对流免疫电泳-复旦精品课程
对流免疫电泳的原理
对流免疫电泳的原理
流免疫电泳（immunoelectrophoresis）是一种将免疫反应与电泳结合起来的方法，用于检测和定量分析特定抗原或抗体的存在和浓度。
其原理包括以下步骤：
1. 样品制备：将待测样品中的抗原或抗体进行提取和纯化。
2. 准备电泳板：将琼脂糖凝胶块放置在电泳板上，形成一条凹槽。
在凹槽两侧分别插入两个电极。
3. 样品加载：在凹槽中将待测样品和免疫球蛋白（常常是抗体）混合，形成样品准备。
4. 电泳：将电泳板放置在含有适当缓冲液的电泳槽中，通电使得样品准备在凝胶上进行电泳运动。
根据样品带电性质的不同，抗原和抗体会在电场作用下向正或负极运动。
5. 免疫沟槽：当样品准备在电场作用下运动时，抗原和抗体会形成一定的沟槽，其中抗原移动的远一侧为阳极端，抗体移动的远一侧为阴极端。
6. 静置：在电泳完成后，允许抗原和抗体在凝胶中进行免疫反应。
抗原与抗体之间的特异性结合会形成可见的免疫沉淀线。
7. 结果解读：根据免疫沉淀线的形状、长度和强度，可以判断待测样品中特定抗原或抗体的存在和相对浓度。
总的来说，流免疫电泳的原理是在电泳过程中，利用抗原与抗体之间的特异性结合作用使其在电场作用下形成免疫沉淀线，并通过观察和解读沉淀线的特征来进行分析和定量。
对流免疫电泳操作方法
对流免疫电泳操作方法
对流免疫电泳（CIEP）是一种检测样本中蛋白质的方法。
以下是其操作步骤：
1. 准备样本：将待测的样本加入缓冲液中，并进行混合。
可以将分离物、血浆、血清等作为样本。
2. 准备电泳缓冲液：根据试剂盒说明书或自己的需求，配制电泳缓冲液，并根据实验设计制作所需的pH值和离子强度的缓冲液。
3. 准备抗体：将合适浓度的抗体加入电泳缓冲液中，并进行混合。
4. 将样本和抗体混合：将样本和抗体混合，并在室温下反应一段时间。
5. 将混合物加到电泳槽中：将混合物注入CIEP槽中，并将电极插入电泳槽中。
6. 进行电泳：将电泳槽连接到电源，设置所需的电压和时间进行电泳。
7. 可视化蛋白质：将电泳后的蛋白质进行染色，如使用银染或卡斯林蓝染。
8. 结果分析：根据样品和抗体的反应，可以得到样品中是否存在特定的抗原或蛋白质。
免疫学实验 对流免疫电泳
1
Ab
2 Ag
3
Ab：甲胎蛋白诊断血清 Ag：1、肝癌病人血清（阳性对照）
2、正常人血清（阴性对照） 3、待测血清
电泳
• 将加好样品的板置于电泳槽上，抗原孔置 负极端，抗体孔置正极端。琼脂板两端分 别用四层纱布与0.05mol/L、PH8.6的缓 冲液相连，接通电源。电流以玻片的宽度 计算，为4mA/cm；电压以玻片的长度计 算，为6V/cm；通电30-60min后，切断 电源，观察结果
实验二 对流免疫电泳
一、实验目的 1.掌握对流免疫电泳的原理。 2.掌握对流免疫电泳检测待测抗原的方法。
二、实验原理
• 对流免疫电泳实质上是定向加速的双向免 疫扩散技术。
• 在pH8.6的缓冲液中，蛋白质抗原带负电 荷向正极泳动；而抗体大部分属于Ig，由 于分子量大，暴露的极性基团较少，在离 子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影 响向负极泳动，在抗原抗体相遇的最适比 例处形成乳白色沉淀线。
四、实验步骤
• 琼脂糖凝胶板的制备 • 打孔、加样 • 电泳 • 结果观察 • 影响结果的因素
制板、加样、打孔
• 用吸管吸取4ml加热溶化的琼脂铺在载玻片 上,待凝。
• 打孔:用打孔器在琼脂板上打孔(孔距4mm), 如图。
• 加样:将待测抗原样品约10ul加在阴极侧孔 内,抗血清加在阳极侧,加样时应加满小孔但 不能溢出
五、结果和讨论
• 将玻片对着光，先观察AFP阳性血清孔与 抗体孔之间的白色沉淀线，然后再观察待 检血清孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出 现，如有沉淀线，则表示AFP试验阳性， 否则AFP试验为阴性。如沉淀线不清晰， 可把琼脂板放在湿盒中37℃数小时或置电 泳槽过夜再观察。
甲胎蛋白检测意义：
对流免疫电泳
对流免疫电泳概述对流免疫电泳（convection-enhanced immunoelectrophoresis，CEIE）是一种以免疫电泳技术为基础的新型免疫分析技术，也称作免疫对流电泳。
该技术利用特定的对流流动作用，使电泳操作更加稳定和方便，并能够大幅提高样品的灵敏度和准确性。
同时，对流免疫电泳也逐渐被应用于多项临床和实验室检测任务中。
原理对流免疫电泳是一种以聚丙烯凝胶为基质，将试验物聚焦于水平位移平衡的技术。
在试验过程中，聚丙烯凝胶中的样品水平运动会被一个垂直方向的空气流覆盖，形成对流效应，从而使凝胶样品的水平位移保持平衡。
该对流效应可以削减因重力差异而导致的样品层析效应，使得电泳分离更为稳定和准确。
此外，对流免疫电泳还采用一些辅助技术以增强其灵敏度。
例如，将电泳板倾斜，或者增加凝胶浓度都可以提高对流免疫电泳的敏感度。
这些辅助技术都能帮助样品快速进入凝胶中，并且更快速地与抗体结合。
