碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多
碱裂解法提取质粒原理和注意事项
碱裂解法提取质粒原理和注意事项碱裂解法是一种用于提取质粒的常用方法，通过在碱性条件下使细菌细胞裂解，进而释放出质粒。
碱裂解法的原理是利用质粒与细菌细胞核酸的不同碱溶解性，使质粒保留在溶液中，而细菌细胞核酸被沉淀下来。
本文将详细介绍碱裂解法的原理和注意事项。
碱裂解法的原理：1.细菌细胞的预处理：首先，将含有质粒的细菌菌落接种到LB(琼脂)培养基中，经过适当时长的培养，使细菌菌落扩大到较大体积。
2.收获细菌细胞：将培养基中的细菌细胞收获下来，一般通过离心方法将菌液沉淀。
3.细菌细胞裂解：将细菌细胞沉淀后，将其重悬到高浓度的碱溶液中，使细菌细胞在碱性条件下裂解。
4.分离核酸：碱条件下，质粒DNA和线粒体DNA往往会溶于溶液中，而细菌细胞的染色体DNA不溶于溶液中，并随着碱度增加逐渐沉淀。
通过快速离心，将细菌细胞染色体DNA沉淀，而质粒DNA留在上清液中。
5.提取质粒：将上清液取出，通过乙醇沉淀方法使质粒DNA沉淀下来，通过离心收获质粒，即可得到纯化后的质粒DNA。
注意事项：1.使用无菌操作：为保证实验的准确性和重复性，实验过程中必须严格遵守无菌操作的要求。
例如，使用无菌器皿和无菌操作工具，避免细菌污染。
2.注意细菌菌落的培养条件和时长：细菌菌落的培养条件和时长会对实验结果产生影响。
培养条件应符合细菌所需的培养基成分和培养温度，时长应确保细菌菌落予以充足的生长和扩大。
3.使用高浓度的碱溶液：为充分裂解细菌细胞，需要使用高浓度的碱溶液，通常为pH12的溶液。
4.快速离心：由于细菌细胞裂解后的溶液中可能含有许多细菌细胞碎片和核酸碎片，为避免这些碎片沉淀到上清液中，需要进行快速离心，在最短时间内将质粒DNA沉淀下来。
5.质粒的纯化：通过乙醇沉淀方法提取质粒时，需要仔细控制乙醇的用量和沉淀时间，以避免损失待提取的质粒DNA。
总结：碱裂解法是提取质粒DNA的常用方法之一，其原理是利用质粒DNA与细菌细胞染色体DNA在碱性条件下的不同溶解性，通过沉淀法分离出质粒DNA。
DNA和RNA提取原理及常见问题分析
硅质材料的吸附 或用异丙醇沉淀浓缩RNA。 经DEPC 处理的水溶解RNA
材料准备及裂解
RNA的提取
尽量使用新鲜材料，条件允许的情况下现取现提 组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清，消化系统的组 织选取杂质少的部位, 细菌和酵母需要匀浆处理。 对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻，或投入 专门的RNA样品储存液中保存（动物的脾脏及消化系统中RNA 非常容易降解，同时DNA的含量丰富，操作应格外的快速小 心）。 液氮研磨时不要使液氮挥发净，随时补充；加入裂解液并且彻 底而迅速地匀浆。
杂质的抽提
RNA的提取
采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖 和DNA分布到中间层和有机相中，RNA留在水相中 对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层，可以再次用有机 溶剂抽提
RNA的沉淀和溶解
RNA的提取
含RNA的水相过吸附柱，通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖 等杂质 或使用异丙醇沉淀RNA应充分的混匀并放置10min左右离心收集 沉淀，70％乙醇洗涤，晾干 用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA 样品收集后或需长期保存时应置于－70℃ 或加入RNase抑制 剂，分装使用
提取RNA的注意事项
经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能有 RNase，会导致RNase污染。 使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。 应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。 使用有效的RAase抑制剂
DNA提取常见问题
问题二：DNA降解。 原因
1.
1.
碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化
实验一、碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化一、实验目的学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法和进一步的纯化技术。
二、实验原理在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。
混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。
三、实验材料大肠杆菌DH5α（含重组了约800bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）四、实验仪器、用具高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪五、实验试剂LB培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖抽提质粒DNA所需的溶液：溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0)；溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH，1%SDS(w/v)，现配现用；溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至5.2；电泳缓冲液（0.5×TBE）：45 mmol/L Tris-硼酸，1 mmol/L EDTA，pH8.0；六、实验步骤：1、质粒DNA的提取（1）在LB固体平板上挑单菌落接入2ml 含Amp的LB液体培养基中（已灭菌），37℃振摇培养过夜；（已经完成）（2）取1mL菌液放入Ep管中，12000 r/min（简写rpm）离心1min；弃尽上清；（3）加入200μL预冷的含RNaseA的溶液I，旋涡混匀；（4）加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min以充分裂解细菌；（5）加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，－20℃放置8min；（6）12000rpm离心5min；（7）吸上清至另一新的1.5mL EP管，加500μL氯仿/异戊醇（V：V=24：1）充分混匀，12000rpm离心5min；（8）小心移取上清液500μL至另一新的1.5mL EP管，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，-20℃静置10min，12000 rpm离心10min，弃上清；（静置期间安排制琼脂糖凝胶，每组制胶一块，具体见附件）（9）加入200μL70%乙醇洗DNA沉淀，12000rpm离心5min，倒掉乙醇，再12000rpm离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇，烘箱适度风干；（10）加入20μL RTE （含10μg/mL RNaseA 的TE，pH8.0）溶解质粒DNA，37℃放置10min。
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。
3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
碱裂解法抽提大肠杆菌质粒
移液器及吸头 漩涡混合器
03
实验步骤
菌体培养
菌体培养是碱裂解法抽提大肠杆菌质 粒的第一步，需要将大肠杆菌接种在 适量的培养基中，在适宜的温度下进 行培养，使菌体生长至对数生长期。
培养过程中，需要控制温度、pH和培 养时间，以确保菌体生长良好且无杂 菌污染。
菌体收集
当菌体生长至对数生长期后，需要将 菌体收集起来，以便进行后续的实验 步骤。
碱裂解法抽提大肠杆 菌质粒
目 录
• 实验原理 • 实验材料 • 实验步骤 • 结果与分析 • 结论与讨论
01
实验原理
碱裂解法介绍
碱裂解法是一种常用的质粒抽提 方法，通过改变细胞壁和细胞膜 的性质，使质粒DNA从染色体
DNA中分离出来。
在高pH值条件下，细胞膜和染 色体DNA的双螺旋结构被破坏，
聚丙烯酰胺凝胶电泳
对于较小片段的质粒，可采用聚丙烯 酰胺凝胶电泳进行检测，该方法分辨 率更高。
质粒结构与功能分析
01
质粒电泳图谱分析
通过比较标准质粒和提取质粒的 电泳图谱，分析提取质粒的分子 量大小及可能缺失的片段。
02
限制性内切酶分析
03
基因测序验证
利用限制性内切酶对质粒进行酶 切，通过电泳检测酶切产物，判 断质粒的结构。
形成不可逆的变性，而质粒 DNA则保持稳定。
通过离心分离，染色体DNA和 细胞膜等大分子物质被沉淀，而
质粒DNA则留在上清液中。
大肠杆菌质粒介绍
01
大肠杆菌质粒是一种小型环状DNA分子，可以自主 复制和遗传。
02
质粒携带特定的基因，赋予宿主细胞某些表型特征， 如抗生素抗性或代谢特性。
03
大肠杆菌质粒是基因工程中常用的载体，用于克隆 和表达目的基因。
基因工程实验
24
五、实验注意事项
1 用微波煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的 1/3，否则易溢出
2 煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变 形，并减少漏胶的机会
加入等体积的氯仿， 12000rpm，离心5分钟，取上清
加入1/10体积的3MNaAc，加2倍体积的预冷的无水乙 醇，混匀。
置于-70℃冰箱约10min以上或者-20℃冰箱30min至 数个小时
11
12000rpm离心15分钟（4℃），倒掉酒精，离心几秒，
用移液枪尽可能除去酒精
用0.5ml70 %酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉 酒精
3
当加入中性缓冲液调和时，变性的质粒 DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA 不能复性，它们之间交联形成不溶性网状 结构，并与细胞碎片、蛋白质、SDS等结 合沉淀下来。
通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA 及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA 及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂 的RNA可用RNaseA消除。再用酚／氯仿 处理，可除残留蛋白质
真核生物的基因组DNA为双螺旋结构，在在碱性溶 液中，双链DNA氢键断裂，双螺旋结构遭破坏而发生 变形，而基因组DNA分子量相对较大，在碱性PH条 件下其线性的大分子量基因组DNA不能复性，而形成 缠连的网状结构与蛋白质等共沉淀。
15
2 异丙醇和无水乙醇对核酸沉淀的优缺点 答：异丙醇和乙醇都能与与任意比例的水相混合。异 丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，乙醇可以去 盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。 异丙醇沉淀量多，但杂质也多，增加了后续实 验风险。其优点为：所需容积小且速度快，适用于 浓度低，而体积大的DNA样品的沉淀。一般不需要 在低温条件下长时间放置。缺点为：易使盐类（如 NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙 醇难以挥发除去 乙醇是沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐 类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处， 不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品 容积的95％乙醇可有效沉淀DNA。其缺点是总体积 较大。需在-20放置很长时间，30分钟-1小时，同 时DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分DNA溶 解损失
