最新第七章-工业微生物原生质体育种和原生质体融合课件ppt

种类 疫霉属 毛霉属 酵母属 镰刀霉属 裂褶菌数 鬼伞属
纤维素 25 0 0 0 0 0
几丁质 0 9 1 39 5 33
其他多糖 65 44 60 29 81 50
3、制备原生质体的酶类
自然界中多种生物都能合成破坏降解菌体细胞壁的酶，如蛋 清中的溶菌酶，蜗牛消化酶，寄生性微生物合成酶。 包括： • 纤维素酶 • 酵母裂解酶 • 几丁质酶 • 商品酶：
3)酶浓度
对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类 要求不同，对酶的浓度也有差异。最佳酶 浓度还随不同的生长期的菌体而变化。
• 酶浓度合适，浓度太高对原生质体有破坏 作用，影响原生质体的再生
4)酶处理温度 :根据具体情况,细菌高,酵母 及霉菌稍低。过高的温度使酶失活，原生 质体失活；过低的温度酶活性不高，影响 原生质体细胞膜稳定性
5)破壁时的pH值:对离子强度影响较大
6)渗透压稳定剂
等渗透压在原生质体制备中起到保护原生 质体免于膨裂，有助于酶和底物的结合， 渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗 糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。
5、原生质体制备程序
• 菌体培养：液体培养 固体培养 • 收集菌体：过滤收集、离心收集无菌水冲洗 • 洗涤菌体：等渗液冲洗等渗液与酶液相同 • 酶解处理：保温酶解 稀释终止酶解，离心去酶 • 过滤分离：过滤去掉为分界菌丝体 • 查速离心：收集大小密度均一的原生质体，低速
（二）原生质体融合
1、融合亲本选育 • 选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株
原生质体融合是一随机过程，原生质体间无亲和 选择性，当两种原生质体A和B混合到一起时，发 生融合的可能性有A-A/A-B/BB其中只有A-B的融合 是有效的融合，概率为33.33%，当然还有多个原 生质体融合到一起的可能。
在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧 产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄， 触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。
膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融 合。
具体步骤
DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚是一种常用的荧光染料，它们 与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与DNA的双链 紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射 峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长正好是356nm ，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。染色标记细 胞核的位置。
2、微生物细胞壁组成
• 微生物种类不同其细胞壁结构和化学组成不同， 酶解处理的有效酶也不一样，因此要求根据微生 物种类特性选择合适的酶。
• G+:糖肽、低聚糖、多糖、蛋白质、磷壁酸、糖醛 酸磷壁酸
• G-：糖肽、磷壁酸、蛋白质、类脂、脂多糖、脂 蛋白、二氨基庚二酸、甘氨酸、阿拉伯糖、半乳 糖
真核细胞壁组成
离心其沉淀物，高速离心弃上清液，的纯化原生 质体。
原生质体的保存
较低的温度可以有效保持原生质体的活性； 细菌：48小时 放线菌：24小时 真菌0-4℃保存2天
影响原生质体存活的遗传因素
• 细菌易再生可达90%以上，有些种类也很低； • 小单孢菌只有10%； • 放线菌可达50%； • 丝状真菌“产黄青霉”40-60%。
细胞融合技术逐步扩展到植物细胞和微生物细胞 伴随者细胞融合技术的成熟。
20世纪80年代，真正意义上的细胞工程诞生了， 细胞融合现已成为细胞工程的核心技术之一。
三、原生质体融合育种的特点
1)杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件 下形成类似于球形的原生质体。
2)受接合型或致育型的限制较小：二亲株中 任何一株都可能起受体或供体的作用，因此 有利于不同种属间微生物的杂交。
第七章-工业微生物原生 质体育种和原生质体融合
第一节 原生质体育种
一、原生质体再生育种 出发菌株的选择→菌种活化和与培养→原生 质体制备→原生质体再生→高产菌株分离→ 复筛→遗传性状鉴定→菌种特性和发酵特性 研究
二、原生质体诱变育种 菌种活化和与培养→原生质体制备→原生质 体悬浮液稀释至一定浓度，取一定放入无菌 平皿中→ 紫外灯下诱变处理→ 置暗处后处 理→ 再生培养→高产菌株分离→复筛→遗传 性状鉴定→菌种特性和发酵特性研究
✓ Novozyme234来自T源自文库ichoderma harzianum
✓ Lywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶 ✓ Gglucuronidase葡聚糖甘酸酶
4、影响原生质体制备的因素
1)菌体的前处理 为了将菌作一些前处理使酶作用的效果好一 些， 如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。
2)菌体的培养时间 选择增殖期的菌体，使细胞易于原生质体化。
• 为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株一般 都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型 或抗药性等
2、原生质体融合的方法
物理法、化学法及生物法 。 原理
增加细胞间的粘附、改变膜的通透性—— 随机结合、融合
(1)物理法——电融合诱导法
在直流电脉冲的诱导下，极化产生偶极子， 彼此靠近，定向排列成串球状。
3)遗传物质传递更为完整：原生质体融合是 二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为 一的过程。
4)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融 合子的可能性。
5)有可能采用产量性状较高的菌株作融合 亲株。
6)提高菌株产量的潜力较大。 7)有助于建立工业微生物转化体系。
四、细胞融合过程
显微镜下的原生质体融合
二 、发展历史
细胞融合现象最初是在动物细胞中表现的。 1858年发现正常组织、发炎组织以及肿瘤组
织中的多核细胞情况。 1875年观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞
发生的合并现象。
1962年日本学者发现一种叫日本血凝性病毒(HVJ) 能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。
20世纪七十年代初，华裔加籍科学家高国楠发现 聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合，开拓了 植物细胞融合的研究。
融合过程中细胞膜变化
类脂质分子发生扰动和重排 导致细胞桥的形成 细胞质、核相互融合
五、原生质体融合技术
• 原生质体制备 • 原生质体纯化 • 原生质体融合 • 融合子检出 • 融合子鉴定
（一）微生物原生质体制备
1、定义及特点 定义：去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生 质体。 特点：无细胞壁，可以方便地进行遗传操 作、人工诱变、细胞器转移、细胞融合等操 作。 具有全能性，能再生细胞壁。