提取蛋白法是一种常用的蛋白质分离和纯化方法，通过对蛋白质的溶液进行梯度离心离子交换层析，实现不同蛋白质的分级提取。
本文将介绍OSBORN分级提取蛋白法的原理、步骤和应用。
一、原理OSBORN分级提取蛋白法利用了蛋白质在梯度离心离子交换层析中的不同亲和性，结合蛋白质的理化性质，实现蛋白质的分级提取。
在OSBORN分级提取蛋白法中，常用的梯度溶液包括硫酸铵、硫酸钠、甘露醇等。
二、步骤OSBORN分级提取蛋白法的步骤如下：1. 制备梯度离心离子交换层析柱，通常采用预装填色谱柱或自制柱。
2. 准备待提取蛋白质的样品，将样品溶解在适当的缓冲液中。
3. 将样品加入到离子交换层析柱中，使蛋白质与柱填充物发生亲和作用。
4. 启动离心离子交换层析柱，通过离心力将蛋白质从柱中洗脱。
5. 根据蛋白质的性质和分子量，可以调整离心力和洗脱溶液的浓度，实现对目标蛋白质的精确分级提取。
6. 收集不同梯度洗脱液中的蛋白质溶液，用于后续的分析和应用。
三、应用OSBORN分级提取蛋白法在生物医学研究领域具有广泛的应用价值，主要体现在以下几个方面：1. 分离纯化蛋白质：OSBORN分级提取蛋白法可以根据蛋白质的性质和分子量，将复杂的蛋白质混合物分级提取，得到纯度较高的目标蛋白质。
2. 鉴定蛋白质功能：通过对不同梯度洗脱液中的蛋白质溶液进行功能分析，可以了解蛋白质在生物体内的具体功能和作用机制。
3. 研究蛋白质相互作用：OSBORN分级提取蛋白法可以将不同亲和性的蛋白质从混合物中分离出来，有助于研究蛋白质之间的相互作用关系。
4. 探索新药靶点：OSBORN分级提取蛋白法可以在大量的蛋白质混合物中寻找具有特定生物学功能的蛋白质，为新药研发提供潜在的靶点。
总结：OSBORN分级提取蛋白法是一种常用的蛋白质分离和纯化方法，通过离心离子交换层析实现蛋白质的分级提取。
该方法在生物医学研究中具有重要的应用价值，可以用于蛋白质分离纯化、功能鉴定、相互作用研究等方面。
蛋白提取步骤
蛋白提取步骤准备裂解液、蛋白酶抑制剂。
1、取2mlEP管加入500ul裂解液（已加入蛋白酶抑制剂）2、取0.1g组织，充分剪碎后加入研磨器中，加入适量液氮，将组织研成粉末状。
3、将研磨后的组织转至加有裂解液的2mlEP管中。
4、冰上超声（超声3s，停6s）共计20个循环，30%能量。
5、冰上静置30min，每10min震荡1次。
6、12000rpm，4℃离心30min。
7、收集上清，测浓度后-70℃保存。
8、煮蛋白时加5微升上样缓冲液。
2．培养的细胞（定量）：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷12000g离心，4℃，2min。
⑸取少量上清进行定量。
⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
3．组织：⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml 裂解液。
可手动或电动匀浆。
注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵ 12000g离心，4℃，2min。
⑶取少量上清进行定量。
⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
ripa蛋白提取方法
ripa蛋白提取方法RIPA蛋白提取方法引言蛋白质是细胞中重要的分子组成部分，它们在细胞的结构和功能中发挥着关键作用。
为了研究蛋白质的功能和相互作用，科学家们经常需要从细胞中提取蛋白质。
RIPA（Radioimmunoprecipitation Assay）蛋白提取方法是一种常用的提取方法，本文将详细介绍该方法的步骤和注意事项。
材料和试剂1. RIPA缓冲液：包含盐、洗涤剂和缓冲剂，用于细胞裂解和蛋白质溶解。
2. 蛋白酶抑制剂：用于保护蛋白质免受降解。
3. 磷酸盐缓冲液：用于洗涤和溶解蛋白质。
4. 加热样品缓冲液：用于处理蛋白质样品。
步骤1. 收集细胞：将需要提取蛋白质的细胞收集到离心管中，可以通过离心将细胞沉淀下来。
2. 细胞裂解：向细胞中加入适量的RIPA缓冲液，使用离心机将细胞裂解开。