应用对流免疫电泳在临床检测中已经得到了广泛的应用。
例如，对于一些癌细胞检测任务中，样品比较粘稠，传统的免疫电泳无法满足敏感度和特异性要求。
然而，通过使用对流免疫电泳技术，可以更加容易地进一步提高检测的精度和准确性。
此外，对流免疫电泳还可以应用于其他生物样品的检测中，如血清、尿液、脑脊液等。
因此，它在计量、生物药物、食品等许多其他领域也得到了广泛的应用。
优点和局限性对流免疫电泳技术有许多明显的优点。
首先，该技术能够提高样品的敏感度和特异性，从而确保测试结果更加准确和可靠。
其次，对流免疫电泳具有快速的操作速度，并且可靠性较高。
此外，这种技术对富含粘稠物的样品也非常适用。
因此，这种技术受到了广泛的青睐。
尽管对流免疫电泳技术存在很多优点，但仍然存在一些局限性。
例如，在一些情况下，可能会出现样品重叠和遮挡的现象，使得检测时出现误差。
此外，这种技术的设备和实验室条件要求较高，操作工作复杂，具有很高的技术门槛。
因此，在操作过程中必须掌握相关的技术。
免疫实验,对流免疫电泳 ,免疫比浊溶血实验
免疫实验,对流免疫电泳 ,免疫比浊溶血实验免疫实验是生命科学中非常重要的一种实验技术，它通常用于检测血清中抗体或其它免疫反应分子的含量、识别特定的分子结构，以及鉴定抗原和抗体的交互作用等。
其中涉及到的技术手段也非常繁多，下面我将着重介绍对流免疫电泳和免疫比浊溶血实验这两种技术。
对流免疫电泳是一种利用电泳和抗体-抗原交互作用原理的分析技术。
它可以快速地分离和检测出血清中的不同类型免疫球蛋白。
具体操作步骤如下：首先，将需要检测的血清标本加入一种被分离物抗体浸渍的石蜡条或高分子凝胶中，拍平并等待凝胶凝固。
然后，加上一种被检测的抗原标记物，通常使用放射性同位素、酶或荧光染料作为标记。
当抗体与抗原结合时，这些标记物也随之紧密结合在其上，形成复合物。
随着复合物的形成，它们在凝胶中开始移动，直到其达到与该复合物大小同等的电荷质量比。
然后，加上电场，复合物将沿电场布局在凝胶中，从而形成一条与电场方向大致平行的对流带。
在对应位置破裂凝胶，分析不同样品的对流带，可以快速、准确地确定其免疫球蛋白的种类和含量。
免疫比浊溶血实验是一种利用血清中抗体与相应抗原间的特异性结合作用引起溶血反应析出现象，以检测抗体的含量和活性的实验方法。
在此实验中，我们需要将血清和口香糖酐混合，使其等比例溶解，然后加入一定浓度的相应抗原（通常为红细胞抗原）。
随着抗体与抗原结合，它们最终会形成网状复合物，从而导致红细胞溶解，此过程可观察到裂解和溶解反应的现象。
通常情况下，使用抗人丙型溶血球素（血型试剂）作为抗原，将其加到不同的稀释血清中，通过测量反应光密度，可以得到抗体与抗原之间的复合和溶解反应程度。
免疫比浊溶血实验的优点是检测速度快，灵敏度高，适用范围广泛。
总之，免疫实验技术在生命科学研究中扮演着极为重要的角色，对流免疫电泳和免疫比浊溶血实验是其中的两种典型代表。
我们可以根据自己的需要和实验目的，灵活选择适当的技术手段，以提高实验效率和准确度，为揭示生命科学研究中一些重要的问题提供更加全面和精准的解答。
对流免疫电泳
对流免疫电泳对流免疫电泳（⼀）原理将抗原和抗体分别加⼊半固体琼脂孔内，在碱性缓冲液中进⾏电泳时，蛋⽩质抗原带负电荷，在电场中由阴极向阳极移动。
抗体等电点较抗原⾼，在此缓冲液中带阴离⼦少，分⼦量⼤，泳动较慢，同时因电渗作⽤（电渗是电场中溶液对于固体的相对移动，琼脂是酸性物质含有较多的硫酸根，在碱性缓冲液中带负电，⽽与它接触的溶液带正电，因此液体向阴极移动，产⽣电渗），反⽽向阴极泳动，这样就使抗原、抗体在电场中相对移动，⽽形成对流。
经过⼀定泳动时间后，在⽐例最适处，形成⾁眼可见的⽩⾊沉淀线。
由于电场作⽤，限制了抗原和抗体多⽅向的⾃由扩散，加速了泳动的速度，缩短了反应时间，提⾼了灵敏度。
（⼆）器材与试剂1．器材（1）电泳仪、电泳槽（2）载玻⽚（3）刻度吸量管（4）打孔器和图形卡（5）⽑细管（6）吸⽿球（7）煮沸消毒⽔浴箱2．试剂（1）1.2％琼脂凝胶（2）⽣理盐⽔（3）抗原（4）抗体（5）pH8.6 0.1M巴⽐妥缓冲液（三）操作步骤：1．取热熔的1.2％琼脂凝胶3.5ml，⽴即浇于载波⽚上，使琼脂平铺于整个玻⽚。
待⾃然冷却凝固。
2．⽤打孔器按图形打孔，再⽤针尖挑去孔内琼脂。
3．将抗原和抗体⽤⽣理盐⽔分别稀释成1:8浓度。
4．⽤⽑细管按顺序将抗原加⼊第1孔中。
将抗体加⼊第2孔中。
每孔加满为⽌，（注意防⽌溢出孔外）。
5．将琼脂凝胶玻⽚放⼈pH8.6 0.1M巴⽐妥缓冲液的电泳槽中，抗原端接负极，抗体端接正极，琼脂两端⽤四层纱布搭桥。
6．电泳，电压为110V，泳动时间30－45分钟。
7．关闭电源。
8．观察结果：从电泳槽内取出琼脂板，对光观察抗原与抗体之间有否⽩⾊沉淀线，出现沉淀线最佳⽐例和最⾼稀释度是多少，并绘出沉淀线的位置、数量、形态。
（四）注意事项1．浇板时，琼脂⾯要铺平。
2．加样时避免样品溢出孔外。
免疫学实验教学（复旦大学）实验报告
实验二： 对流免疫电泳实验报告实验者：毛寰宇 时间：2015年3月25日 合作者：周鹏、张国栋一、实验原理对流免疫电泳是双向琼脂扩散与电泳分析的结合产物。
