对流免疫电泳-复旦精品课程

琼脂扩散试验
➢ 定义：可溶性抗原与抗体在含有电解质的半固体 凝胶(琼脂/琼脂糖)中进行的一种免疫沉淀试验。 琼脂起到网架作用，其含水量高达99%使可溶性 抗原与抗体在其间可以自由扩散，若抗原与抗体 比例合适，在相遇处可形成白色沉淀线，称阳性 反应。沉淀线在凝胶中可长期保持原位并可经染 色后干燥保存。
电渗
➢ 电场中，由于多孔支持物吸附水中的正/负离子， 使溶液相对带电，在电场作用下，溶液就向一定方 向移动，称为电渗。如果电渗方向与样品移动方向 相同，样品的迁移率将加快，反之，减慢，甚至倒 退。一般与电泳力方向相反。
➢ 在pH8.6的情况下，由于琼脂中含有SO42-，带负电 荷，造成静电感应使附近的水带正电荷，而向负极 移动，所以电泳时有两种力，即电泳力和电渗力。
电场力
负
极
抗原
正
抗体
极
电渗力
将抗原置于负极，将抗体置于正极，电泳后则在两孔 之间相遇，并在比例适当的部位形成肉眼可见的沉淀 线。
实验原理
➢ 本实验基于抗原抗体的等电点彼此不同，一般抗 体（IgG）的等电点为pH5~9，血清蛋白抗原的 等电点为pH4~5，在pH8.2~8.6的缓冲溶液中， 抗体所带负电荷较少，受到电场力较小，而且分 子在直流电场中易受溶液中正离子的吸引作用及 溶液的电渗作用而向负极迁移；在同样条件下， 抗原所带正电荷少，负电荷多，分子也较少，电 泳迁移快，虽也受电渗影响，但仍向正极泳动， 若抗原抗体相对应，则在两者相遇于最适比例处 形成沉淀，此即为对流免疫电泳的阳性结果。
免疫沉淀反应（Precipitation Reactions）
（1）定义：可溶性抗原和相应特异性抗体以合适 的比例特异性结合，经过一定时间，在反应体系 中形成不透明的抗原抗体复合物沉淀即免疫沉淀 反应。习惯上将参与沉淀反应的抗原称为沉淀原， 抗体称沉淀素。
（2）免疫沉淀反应类型：包括单向免疫扩散、双 向免疫扩散、对流免疫电泳、免疫电泳、免疫比 浊等
实验二
对流免疫电泳
实验目的
➢ 掌握对流免疫电泳技术的原理和方法 ➢ 巩固电泳槽、电泳仪的使用方法 ➢ 提高对抗原、抗体免疫反应的理解
实验原理
抗原（antigen，Ag）: 能诱导（活化或抑制）免疫系统产生免疫
应答，并与相应的抗体或致敏淋巴细胞进行特 异性结合（体内或体外）的物质。 抗体（antibody,Ab)：
比自由电泳小，对蛋白质的吸附极微。 ➢ 琼脂作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性
好等优点。 ➢ 电泳速度快。 ➢ 透明而不吸收紫外线，可用紫外检测仪作定量测定。 ➢ 区带易染色，样品易回收，有利于制止备。
然而琼脂中有较多硫酸根，电渗作用大。
➢ 琼脂（糖）电泳常用缓冲液的pH在6-9之间，离 子强度为0.02-0.05。离子强度过高时，会有大 量电流通过凝胶，因而产生热量，使凝胶的水 份量蒸发，析出盐的结晶，甚至可使凝胶断裂 ，电流中断。
是B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生 的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能 与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。
抗原抗体反应(antigen-antibody reaction)
(1)定义：
➢抗原抗原决定簇识别相应抗体分子可变区的而形
成的免疫沉淀反应。
(2)类型：
➢ 凝集反应: 颗粒性抗原与相应抗体结合 ➢ 免疫沉淀反应: 可溶性抗原与相应抗体结合 ➢ 细胞溶解反应:抗原抗体结合后激活补体所致的 ➢ 中和反应:细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致
实验结果
断电后，将玻板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者 则在抗原抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。
思考：
1）对流免疫电泳的注意事项
2）如果结果没有出现白色沉淀线，该做何分析
请在下周上课前交齐本次实验报告。
