亚砷酸联合粉防己碱抗乳腺癌的作用机制研究

亚砷酸联合粉防己碱抗乳腺癌的作用机制研究研究目的和意义:近年来,中医药治疗乳腺癌在临床治疗和基础研究方面都取得了很好的进展,从中药中筛选抗肿瘤药物已成为国内外研究的热点。目前研究发现砷剂和粉防己碱(Tetrandrine,Tetra)均具有较好的抑癌作用,然而砷剂的毒性问题对其临床应用造成了一定的困扰,亟待解决。

本课题根据“防己杀雄黄毒”理论,将这两味药的有效成分砷和粉防己碱联合应用于乳腺癌细胞,从抑制乳腺癌细胞增殖的角度探讨相杀配伍是否具有协同增效以减毒的作用?并进一步从凋亡、自噬、坏死以及细胞周期阻滞等方面探索亚砷酸钠(NaAsO2)联合粉防己碱(Tetra)诱导乳腺癌细胞增殖抑制的相关分子机制,挖掘MAPK信号通路及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)在联合用药诱导细胞死亡过程中的作用。同时,研究NaAs02联合Tetra能否诱导乳腺癌细胞分化,并探索其诱导分化的具体分子机制;以及联合用药对人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的影响。

以期为临床应用NaAs02联合Tetra治疗乳腺癌提供实验依据,对中药药对的推广应用具有重要的理论和实际意义。研究方法:(1)NaAsO2联合Tetra对乳腺癌细胞增殖、凋亡、自噬、坏死以及细胞周期阻滞的影响分别以梯度浓度NaAsO2、Tetra单用及联用干预乳腺癌MDA-MB-231及T47D细胞,以XTT法检测细胞增殖情况,以流式细胞术分析检测凋亡率、细胞周期,Western-Blot法检测自噬相关蛋白、线粒体凋亡通路相关蛋白、MAPK信号通路蛋白的表达。

分别检测自噬抑制剂Wortmannin、ROS抑制剂NAC及Trolox、MAPK各信号通路抑制剂对MDA-MB-231增殖抑制率、细胞凋亡率、坏死率、细胞周期以及自

噬标志蛋白LC3、Beclin-1的影响。检测NaAsO2联合Tetra作用后细胞内ROS 含量的变化。

通过Transwell小室实验检测NaAsO2联合Tetra作用后对细胞迁移的影响。

(2)NaAsO2联合Tetra诱导乳腺癌细胞分化分别以梯度浓度NaAsO2、Tetra单用及联用干预乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7及T47D细胞,流式细胞术检测乳腺癌分化标志物ICAM-1免疫荧光,Western-Blot法检测ICAM-1、p-ERK、ERK、HER2等细胞分化相关蛋白的表达。

分别检测应用ERK抑制剂对三种细胞ICAM-1免疫荧光的影响,初步揭示联合用药诱导分化的具体分子机制。以亚砷酸注射液、汉防己甲素注射液单用及联用干预乳腺癌移植瘤裸鼠,Western-Blot法检测肿瘤组织内ICAM-1、p-ERK、ERK、HER-2等分化相关蛋白的表达。

(3)NaAsO2联合Tetra对PBMC中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的影响。用淋巴分离剂分离人外周血获得人外周血单个核细胞细胞(PBMC),分别以梯度浓度NaAsCh、Tetra单用及联用干预PBMC细胞,以XTT法检测药物对PBMC增殖的影响。

用流式细胞术检测药物干预后CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞群比例的变化,探索NaAs02联合Tetra对免疫功能的影响。研究结果:NaAsO2和Tetra单用或联用可抑制MDA-MB-231、T47D细胞的增殖,且呈剂量依赖性,并且联用效果优于单独用药。

MDA-MB-231对Tetra的敏感性高于T47D细胞,联合用药对MDA-MB-231细胞的增殖抑制效果优于T47D细胞。NaAsO2联合Tetra可诱导MDA-MB-231细胞及T47D细胞凋亡。