CIEP 是一种加速的免疫双扩散技术。
在琼脂糖凝胶平板的两个孔中分别加入抗原和抗体，抗体侧连接电源正极。
通电后，带负电荷的抗原向抗体孔方向移动，而抗体则由于电渗作用被带向抗原孔侧。
两者相遇时形成沉淀物。
可用于检测抗原，但敏感性较低。
在pH8.6的缓冲液中，大部分蛋白质抗原成分（等电点约3~5）常带较强的负电荷，在电场中向正极移动；而作为抗体的IgG ，等电点偏高(约为5~6)，在pH8.6时带负电荷较少，再加上分子量较大，移动速度慢，所以它本身向正极移动缓慢甚至不移动，这样它就会在凝胶的电渗作用下，随水流向负极，电渗引向负极移动的液流速度超过了IgG 向正极的移动，因此抗体移向负极，在抗原抗体最适比处形成沉淀线。
二、实验材料1、抗原 & 抗体2、微量可调加样器、加样头、玻片3、打孔器、针头、打孔样纸（均放平皿内）4、电泳液、电泳槽、电泳仪、标签纸5、1.2%琼脂糖(加热溶化）、5ml 刻度吸管、吸耳球三、实验步骤1、制版与打孔：取洁净玻片，将1.2%融化的琼脂3~4ml 均匀浇注于玻片上，厚度约1.5~2.0mm 。
待琼脂凝固后，放置于打孔样纸上，按样纸上图形打孔。
2、用水倍比稀释抗体：原液、1: 2、1: 4、1: 8。
3、加样：在加样孔中加入5 μl 待测抗原样品（人IgG ）和抗体（羊抗人IgG 血清）。
靠近负极的孔中加入抗原，正极端的孔中加入抗体，玻片标记抗原抗体方向。
4、电泳：将已加样的琼脂板平放于电泳槽内，以纱布为桥，电压为100v ，时间约30min 。
四、实验结果图1：实验电泳结果A.原液、1:2、1:4稀释抗体条件下均可见沉淀线；1:8稀释度不能见沉淀线。
B.抗体稀释到1:2后，可见沉淀线向抗体侧移动。
1:2和1:4条件下沉淀线位置差异较小。
对流免疫电泳的原理
对流免疫电泳的原理对流免疫电泳的原理1. 引言对流免疫电泳（Capillary Electrophoresis-Immunosorbent Assay，CE-ISA）是一种结合了电泳技术和免疫分析原理的高灵敏度生物分析方法。
其原理基于离子迁移和免疫反应的相互作用，可以快速、准确地检测和定量分析目标分子。
2. 原理介绍对流免疫电泳主要由免疫反应和电泳分离两个步骤组成。
在电泳毛细管内涂覆一个特定抗原或抗体（通常是抗体）的固相材料，以形成免疫反应界面。
当样品中的目标分子与固相材料上的特异抗体结合时，会形成抗原-抗体复合物。
通过施加电场，驱动这些复合物在电泳毛细管内进行迁移分离。
3. 免疫反应对于对流免疫电泳，关键的一步是选择和固定特异性抗体或抗原在固相材料上，以确保特异性的免疫反应。
这样可以确保目标分子与固相材料上的抗体结合，从而形成抗原-抗体复合物。
4. 电泳分离电泳分离是对流免疫电泳的核心步骤。
通过施加电场，使复合物在电泳毛细管内迁移。
复合物的迁移速度受到多种因素的影响，如电场强度、毛细管尺寸、载流液和样品pH等。
这些因素的调节可以实现目标分子的高效分离和定量测量。
5. 优势与应用对流免疫电泳具有许多优势。
该方法具有高灵敏度和高选择性，可以检测到极低浓度的分子。
对流免疫电泳快速、自动化，适用于大规模样品分析。
该方法可以分析多种复杂样品，如血清、尿液和细胞提取物等，并广泛应用于生物医学、环境监测和食品安全等领域。
6. 个人观点和理解对流免疫电泳是一种非常有潜力的生物分析方法。
其结合了电泳技术和免疫分析原理的优势，可以在较短的时间内准确地检测和定量分析目标分子。
这种方法在生物医学、环境监测和食品安全等领域具有广泛的应用前景。
然而，对流免疫电泳方法仍需进一步的改进和优化，以提高其灵敏度和稳定性，并解决样品预处理和复杂样品矩阵的干扰等问题。
总结对流免疫电泳是一种结合了电泳技术和免疫分析原理的高灵敏度生物分析方法。
对流免疫电泳
原理
在pH值8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白只带有微弱的负电荷，而且它分子又较大，所以泳动慢，受电渗作用 的影响也大，往往不能抵抗电渗作用，故在电泳时，反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷，分 子又较小，所以泳动快，虽然由于电渗作用泳动速度减慢，但仍能向正极泳动。如将抗原置阴极，抗体置阳极， 电泳时，两种成分相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇，并在比例适当的地方形成肉眼可见的沉 淀线。这样由于电泳的作用，不仅帮助抗体定向移动，因而加速了反应的出现，而且也限制了琼脂扩散时，抗原 抗体向四周自由扩散的倾向，因而也提高了敏感性，本法比琼脂扩散法的灵敏度要高10～16倍，而且反应时间短， 可用于各种蛋白的定性和半定量测定。
对流免疫电泳
介绍
01 原理
03 观察结果
目录
02 操作方法 04 注意事项
对流免疫电泳是免疫电泳技术中的一种，还包括免疫电泳、火箭电泳等方法。