3. 离心：将裂解后的细胞上清液离心，以去除细胞碎片和其他杂质。
4. 收集上清液：将离心后的上清液转移到新的离心管中，这是含有蛋白质的部分。
5. 添加蛋白酶抑制剂：在上清液中添加适量的蛋白酶抑制剂，以避免蛋白质的降解。
6. 震荡和冷藏：将上清液和蛋白酶抑制剂混合均匀，并在4摄氏度下冷藏片刻。
7. 离心：将上清液离心，以去除任何未溶解的细胞碎片或沉淀。
8. 收集上清液：将离心后的上清液转移到新的离心管中，这是蛋白质的最终提取物。
9. 加热样品：将提取的蛋白质样品加入加热样品缓冲液中，进行蛋白质的加热处理。
注意事项1. 所有的操作应该在冷藏条件下进行，以避免蛋白质的降解。
2. 所有使用的器皿和工具都应该事先冷藏，以保持低温状态。
3. 在细胞裂解和上清液收集过程中，应尽量避免氧气的接触，以减少氧化反应对蛋白质的影响。
4. 在加热样品的过程中，应控制好加热时间和温度，以避免蛋白质的降解或变性。
总结RIPA蛋白提取方法是一种常用且有效的蛋白质提取方法。
通过细胞裂解和离心等步骤，可以得到含有蛋白质的上清液。
在提取过程中，需要注意保持低温、避免氧化和控制加热条件，以保证蛋白质的完整性和稳定性。
蛋白提取及WB步骤
Western blot 实验1）蛋白裂解液的配制:Urea（7 M）4.2 g，Thiourea（2 M）1.52 g，CHAPS（4% W/V）0.4 g，DTT （1% W/V）0.1 g，ddH2O加至10 ml，1 ml/管分装-20℃保存备用；1 ml分装的裂解液中用前加入Cocktail（1% V/V）10 μl，混匀后于冰上放置备用。
我们用的是国产的碧云天的全蛋白提取试剂盒2）蛋白样品制备（1）取组织，称重，按照W:V = 1:6的比例加入蛋白裂解液；（2）用匀浆器对组织进行匀浆，匀成糊状。
（3）4 ℃，冰上放置30min，每10 min振荡一次；（4）4 ℃，12000 g 离心30 min，吸上清，分装置于-70 ℃待用。
3）蛋白浓度测定（Bradford法）试剂配制：考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝G250 0.05 g，95%乙醇25 ml，H3PO4 50 ml，ddH2O加至500 ml，过滤后储存于4 ℃。
牛血清白蛋白（BSA）：1 mg/ml步骤：按下列体系配置溶液，混匀后，静置5 min后，测OD值（波长595 nm），将OD值输入Excel进行数据处理，计算出相关系数，当相关系数>0.99才具有可信度。
取待测标本，正确设置reference，取适量标本，进行浓度测定。
管号BSA（1 mg/ml）0.9% NaCl/0.1 M PBS 考染液0 0 200 μl 1 ml1 5 195 μl 1 ml2 10 190 μl 1 ml3 15 185 μl 1 ml4 20 180 μl 1 ml5 25 175 μl 1 ml我们用的是国产碧云天的BCA蛋白浓度测定试剂盒。
4）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（1）凝胶制备：30.8%丙烯酰胺：丙烯酰胺30 g，甲叉双丙烯酰胺0.8 g，ddH2O加至100 ml，置于通风橱内搅拌直至丙烯酰胺完全溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤后4 ℃保存于棕色瓶中备用。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤：1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
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蛋白提取步骤