➢ 主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种 补体成分的含量，敏感性很高。
双向琼脂扩散试验:
➢ 将抗原和抗体分别加入琼脂对应的孔中 ，二者会向四周扩散，在二者比例合适处 形成白色沉淀线。
免疫电泳技术 Immunoelectrophoresistechnique
➢ 对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis ，CIEP）：即双扩+电泳，具有快、高敏感等优点， 但分辨力低。
琼脂凝胶
pH 8.6
0.05M 巴比妥缓冲液:
巴比妥
1.84g
巴比妥钠 10.3g
加蒸馏水至1000ml
调pH至8.6
蛋白质在酸性溶液中易变性，在偏碱溶液中比较 稳定，所以蛋白质电泳大多用pH8.2～8.8的巴比 妥或硼酸缓冲液，在这种pH中，血清蛋白由于等 电点的原因一般都带负电荷。
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在凝胶电泳中，首先应用的是琼脂电泳，具有下列优点： ➢ 琼脂含98-99%液体，近似自由电泳，但是样品的扩散度
实验步骤
➢ 制版与打孔 取洁净玻片，将1.2%融化的琼脂3~4ml均 匀浇注于玻片上，厚度约1.5~2.0mm。待琼脂凝固后， 放置于打孔样纸上，按样纸上图形打孔。
➢ 倍比稀释 待测抗原（1:2、1:4、1：8、1:16） ➢ 加样 在加样孔中加入5-8ul待测抗原样品和抗体。靠
近负极的孔中加入抗原，正极端的孔中加入抗体，标记 抗原抗体方向。 ➢ 电泳 将已加样的琼脂板平放于电泳槽内，以纱布为 桥，电压为100v，时间约30min。
➢ 火箭免疫电泳（roket immunoelectrophoresis， RIE）：即单扩+电泳。比较快，但影响因素多。
➢ 免疫电泳（immunoelectrophoresis，IEP）：即电 泳后进行双相琼脂扩散实验
➢ 免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis） ：即区带电泳+沉淀反应
➢ 蛋白电泳常用的缓冲液有硼酸盐缓冲液与巴比 妥缓冲液。为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH 和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极 槽内的缓冲液，混匀后再用。
实验材料
待测抗原、已知抗体 1.2℅琼脂(agar)电泳液、电泳槽、电泳仪 打孔器、玻片、打孔样纸、针头 5ml刻度吸管、洗耳球、微量加样器、枪头
➢ 沉淀线(带)对抗原与抗体具有特异的不可透性， 而非特异者则否。所以一个沉淀线(带)即代表一 种抗原与抗体的沉淀物。
琼脂扩散试验
➢ 单向琼脂扩散技术 ➢ 双向琼脂扩散技术
单向琼脂扩散试验:
➢ 单向琼脂扩散试验是定量检测抗原的一种方法。将 适量抗体与琼脂混匀，浇注成板，凝固后，在板上 打孔，孔中加入抗原，抗原就会向孔的四周扩散， 边扩散边与琼脂中的抗体结合。一定时间后，在两 者比例适当处形成白色沉淀环。沉淀环的直径与抗 原的浓度成正比。如用不同浓度的标准抗原制成标 准曲线，则从曲线中可求出标本中抗原含量。
对流免疫电泳 (Counter Immunoelectrophoresis，CIEP)
➢ 是双向琼脂扩散与电泳相结合的技术。CIEP是 一种加速的免疫双扩散技术。在琼脂糖凝胶平 板的两个孔中分别加入抗原和抗体，抗体侧连 接电源正极。通电后，带负电荷的抗原向抗体 孔方向移动，而抗体则由于电渗作用被带向抗 原孔侧。两者相遇时形成沉淀物。可用于检测 抗原， 但敏感性较低。
等电点
➢ 等电点（pI）：在某一PH的溶液中，氨基酸或 蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相 等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH 成为该氨基酸或蛋白质的等电点。
➢ 当外界溶液的pH大于两性离子的pI值，两性离 子释放质子带负电。当外界溶液的pH小于两性 离子的pI值，两性离子质子化带正电。