在pH值8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白只带有微弱的负电荷，而且它分子又较大，所以泳动慢，受电渗作用 的影响也大，往往不能抵抗电渗作用，故在电泳时，反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷，分 子又较小，所以泳动快，虽然由于电渗作用泳动速度减慢，但仍能向正极泳动。如将抗原置阴极，抗体置阳极， 电泳时，两种成分相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇，并在比例适当的地方形成肉眼可见的沉 淀线。这样由于电泳的作用，不仅帮助抗体定向移动，因而加速了反应的出现，而且也限制了琼脂扩散时，抗原 抗体向四周自由扩散的倾向，因而也提高了敏感性，本法比琼脂扩散法的灵敏度要高10～16倍，而且反应时间短， 可用于各种蛋白的定性和半定量测定。
对流免疫电泳
实验方法
制板（3－4ml琼脂）
打孔
加样
电泳（30min左右）
抗 抗 体 原
观察
实验结果
断电后，将玻板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者
则在抗原抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。如
沉淀线不清晰，可把琼脂板放在湿盒中37℃数小时或置电 泳槽过夜再观察(为什么？)。
实验结果
① Ag为阳性 ② Ag为弱阳性 ③ Ag为强阳性 ④ Ag为强阳性
环状沉淀反应
絮状沉淀反应
实验原理
琼脂扩散实验:
可溶性抗原和抗体在琼脂中扩散，相遇，在适当比例下形成沉淀
线或沉淀环。
分类: 单向琼脂扩散实验: 仅抗原或抗体扩散 双向琼脂扩散实验: 抗原和抗体同时扩散
实验原理
单向琼脂扩散实验:
即将一定量的抗体混合于琼脂中，待琼脂凝固后打孔并加入 抗原，孔中的抗原向四周扩散，在抗原与抗体的比例合适处 呈现白色的沉淀环。沉淀环的大小与抗原的浓度成正比，故 该试验是定量试验。
实验材料
1. 抗原&抗体 2. 微量可调加样器、加样头、玻片、记号笔 3. 打孔器、针头、打孔样纸（均放平皿内） 4. 电泳液、电泳槽、电泳仪
5. 1.2℅琼脂糖(加热溶化）、5ml刻度吸管、吸耳球
电泳液 0.05M（pH8.6 ）巴比妥缓冲液：巴比妥1.84克，巴比妥钠 10.3克，加蒸馏水1000毫升。 1.2℅琼脂糖：以0.025M的巴比妥缓冲液配制，12g琼脂糖加入1L缓 冲液中，加热融化。
实验结果
注意事项：
1. 琼脂板一定平整、光滑 (无气泡) 。 2. 打孔的时候，保证加Ag和Ab的孔在同一水平线上。 3. 孔中液体(Ag,Ab)不宜过多。 4. 使用加样枪时，最好在其量程内使用；使用完毕后调
医学免疫学实验二 对流免疫电泳
双向琼脂扩散试验:
➢ 将抗原和抗体分别加入琼脂对应的孔中 ，二者会向四周扩散，在二者比例合适处 形成白色沉淀线。
免疫电泳技术 Immunoelectrophoresistechnique
➢ 对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis ，CIEP）：即双扩+电泳，具有快、高敏感等优点， 但分辨力低。
琼脂扩散试验
➢ 定义：可溶性抗原与抗体在含有电解质的半固体 凝胶(琼脂/琼脂糖)中进行的一种免疫沉淀试验。 琼脂起到网架作用，其含水量高达99%使可溶性 抗原与抗体在其间可以自由扩散，若抗原与抗体 比例合适，在相遇处可形成白色沉淀线，称阳性 反应。沉淀线在凝胶中可长期保持原位并可经染 色后干燥保存。
琼脂凝胶
pH 8.6
0.05M 巴比妥缓冲液:
巴比妥
1.84g
巴比妥钠 10.3g
加蒸馏水至1000ml
调pH至8.6
蛋白质在酸性溶液中易变性，在偏碱溶液中比较 稳定，所以蛋白质电泳大多用pH8.2～8.8的巴比 妥或硼酸缓冲液，在这种pH中，血清蛋白由于等 电点的原因一般都带负电荷。
在凝胶电泳中，首先应用的是琼脂电泳，具有下列优点： ➢ 琼脂含98-99%液体，近似自由电泳，但是样品的扩散度
实验结果
断电后，将玻板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者 则在抗原抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。
思考：
1）对流免疫电泳的注意事项
2）如果结果没有出现白色沉淀线，该做何分析
请在下周上课前交齐本次实验报告。
➢ 沉淀线(带)对抗原与抗体具有特异的不可透性， 而非特异者则否。所以一个沉淀线(带)即代表一 种抗原与抗体的沉淀物。
对流免疫电泳原理
对流免疫电泳原理对流免疫电泳是一种用于分离和检测蛋白质的方法，它结合了电泳和免疫学的原理。
在对流免疫电泳中，蛋白质首先在凝胶中进行电泳分离，然后通过免疫学技术进行检测。
这种方法可以用于研究蛋白质的结构、功能和相互作用，对于生物医学研究具有重要意义。
对流免疫电泳的原理基于蛋白质的电泳迁移特性和免疫学检测技术。