提蛋白及WB得步骤整个过程细胞或蛋白都必须放冰上准备工作：前一天准备:借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂就是否充足、当天准备:洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记1、5ｍl 离心管及0、6ml离心管、细胞刮板、开低温高速离心机细胞裂解液配制:1ml cｅll lysｉs10ul NP-40（离心机后)25uｌ焦磷酸钠４0uｌNaF１ul β-甘油磷酸2 ul Na3VO41ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱)１0ul PＭSF(最后加，随加随用,有毒）细胞裂解与收集1.观察细胞状态,并准备提蛋白：吸走培养基、用ＰＢS洗细胞两次(倾斜贴壁加PBＳ，左右轻轻摇)，倾斜贴壁吸走ＰＢS。
2.将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐:一般1０6加0、1mｌ），冰上静置1-2ｍｉn。
3.刮细胞:细胞刮板每次用之前拿水涮一涮,甩干,然后从中间到外面打圈刮,再从下往上,从上往下全面刮，(刮得时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管.细胞破碎4.超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块,三个小夹子。
(超声波破碎仪得铁棒不要碰到离心管得壁与底部）超声波设置:工作功率5％工作时间3min开机时间15ｓ,关机时间３０s温度０度,报警温度1度5.４℃、1300０ｒ／ｍin,离心15min。
(离心机用后一直保持打开得状态,）蛋白保存6.蛋白保存及分装:吸上清液至０、6ml离心管,涡旋、吸一半至另一个管中,涡旋。
—80℃保存。
注意事项：PＭSF一定要现用现加,PMSF在水溶液中不稳定,30ｍin内就会降解一半.样品处理超过1ｈ，补加一次。
BCA测定蛋白浓度1、测空白板，选差异较小得孔。
BCA测定法波长570,Bｒacfｏrd:5952、标准蛋白得稀释(5mg/uｌ):分装1ml PBＳ来使用,稀释标准蛋白至０、5mg/ul。
取5uｌ标准蛋白＋45ul PBS5、配BCA：每个孔２００ul，一个样品2个重复，Ａ:B=５0：１，根据样品数来计算BCA得用量，一般防止损耗,多算一个样。
蛋白提取步骤
碧云天裂解液
对于培养细胞样品：
1. 融解RIPA裂解液，混匀。
取适当量的裂解液，在使用前数分钟
内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
(PMSF水中不稳定，60分钟完全降解，若实验超过60分钟，应补加PMSF)。
2. 对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液
洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。
按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。
用枪吹打数下（或者用细胞刮），使裂解液和细胞充分接触。
通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。
对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。
按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。
再用手指轻弹以充分裂解细胞。
充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。
3. 充分裂解后，10000-14000g 4℃离心10分钟，取上清，即可进
行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
wb蛋白提取步骤
wb蛋白提取步骤WB蛋白提取步骤一、引言WB（Western Blot）蛋白提取是一种常用的蛋白质分析方法，通过将样品中的蛋白质分离、定量和检测，可以研究蛋白质的表达水平、功能和相互作用等。
本文将介绍WB蛋白提取的步骤及操作要点。
二、样品准备1. 收集样品：根据研究目的，选择合适的样品进行提取。
样品可以是细胞、组织、血清、培养基等。
2. 样品处理：对于细胞和组织样品，可先用PBS缓冲液洗涤去除残留的培养基或组织液。
对于血清样品，可离心去除悬浮的细胞或血小板。
三、蛋白提取1. 细胞裂解：将细胞沉淀离心后，加入细胞裂解液，使细胞膜破裂释放蛋白质。