其诱导的MDA-MB-231细胞凋亡具有剂量依赖性及时间依赖性,为caspase

非依赖性,且联合用药增强了单独用药时的凋亡诱导效果,并可达到与他莫昔芬(TAM)一致的凋亡诱导效果。其诱导的T47D细胞凋亡与caspase-8活化有关,可能经死亡受体途径诱导凋亡。

横向比较相同药物浓度作用时两细胞的凋亡率,发现联合用药对

MDA-MB-231细胞凋亡诱导效果优于T47D细胞。细胞周期结果表明联合用药可将MDA-MB-231细胞阻滞于S期。

联合用药可明显抑制细胞迁移;经联合用药处理后的细胞,即使在不含药的

正常情况下培养,细胞迁移力也明显降低,具有一定的后移效应。NaAsO2联合Tetra可诱导MDA-MB-231细胞自噬,其诱导的自噬抑制了肿瘤细胞的生长,表现

为自噬性细胞死亡。

联合用药所诱导的自噬对凋亡没有促进作用,对细胞坏死具有一定程度的促进作用。当NaAsO2联合Tetra诱导的自噬性死亡被强烈抑制时,S期阻滞的细胞逐渐向G2/M期过渡,细胞周期在一定程度上呈现恢复趋势。

从MAPK通路蛋白水平变化及MAPK抑制剂对细胞存活率影响的结果来看,JNK、ERK、p38的表达虽然均有明显上调,但仅JNK通路与联合用药所致的细胞增殖抑制作用直接相关。NaAsO2联合Tetra所诱导的MDA-MB-231细胞凋亡和自噬均与JNK通路激活无关,其诱导的MDA-MB-231细胞S期阻滞可能与JNK通路激活有关。

NaAsO2联合Tetra可诱导MDA-MB-231细胞内ROS水平下降,并且ROS水平

的下降与联合用药诱导的增殖抑制有关。联合用药诱导的MDA-MB-231细胞凋亡、坏死、自噬与细胞内ROS水平可能无关,但其诱导的细胞周期阻滞于S期可能与ROS水平下降有关。

在体外实验中,Tetra可诱导MDA-MB-231、MCF-7、T47D细胞分化,NaAsO2可诱导MCF-7细胞分化,NaAsO2联合Tetra可诱导MDA-MB-231、MCF-7、T47D细胞分化。对MDA-MB-231细胞,联合使用NaAsO2可降低诱导分化所需使用的药物浓度;对MCF-7细胞,联合使用NaAsO2可增强两药单用时的分化诱导效果。

NaAsO2和Tetra单用或联用诱导的MDA-MB-231、MCF-7细胞分化与ERK信号通路激活有关,抑制ERK信号,其分化诱导效果也受到抑制;NaAsO2和Tetra单用或联用诱导的MDA-MB-231、MCF-7细胞分化也与HER2下调有关。在体内实验中,亚砷酸氯化钠注射液和汉防己甲素注射液单用或联用均可诱导乳腺癌移植瘤细胞分化,并且可能与ERK蛋白上调有关。

两药联用在较低的三个浓度下(0.5+0.5、0.25+0.25、0.125+0.125)对PBMC 增殖均无影响,Tetra可轻微降低CD4+CD25+Foxp3+细胞比例,但无统计学差异。不同个体的PBMC对NaAsO2的反应有较大的不同,部分人的反应同文献报道结果一致,即CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例增高,但部分人CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞比例基本无变化;两药联用也可轻微降低CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例,但无统计学差异。

结论:(1)NaAsO2联合Tetra可抑制乳腺癌细胞增殖,抑制细胞迁移,诱导细胞凋亡、自噬及细胞周期阻滞;其增殖抑制作用与JNK信号通路激活及细胞内ROS 水平降低有关;其诱导的自噬、凋亡、坏死及细胞周期阻滞之间存在一定的关系。

(2)NaAsO2联合Tetra可诱导MDA-MB-231、MCF-7、T47D细胞分化,其诱导的MDA-MB-231、MCF-7细胞分化与ERK通路激活,HER2表达下降有关。

亚砷酸氯化钠注射液和汉防己甲素注射液单用或联用均可诱导乳腺癌移植瘤细胞分化,并且可能与ERK蛋白上调有关。(3)NaAsO2联合Tetra在较低浓度