首先，蛋白质在电场作用下在凝胶中进行迁移，根据其分子量和电荷的不同，蛋白质会在凝胶中形成不同的带状。
然后，通过将凝胶与抗体反应，可以检测特定蛋白质的存在和浓度。
这种方法结合了电泳的分离能力和免疫学的高灵敏度，可以实现对蛋白质的高效分离和检测。
对流免疫电泳的步骤包括样品制备、电泳分离和免疫检测。
首先，样品需要经过处理，如蛋白质的提取和纯化，以确保样品的纯度和稳定性。
然后，样品被加载到凝胶中进行电泳分离，根据蛋白质的特性，可以选择不同类型的凝胶和电泳条件。
分离完成后，凝胶需要进行固定和染色处理，以便观察蛋白质的分离带。
最后，通过将凝胶与特异性抗体反应，可以检测特定蛋白质的存在和浓度。
对流免疫电泳具有许多优点。
首先，它可以实现对复杂混合物中蛋白质的高效分离和检测，对于研究蛋白质组学具有重要意义。
其次，对流免疫电泳具有高灵敏度和特异性，可以检测低浓度的蛋白质，并且可以选择特定的抗体进行检测。
此外，对流免疫电泳的操作简单，不需要昂贵的仪器设备，适用于实验室的常规操作。
总之，对流免疫电泳是一种重要的蛋白质分离和检测方法，它结合了电泳和免疫学的原理，可以实现对蛋白质的高效分离和检测。
它在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用前景，对于揭示蛋白质的结构、功能和相互作用具有重要意义。
希望本文对对流免疫电泳的原理有所帮助，谢谢阅读！。
实验2 对流免疫电泳
琼脂扩散技术 ●双向琼脂扩散:
将抗原和抗体分别加入琼脂对应的孔中，二者会向 四周扩散，在二者比例合适处形成白色沉淀线。
●单向琼脂扩散:
将一定量的抗体混合于琼脂中，待琼脂凝固后打孔并加入 抗原，孔中的抗原向四周扩散，在抗原与抗体的比例合适处 呈现白色的沉淀环。沉淀环的大小与抗原的浓度成正比，故 该试验是定量试验。
实验步骤
制板
3－4ml 琼脂
打孔
加样 (5-6ul)
抗体 原倍
抗体 1:2
抗原 抗原
抗体 1:4
抗体 1:8
抗原 抗原
电泳（100V, 30min)
制板与打孔 取洁净玻片，将1.2%融化的琼脂3~4ml均匀 浇注于玻片上(注意不要让琼脂凝掉），厚度约1.5~2.0mm。 待琼脂凝固后，放置于打孔样纸上，按样纸上图形打孔，。
思考题
1.将抗原稀释不同比例后，实验结果有何差异？出现 差异的原因是什么？ 2.实验过程中应该注意什么问题？
请在下周上课前交齐本次实验报告
琼脂中含抗体
Ag
Ag
Ag
Ag
电泳
带电颗粒在电场作用下，向 着与其电性相反的电极移动。
影响电泳迁移速度的因素： 1、带电颗粒的性质：电荷多、分子小泳动快 2、溶液中pH值： pH值离pI越远，解离多，电荷多泳动快 3、电渗作用 4、溶液的离子强度：低离子强度时，迁移速度快 5、电场强度：单位厘米的电位差 越大泳动快 6、吸附作用：介质对样品的滞留作用拖尾
一般抗原蛋白质带负电 荷，虽然也受电渗作用的 影响，但它的电泳迁移率 远远大于电渗作用。
电场力
电渗力
负
极
抗原
正
抗体
极
将抗原置于负极，将抗体置于正极，电泳后则在 两孔之间相遇，并在比例适当的部位形成肉眼可 见的沉淀线。
沉淀反应——对流免疫电泳
沉淀反应——对流免疫电泳沉淀反应是一种常用的实验技术，用于分离和富集特定的分子或蛋白质。
通过反应产生的沉淀可以进一步用于分析、鉴定等目的。
对流免疫电泳是一种结合了沉淀反应和电泳技术的新型方法，可以用于快速、高效地检测特定抗原或抗体在复杂混合物中的存在与浓度。
在下面的文中，我将介绍一些与对流免疫电泳相关的内容。
1. 对流免疫电泳的原理对流免疫电泳是一种将免疫学反应与电泳技术结合的方法。
该方法基于抗原和抗体之间的特异性识别，通过在电泳过程中形成免疫复合物，使目标物质在电场作用下沉淀成固定位置的条带。
该原理可以用以下步骤描述：样品中的抗原与标记化的抗体结合，形成抗原-抗体复合物；电泳平台上的固相区域覆盖着特定抗原或抗体的亲和剂，使复合物与固相结合；施加电场使复合物向电极移动，过程中，复合物和非特异性物质会发生竞争，仅有特异性物质能够形成沉淀条带。
2. 对流免疫电泳的优势对流免疫电泳具有许多优势，使其在生物医学研究领域得到广泛应用。
首先，对流免疫电泳是一种高度特异性的检测方法，能够对目标物质进行高效的富集和分离，同时避免非特异性的干扰。
其次，对流免疫电泳具有较高的灵敏度和准确性，能够在样品中检测到非常低浓度的抗原或抗体。
此外，对流免疫电泳是一种快速的分析方法，通过合理的实验设计和条件优化，可以在短时间内完成样品的检测和分析。
最后，对流免疫电泳不需要昂贵的设备和专门的实验技术，具备较低的成本和操作的简便性，使其具有良好的实用性和广泛的应用前景。
3. 对流免疫电泳的应用领域由于对流免疫电泳的优势，它在许多领域都得到了广泛的应用。
首先，对流免疫电泳在生物医学研究中常被用于分析和检测血清中的特定抗原或抗体，帮助诊断和监测各种疾病。
其次，对流免疫电泳在药物研发和生物制药领域也得到了应用，用于药物代谢产物、细胞毒性物质和蛋白质的分析。
此外，对流免疫电泳还可用于农业生物技术、食品安全和环境监测等方面的研究，用以检测农药残留、食品中的有害物质和环境中的污染物。