可以选择不同的细胞裂解液，如RIPA缓冲液、NP-40缓冲液等。
2. 组织裂解：将组织样品切碎后，加入组织裂解液，将组织细胞破碎并释放蛋白质。
组织裂解液可以选择RIPA缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。
3. 蛋白质提取：将裂解液离心，收集上清液，即为蛋白提取物。
可以通过BCA方法或Lowry方法等测定蛋白质的浓度。
四、蛋白质分离与检测1. SDS-PAGE凝胶电泳：将蛋白样品加热变性，然后加载到凝胶孔中，施加电场使蛋白质在凝胶中进行分离。
常用的凝胶浓度为8%~15%。
2. 转膜：将凝胶中的蛋白质转移到膜上，常用的转膜方法有湿式转膜和半干式转膜。
常用的膜材料有PVDF膜和NC膜。
3. 阻断与孵育：将转膜后的膜放入阻断液中进行孵育，阻断非特异性结合位点，避免假阳性结果的产生。
4. 一抗和二抗孵育：将目标蛋白特异性抗体（一抗）孵育于膜上，然后孵育与一抗结合的二抗，二抗中带有标记物，例如辣根过氧化物酶（HRP）等。
5. 显色与成像：使用化学发光法或染色法，使膜上特定蛋白质形成显色带，然后使用成像系统进行成像和分析。
五、结果分析通过观察显色带的位置和强度，可以初步判断蛋白质的表达水平。
根据需要可以进行定量分析，使用专业软件测量带的强度，并与内参蛋白进行比较分析。
六、注意事项1. 样品保存：样品提取后应及时保存，避免蛋白质降解。
血清中蛋白提取方法
血清中蛋白提取方法血清中蛋白提取方法引言：血清中蛋白质的提取是生物化学和生物医学研究中非常重要的步骤之一。
血清中蕴含着丰富的信息，包括生物标志物、生长因子和激素等，这些成分对于研究疾病的发生机制以及诊断和治疗具有重要意义。
本文将介绍一些常用的血清中蛋白提取方法，帮助读者更好地理解和掌握这一技术。
一、盐析法盐析法是一种常用的分离和富集蛋白质的方法。
该方法通过在高盐浓度下使蛋白质发生沉淀，实现了与其他杂质的分离。
具体步骤如下：1. 准备工作：在试管中加入一定量的样品血清，并加入适量的盐溶液（如氯化铵溶液）。
2. 混匀：用试管摇床等设备将样品充分混匀，使盐溶液与血清充分接触。
3. 沉淀：将试管置于低温环境（如冰浴或低温离心机中）进行沉淀。
此时，沉淀的是蛋白质，而其他大部分成分仍溶于上清液中。
4. 离心：使用高速离心机将试管进行离心，离心速度和时间可根据样品的具体情况进行调整。
5. 分离：将上清液倒入新的试管中，留下的沉淀即为富含蛋白质的组分。
二、电泳方法电泳方法是一种常用的蛋白质分离和富集技术。
通过在电场的作用下，根据蛋白质的大小和电荷差异将其分离。
以下是一种常见的电泳方法：1. 准备样品：将一定量的血清样品进行处理，如去除脂肪和其他杂质。
2. 电泳凝胶：制备聚丙烯酰胺凝胶，并根据需要选择合适的凝胶浓度和孔径大小。
3. 样品加载：将样品血清溶液加载到凝胶孔中。
4. 电泳操作：将电泳装置连接到电源，并设定适当的电场强度和时间。
5. 分析和分离：在电泳运行后，通过染色或质谱等方法对蛋白带进行观察和分析，以确定所需蛋白质的位置。
三、亲和层析法亲和层析法是一种基于蛋白质与特定配体的亲和作用进行分离和富集的方法。
以下是该方法的一般步骤：1. 准备亲和层析柱：将具有亲和性的配体固定在柱子内部。
2. 样品准备：将血清样品进行前处理，如去除异物和杂质。
3. 样品加载：将经处理的血清样品加载到亲和层析柱中。
4. 洗脱：通过更改溶液条件或引入特定的试剂，洗脱所需的蛋白质。
细胞蛋白提取步骤
细胞蛋白提取步骤
细胞蛋白提取是为了获取细胞中的可溶性蛋白质，以进行后续的分析和研究。
以下是一般的细胞蛋白提取步骤：
1. 细胞采集：选择需要提取蛋白的细胞种类，并通过离心等方法将细胞收集。
2. 细胞裂解：将细胞使用裂解缓冲液裂解，以释放细胞内的蛋白质。
常见的裂解缓冲液包括RIPA缓冲液、NP-40缓冲液等。
3. 超声处理：将细胞裂解液进行超声处理，以进一步破碎细胞结构，释放蛋白质。
超声处理可以通过超声波清洗机或超声波细胞破碎仪进行。
4. 离心：将超声处理后的细胞裂解液进行离心，以去除细胞碎片和其他杂质。
5. 收集上清液：将离心后的上清液转移至新的离心管中，作为细胞蛋白提取的样品。
