多次跨膜

粗面内质网的功能——蛋白质转运

粗面内质网的主要功能是帮助膜结合核糖体合成的蛋白质转运。膜结合核糖体上合成的蛋白质与游离核糖体上合成的蛋白质去向是不同的，表9-5列出了这两类核糖体合成的某

些蛋白。

表9-5 真核细胞中膜结合核糖体和游离核糖体合成的某些蛋白

由于粗面内质网上合成的蛋白质包括膜蛋白、内膜结构的腔池蛋白和分泌到细胞外的蛋白，所以必须有极好的运输机制进行分选定位，这就是信号肽假说。

■信号序列的发现和证实

● 微粒体实验

在George Palade用离心技术分离到有核糖体结合的微粒体，即发现膜结合核糖体（membrane-bounded ribosome）之后，科学家推测：膜结合核糖体合成的蛋白质首先要进入内质网的腔，然后通过选择性的分泌过程输出到细胞外，而游离核糖体上合成的蛋

白质则留在细胞内使用。

为了研究内质网上合成的蛋白质是否进入了内质网的腔，Colvin Redman 和David Sabatini用分离的RER小泡（微粒体）进行无细胞系统的蛋白质合成，证明了膜结合核

糖体上合成的蛋白质进入了微粒体的腔。

如何利用微粒体在无细胞蛋白质合成系统中的合成实验证明膜结合核糖体合成的蛋白

质进入了微粒体的腔

● Günter Blobel等的建议

为什么有些核糖体合成蛋白质时不同内质网结合，有些正在合成蛋白质的核糖体要同内质网结合，并将合成的蛋白质插入内质网？对此，美国洛克菲勒大学的Günter Blobel、David Sabatini 和Bernhard Dobberstein 等于1971年提出两点建议：

①分泌蛋白的N-端含有一段特别的信号序列（signal sequence），可将多肽和核糖体引导到ER膜上；②多肽通过ER膜上的水性通道进入ER的腔中，并推测多肽是在合成

的同时转移的。

● 信号序列存在的直接证据

1972年，César Milstein和他的同事用无细胞系统研究免疫球蛋白（IgG）轻链合成时获得了信号序列存在的直接证据，证明Blobel等的建议是正确的。他们用分离纯化的核糖体在无细胞体系中用编码免疫球蛋白轻链的mRNA指导合成多肽，发现合成的多肽比分泌到细胞外的成熟的免疫球蛋白在N端有一段多出的肽链，它有20个氨基酸，他们推测，这段肽具有信号作用，使IgG得以通过粗面内质网并继而分泌到细胞外。

● 信号序列的进一步证实

G.Blobel、B.Dobberstein、P.Walter和他们的同事在上述发现的基础上用分离的微

粒体和无细胞体系进行了大量的实验，进一步证实了信号序列的存在及其作用。

加与不加RER小泡，产物不同当将分泌蛋白的mRNA在无细胞体系中进行翻译时，如果不加粗面内质网（微粒体），获得的翻译产物比从细胞中分泌出来的蛋白要长，若添加RER小泡，翻译的产物长度与从活细胞分泌的蛋白相同。因此推测信号序列在引导蛋白进入内质网后被切除了，所以成熟的蛋白的N-端没有信号序列（图9-16）。

图9-16 信号序列在分泌蛋白质运输中的作用

（a）在不含RER小泡的无细胞体系中翻译分泌蛋白，其N-端有信号序列，故比从细胞中分泌出来的相同蛋白质肽链长；（b）在加有RER小泡的无细胞体系中翻译分泌蛋白，信号序列在RER小泡中被切除，得到的产物与从细胞中合成分泌的相同。

蛋白水解酶水解实验在分泌蛋白进行体外翻译的无细胞系统中（含有RER小泡）加入蛋白水解酶，并不能使新生肽水解。但同时加入去垢剂，则能将蛋白质水解，提示新生肽链是边合成边运输的，因为去垢剂能够破坏内质网的膜，使合成的蛋白质暴露于蛋白水解酶遭到降解。若无去垢剂，多肽在合成的同时就向内质网转运，所以不受蛋白水解酶的影响。

多聚核糖体的离体翻译

从骨髓瘤分离多聚核糖体，用去垢剂处理，使之与内质网膜分离后，继续在无细胞体系（不含RER小泡）中进行翻译，发现：短时间温育，即可得到成熟的分泌蛋白（无信号序列），而长时间的温育，得到的产物N-端有信号序列，这一结果证明了信号序列的功能。

为什么说多聚核糖体是研究内质网帮助蛋白质运输的好材料？

■信号序列的一般特征及早期信号假说

● 信号序列的一般特征

G.Blobel、B.Dobberstein、P.Walter和他们的同事在研究中还发现信号序列具有一些共同的特性：长度一般为15～35个氨基酸残基，N-末端含有1个或多个带正电荷的氨

基酸，其后是6～12个连续的疏水残基；在蛋白质合成中将核糖体引导到内质网，进入内质网后通常被切除（图9-17）。

图9-17 ER跨膜可切除信号的一般结构

● 早期的信号假说

1975年，G.Blobel和 B.Dobberstein 根据对信号序列的研究成果，正式提出了信号假说（signal hypothesis），要点是：

（1）分泌蛋白的合成始于细胞质中的游离核糖体；

（2）合成的N-端信号序列露出核糖体后，靠自由碰撞与内质网膜接触，然后靠N-端信号序列的疏水性插入内质网的膜；

（3）蛋白质继续合成，并以袢环形式穿过内质网的膜；

（4）如果合成的是分泌的蛋白，除了信号序列被信号肽酶切除外，全部进入内质网的腔，若是膜蛋白，则由一个或多个停止转移信号将蛋白质锚定在内质网膜上。

● 信号假说证明：基因重组实验

信号假说提出后得到许多实验的支持，其中最有力的一项实验结果是杂合蛋白研究的结果。黑猩猩的α-球蛋白是一种在游离核糖体上合成并存在于胞质溶胶中的可溶性蛋白，科学家在编码该蛋白的基因上接上一段编码E.coli分泌蛋白β-半乳糖透性酶（β-lactamase）的信号序列DNA，然后将该基因加入到无细胞的转录和翻译体系中，并加入从狗组织中分离的ER膜，研究结果发现，杂合蛋白出现在ER腔中，而且信号序列被切除了。这一研究结果不仅证实了信号假说的正确性，也揭示了信号序列的一个重要特性：信号序列没有特异性，并且原核生物的信号序列在真核生物中也是有效的。

● Blobel 于1972年提出信号序列的建议、1975年正式提出信号假说，揭示了细胞中不同蛋白质在合成后是如何找到自己的工作岗位的秘密，发现了蛋白质与生具来的“地址签”。这一发现开辟了一个全新的医学、细胞生物学和生物技术学的研究领域，基于他的贡献，使他获得了1999年诺贝尔医学奖。

■新蛋白复合物的发现与信号假说的补充

● 信号识别颗粒（signal recognition partical，SRP）