医学免疫学：对流免疫电泳
主要的试剂和器材
• 抗原：AFP • 待测抗体：抗AFP？ • 巴比妥缓冲液 • 1.5%琼脂（巴比妥缓冲液配制） • 载玻片、打孔器、微量进样器 • 37℃水浴箱
实验步骤
• Байду номын сангаас板 用10ml的移液管取4.5ml 1.5％琼 脂巴比妥缓冲液，浇于洁净的载玻片上， 待其冷凝。
• 打孔 用打孔器打孔，如图。孔间距 10mm。挖取孔中的琼脂。
• 微量进样器每加一个样品之后，就得清洗。
中央偏左
• 加样 (如图）每孔加样10μι。 • 电泳 接通电源，电压100～120V，电泳1h。
加抗原 加抗体
实验现象
• 抗原与抗体两孔之间形成沉淀线。 • 画出实验现象。 • 如果有沉淀线，则说明待测标本中含有与
抗原相对应的抗体（即抗AFP）。
注意事项
• 浇制琼脂板时，要均匀、平整、薄厚一致，无 气泡，布满整张玻片。
• 孔要打得圆整光滑，边缘不要破裂。搭桥时， 应注意纱布与凝胶接触紧密，否则会是电流不 均匀，导致沉淀线歪斜、不均匀。
• 打孔时，注意孔间距离为小于等于10mm，不 能太大，否则在本实验规定的电压和时间内电 泳不会出现沉淀线，需要加大电压和/或加长电 泳时间。
• 电泳完毕，应先断开电源，在取出电泳板，以 防止积蓄电压触电。
打孔时注意孔间距离为小于等于10mm不能太大否则在本实验规定的电压和时间内电泳不会出现沉淀线需要加大电压和或加长电泳时间
对流免疫扩散
实验原理
• 对流免疫电泳实验时将双向免疫扩散与电 泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。蛋 白质抗原、抗体在电场中作定向加速免疫 双扩散，从而加速沉淀线的形成。
• 在偏碱性的缓冲液环境和适当的直流电场 中，大部分抗原带负电荷，向阳极移动； 而抗体大部分是IgG，其等电点与环境中的 pH接近，故极性基团解离很少；另外，由 于其分子量大，加上电渗作用使其缓慢向 阴极移动，在一定时间内（30min90min），抗原与抗体两孔之间或抗体的 另一侧形成沉淀线。
沉淀反应——对流免疫电泳
沉淀反应是一种常见的实验方法，广泛应用于生物医学研究和工业生产中。
对流免疫电泳是一种利用沉淀反应来检测特定抗体或抗原的方法。
本文将从沉淀反应和对流免疫电泳的原理、原料准备、实验步骤、结果解释等方面进行详细介绍。
1.沉淀反应的原理沉淀反应是指溶液中两种物质（通常是抗原和抗体）结合形成可视的沉淀物。
在免疫电泳中，抗原和抗体的结合是基于亲和力原理，即抗原和抗体之间的特异性结合。
通过进行沉淀反应，可以将待测物质与其他不相关的物质分离出来，并产生可见的沉淀带。
2.对流免疫电泳的原理对流免疫电泳是在电场的作用下，通过对流的形成将沉淀反应进行分离和检测的方法。
其原理基于电泳迁移率的差异。
在电场作用下，凝胶中的带电物质会向电极迁移，迁移速率取决于其电荷量、分子大小和凝胶孔道大小。
通过对凝胶中不同带电物质的迁移情况进行观察，可以进行沉淀反应的定性和定量分析。
3.原料准备进行对流免疫电泳需要准备以下原料：•小的平行板电泳槽：用于放置凝胶和进行电泳。
•聚丙烯酰胺凝胶：用于分离待测物质。
•抗原和抗体：待检测的特定抗原和相应的抗体。
•缓冲溶液：调节pH值和离子浓度，以维持免疫反应的条件。
•对流带电盐（例如亚硝酸钠）：用于产生对流效应，加速免疫反应的结果显示。
4.实验步骤（1）制备凝胶：按照聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，制备适当浓度和凝胶浓度的凝胶。
（2）样品制备：将待测物质（抗原）与其相应的标记物质（例如酶）结合，以便在凝胶上形成可见的沉淀带。
（3）电泳：将凝胶浸入电泳槽中的缓冲溶液中，施加恒定电场进行电泳。
（可根据实验要求进行冲洗和固化等步骤）（4）对流实验：在电泳进行的过程中，添加适量的对流带电盐到电泳槽中，观察沉淀带在凝胶中的迁移情况。
（5）结果解释：通过观察凝胶上的沉淀带的位置、形状和强度，可以判断特定抗原和抗体的有无、浓度以及亲和力的强弱。
5.结果解释对流免疫电泳的结果解释主要依赖于沉淀带的位置、形状和强度。
例如，如果在观察的凝胶中出现一个明亮且窄的沉淀带，通常表示特定抗原和抗体之间有很强的亲和力，即表明样品中含有特定抗原。
对流免疫电泳的原理
对流免疫电泳的原理
流免疫电泳是一种基于免疫反应原理的电泳技术。
它将免疫反应与电泳结合，能够通过观察样品中的抗原与抗体的反应情况来检测抗原的存在与性质。
流免疫电泳的原理如下：
1. 准备样品：将待测样品中的抗原分离、提取或纯化出来，并将其溶解、稀释至一定浓度。
2. 准备电泳凝胶：在电泳槽中铺设一层聚丙烯酰胺凝胶，形成凝胶槽。
3. 加载样品：将待测样品注入凝胶槽内，通常通过浸渍或孔穴装载法。
4. 进行电泳：施加电场，使样品开始在凝胶中运动。
由于凝胶中具有不同电荷的颗粒（如抗原和抗体），它们会在电场作用下产生迁移。
5. 免疫反应：待测抗原与已知特异性抗体在凝胶中发生免疫反应。