6. 蛋白含量测定：使用蛋白含量测定方法（如BCA、Lowry 等）测定提取的蛋白质浓度，以便后续实验设计的参考。
细胞蛋白提取步骤可能因实验目的或细胞种类的不同而有所差异。
在进行细胞蛋白提取之前，可以参考相关文献或实验方案，选择适合自己研究的步骤和试剂。
超声破碎细胞提取蛋白步骤
超声波细胞粉碎机是一种用于细胞破碎和样品制备的设备，可以用于蛋白质提取等生物实验。
下面是超声波细胞粉碎机进行蛋白质提取实验的6个步骤：
一、样品准备
在进行超声波细胞粉碎机实验前，需要准备一定量的待破碎细胞样品，并将样品进行清洗、离心和干燥等处理，以保证实验的准确性和可靠性。
二、设置参数
在选择超声波细胞粉碎机参数时，需要根据样品的特点和实验要求进行选择。
一般来说，超声波的功率、频率、时间和脉冲等参数都会影响破碎效果和蛋白质提取量。
需要根据具体情况进行调整和优化。
三、样品破碎
将待破碎的细胞样品放入超声波细胞粉碎机中，根据设定的参数进行破碎。
在破碎过程中，超声波的高强度振动能够使细胞壁破裂，释放出其中的蛋白质等有效成分。
四、提取蛋白质
破碎后的细胞样品需要进行过滤、洗涤和干燥等处理，以去除其中的杂质和核酸等成分，提取出目标蛋白质。
在这个过程中，需要注意保持蛋白质的生物活性，以避免蛋白质失活或损失。
五、蛋白质检测与鉴定
提取出的蛋白质需要进行检测和鉴定，以确定其性质和含量。
可以使用生化实验方法和仪器检测等方法进行检测和鉴定，如Western blotting、ELISA和质谱等。
六、数据分析与结论
根据实验数据进行分析和总结，比较不同参数和处理方法对蛋白质提取效果的影响，得出结论并提出建议。
同时需要对实验数据进行误差分析和可信度评估，以保证实验结果的准确性和可靠性。
WB实验步骤详细总结
蛋白提取（所有操作在冰上进行）1.裂解1)配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF在-20℃保存，提前一天4℃解冻）取2ml裂解液，加20μl PMSF混匀2)称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上述1中液体（加入液体与组织比例为20：1），冰上静置10min2.匀浆先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min3.离心（在基础4楼416室）1)自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个的离心管（①，②两个标记，③加少量超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）2)将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min离心15min3)用移液枪将上层清液取出放入①②号管中4.变性（上样缓冲液：样品=4：1）将样品转移至2~3个管中加上样缓冲液，100℃变性10min仪器屏幕：5.保存变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用WB实验步骤1.清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
2.配制分离胶1)准备：1ml枪（蓝色枪头），200μl枪（黄色枪头）10μl（白色枪头）2)10%分离胶的配置：（用50ml烧杯。
板配块胶，板配2块板）3.灌胶沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止4.水封立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，等待20-30min5.浓缩胶的配制（5%）6.电泳（电泳液最多使用两次）1)安装电泳装置低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔出防止拔歪）2)点样（不易时间过长，防止样品条带扩散）3) 连接电泳仪电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳 先调电压至70mV ，跑约20min 。