如果待测抗原存在于样品中，则它们会与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
6. 染色与可视化：在免疫反应发生后，可以通过染色（如共沉淀染色、辐射追踪染色等）来可视化抗原-抗体复合物在凝胶中的位置。
7. 解读结果：根据样品中抗原的位置、带电性以及抗体的特异性等信息，可以判断待测抗原是否存在，以及抗原的分子量、浓度等性质。
总之，流免疫电泳利用电泳技术将待测样品中的抗原与特异性抗体相互作用，并通过电泳和染色等方法进行可视化，从而实现对抗原的检测与分析。
对流免疫电泳实验报告
对流免疫电泳实验报告
本实验旨在探究对流免疫电泳技术在生物医学领域中的应用，以及其在分析蛋白质和其他生物大分子方面的优势。
对流免疫电泳是一种结合了电泳和免疫学原理的新技术，通过对样品进行电泳分离，并利用抗体特异性识别目标蛋白质，从而实现对蛋白质的定量和定性分析。
实验中，我们首先准备了样品，包括目标蛋白质和其他可能存在的干扰物质。
然后，我们将样品加载到对流免疫电泳仪中，通过电场力和对流效应使样品在凝胶中进行分离。
接着，我们使用特异性抗体与目标蛋白质结合，形成免疫复合物。
在电泳结束后，我们进行染色和成像，观察并记录样品的分离情况。
实验结果显示，对流免疫电泳技术能够有效地分离出目标蛋白质，并且具有较高的灵敏度和特异性。
与传统的凝胶电泳相比，对流免疫电泳技术能够更快速、更准确地分析样品中的蛋白质成分，同时避免了凝胶电泳中可能出现的假阳性和假阴性结果。
此外，对流免疫电泳技术还可以应用于生物医学研究和临床诊断中。
通过对样品中蛋白质的定量和定性分析，可以帮助科研人员更好地理解生物学过程，发现新的生物标志物，为疾病诊断和治疗提供重要参考。
因此，对流免疫电泳技术具有广阔的应用前景。
总的来说，对流免疫电泳技术作为一种新型的生物分析方法，具有许多优势，包括高灵敏度、高特异性、快速分析速度等。
在未来的研究和应用中，我们可以进一步优化实验条件，拓展对流免疫电泳技术的应用领域，为生物医学领域的发展做出更大的贡献。
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实验材料
待测抗原、已知抗体 1.2℅琼脂(agar)电泳液、电泳槽、电泳仪 打孔器、玻片、打孔样纸、针头 5ml刻度吸管、洗耳球、微量加样器、枪头
等电点
➢ 等电点（pI）：在某一PH的溶液中，氨基酸或 蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相 等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH 成为该氨基酸或蛋白质的等电点。
➢ 当外界溶液的pH大于两性离子的pI值，两性离 子释放质子带负电。当外界溶液的pH小于两性 离子的pI值，两性离子质子化带正电。
电场力
负
极
抗原
正
抗体
极
电渗力
将抗原置于负极，将抗体置于正极，电泳后则在两孔 之间相遇，并在比例适当的部位形成肉眼可见的沉淀 线。
实验原理
➢ 本实验基于抗原抗体的等电点彼此不同，一般抗 体（IgG）的等电点为pH5~9，血清蛋白抗原的 等电点为pH4~5，在pH8.2~8.6的缓冲溶液中， 抗体所带负电荷较少，受到电场力较小，而且分 子在直流电场中易受溶液中正离子的吸引作用及 溶液的电渗作用而向负极迁移；在同样条件下， 抗原所带正电荷少，负电荷多，分子也较少，电 泳迁移快，虽也受电渗影响，但仍向正极泳动， 若抗原抗体相对应，则在两者相遇于最适比例处 形成沉淀，此即为对流免疫电泳的阳性结果。
比自由电泳小，对蛋白质的吸附极微。 ➢ 琼脂作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性
好等优点。 ➢ 电泳速度快。 ➢ 透明而不吸收紫外线，可用紫外检测仪作定量测定。 ➢ 区带易染色，样品易回收，有利于制止备。
然而琼脂中有较多硫酸根，电渗作用大。
➢ 琼脂（糖）电泳常用缓冲液的pH在6-9之间，离 子强度为0.02-0.05。离子强度过高时，会有大 量电流通过凝胶，因而产生热量，使凝胶的水 份量蒸发，析出盐的结晶，甚至可使凝胶断裂 ，电流中断。
免疫沉淀反应（Precipitation Reactions）
（1）定义：可溶性抗原和相应特异性抗体以合适 的比例特异性结合，经过一定时间，在反应体系 中形成不透明的抗原抗体复合物沉淀即免疫沉淀 反应。习惯上将参与沉淀反应的抗原称为沉淀原， 抗体称沉淀素。
（2）免疫沉淀反应类型：包括单向免疫扩散、双 向免疫扩散、对流免疫电泳、免疫电泳、免疫比 浊等
琼脂扩散试验
➢ 定义：可溶性抗原与抗体在含有电解质的半固体 凝胶(琼脂/琼脂糖)中进行的一种免疫沉淀试验。 琼脂起到网架作用，其含水量高达99%使可溶性 抗原与抗体在其间可以自由扩散，若抗原与抗体 比例合适，在相遇处可形成白色沉淀线，称阳性 反应。沉淀线在凝胶中可长期保持原位并可经染 色后干燥保存。
➢ 沉淀线(带)对抗原与抗体具有特异的不可透性， 而非特异者则否。所以一个沉淀线(带)即代表一 种抗原与抗体的沉淀物。
琼脂扩散试验
➢ 单向琼脂扩散技术 ➢ 双向琼脂扩散技术
单向琼脂扩散试验:
➢ 单向琼脂扩散试验是定量检测抗原的一种方法。将 适量抗体与琼脂混匀，浇注成板，凝固后，在板上 打孔，孔中加入抗原，抗原就会向孔的四周扩散， 边扩散边与琼脂中的抗体结合。一定时间后，在两 者比例适当处形成白色沉淀环。沉淀环的直径与抗 原的浓度成正比。如用不同浓度的标准抗原制成标 准曲线，则从曲线中可求出标本中抗原含量。
实验结果
断电后，将玻板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者 则在抗原抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。
思考：
1）对流免疫电泳的注意事项
2）如果结果没有出现白色沉淀线，该做何分析
请在下周上课前交齐本次实验报告。
对流免疫电泳 (Counter Immunoelectrophoresis，CIEP)
➢ 是双向琼脂扩散与电泳相结合的技术。CIEP是 一种加速的免疫双扩散技术。在琼脂糖凝胶平 板的两个孔中分别加入抗原和抗体，抗体侧连 接电源正极。通电后，带负电荷的抗原向抗体 孔方向移动，而抗体则由于电渗作用被带向抗 原孔侧。两者相遇时形成沉淀物。可用于检测 抗原， 但敏感性较低。
琼脂凝胶
pH 8.6
0.05M 巴比妥缓冲液:
巴比妥
1.84g
巴比妥钠 10.3g
加蒸馏水至1000ml
调pH至8.6
蛋白质在酸性溶液中易变性，在偏碱溶液中比较 稳定，所以蛋白质电泳大多用pH8.2～8.8的巴比 妥或硼酸缓冲液，在这种pH中，血清蛋白由于等 电点的原因一般都带负电荷。
在凝胶电泳中，首先应用的是琼脂电泳，具有下列优点： ➢ 琼脂含98-99%液体，近似自由电泳，但是样品的扩散度
是B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生 的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能 与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。
抗原抗体反应(antigen-antibody reaction)
(1)定义：
➢抗原抗原决定簇识别相应抗体分子可变区的而形
成的免疫沉淀反应。
(2)类型：
➢ 凝集反应: 颗粒性抗原与相应抗体结合 ➢ 免疫沉淀反应: 可溶性抗原与相应抗体结合 ➢ 细胞溶解反应:抗原抗体结合后激活补体所致的 ➢ 中和反应:细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致
实验步骤
➢ 制版与打孔 取洁净玻片，将1.2%融化的琼脂3~4ml均 匀浇注于玻片上，厚度约1.5~2.0mm。待琼脂凝固后， 放置于打孔样纸上，按样纸上图形打孔。
➢ 倍比稀释 待测抗原（1:2、1:4、1：8、1:16） ➢ 加样 在加样孔中加入5-8ul待测抗原样品和抗体。靠
近负极的孔中加入抗原，正极端的孔中加入抗体，标记 抗原抗体方向。 ➢ 电泳 将已加样的琼脂板平放于电泳槽内，以纱布为 桥，电压为100v，时间约30min。
➢ 主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种 补体成分的含量，敏感性很高。
双向琼脂扩散试验:
➢ 将抗原和抗体分别加入琼脂对应的孔中 ，二者会向四周扩散，在二者比例合适处 形成白色沉淀线。
免疫电泳技术 Immunoelectrophoresistechnique
➢ 对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis ，CIEP）：即双扩+电泳，具有快、高敏感等优点， 但分辨力低。
电渗
➢ 电场中，由于多孔支持物吸附水中的正/负离子， 使溶液相对带电，电场作用下，溶液就向一定方 向移动，称为电渗。如果电渗方向与样品移动方向 相同，样品的迁移率将加快，反之，减慢，甚至倒 退。一般与电泳力方向相反。
➢ 在pH8.6的情况下，由于琼脂中含有SO42-，带负电 荷，造成静电感应使附近的水带正电荷，而向负极 移动，所以电泳时有两种力，即电泳力和电渗力。
➢ 火箭免疫电泳（roket immunoelectrophoresis， RIE）：即单扩+电泳。比较快，但影响因素多。
➢ 免疫电泳（immunoelectrophoresis，IEP）：即电 泳后进行双相琼脂扩散实验
➢ 免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis） ：即区带电泳+沉淀反应
实验二
对流免疫电泳
实验目的
➢ 掌握对流免疫电泳技术的原理和方法 ➢ 巩固电泳槽、电泳仪的使用方法 ➢ 提高对抗原、抗体免疫反应的理解
实验原理
抗原（antigen，Ag）: 能诱导（活化或抑制）免疫系统产生免疫
应答，并与相应的抗体或致敏淋巴细胞进行特 异性结合（体内或体外）的物质。 抗体（antibody,Ab)：