碱裂解法抽提质粒DNA的原理很详细
碱裂解法质粒提取的原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA 是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
（简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。
碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
）细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。
下面是该法的提取原理:碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。
溶液I的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH 值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
质粒DNA抽提实验报告word精品
质粒DNA抽提实验报告一.实验目的：1. 掌握碱裂解法小量快速提取质粒DNA勺方法，提取的质粒DNA可直接用于酶切，PCRT增等。
2. 学习利用水平式琼脂糖凝脉电泳初步检测DNA勺纯度，构型，含量和分子量大小。
二.实验原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DN结果A的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三.实验仪器及试剂：1.5mlEP管、高速离心机、移液枪溶液I : 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)2毫克/毫升溶菌酶溶液II : 200 mmol/L NaOH、1% SDS溶液III : 3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液、TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl 、pH 7.51 mmol/L EDTA四.实验步骤：1、取1.5ml细胞培养物于1.5mlEP管中，12000rpm/min离心1min,去上清液(重复一次)2、加200卩l溶液I重悬浮细胞3、加200卩l溶液U,轻轻摇匀，放置5min4、加150卩l溶液，轻轻摇匀，冰浴5min，12000rpm/min离心5min5、取上清，加入等体积氯仿，摇匀，12000rpm/min离心10min& 去上清，加入等体积异丙醇，室温放置5min, 12000rpm/min离心10min7、70汇醇洗涤沉淀2次，风干8、加20ddHO溶解沉淀，-20 C下保存备用.实验结果：得到大肠杆菌质粒DNAPCR以及电泳实验报告一•实验原理：PCR该技术是在模板DNA引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。
质粒DNA的分离`纯化
对 策
混有蛋白 混有RNA 混有基因组DNA
不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 加入RNaseA室温放置一段时间 加入溶液II 和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。
碱裂解法流程图
对数期菌体
溶液III中和
溶液I充分重悬
溶液II裂解
上清液
抽提
离心洗涤
酒精沉淀
干燥溶解
沉淀
质粒DNA溶液
菌种 ：E. coli MV1184（含pUC118）、 E. coli K12（含pEGFP） 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机， 涡旋振荡器 试剂：LB液体培养基 、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ 、RNA酶A 、饱和酚:氯仿＝ 1:1
质粒DNA－煮沸法
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。
培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。
G＋菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁。
DNA,RNA提取原理方法和琼脂糖凝胶电泳,PCR技术,限制性内切酶简介
二、概念
核酸酶：催化核酸酯键的水解 核酸外切酶：作用于核酸链的末端（3’端或5’ 端）逐个水解下核苷酸 核酸内切酶：从核酸分子内部切断3’,5’-磷酸 二酯键 限制性核酸内切酶：在细菌细胞内存在的一类能 识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶
三、限制性核酸内切酶的分类
1、第一型（Type I）： 既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基 化的DNA的水解； 2、第二型（Type II）： 只催化非甲基化的DNA的水解，其切割位 点可知、固定是，是最常用的限制性核酸内切酶； 3、第三型（Type III）： 同时具有修饰及认知切割的作用
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide， 十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂， 可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖 的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留 在溶液里 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶 的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等 杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
CTAB提取缓冲液的经典配方
Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白 ）。CTAB溶解细胞 膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易 去除
SDS法流程图 （以动物组织为例）
其它方法
浓盐法：利用RNA和DNA在盐溶液中溶解度不同， 将二者分离
有机溶剂抽提法：有机溶剂作为蛋白变性剂，同时 抑制核酸酶的降解作用
细菌质粒提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握碱裂解法提取细菌质粒的原理和操作步骤。
2. 了解质粒DNA在分子生物学研究中的应用。
3. 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。
二、实验原理质粒是细菌细胞内的一种小型、环状、双链DNA分子，独立于细菌染色体之外。
质粒携带的基因可以赋予细菌额外的生理代谢能力，如抗生素耐药性等。
碱裂解法是提取质粒DNA的常用方法，其原理如下：1. 在碱性条件下，蛋白质与DNA发生变性，质粒DNA与染色体DNA分开。
2. 加入盐溶液使pH值恢复至中性，质粒DNA迅速复性，而染色体DNA不易复性，形成网状结构。
3. 通过离心，将质粒DNA与蛋白质、染色体DNA等杂质分离。
三、实验材料与仪器1. 仪器：恒温摇床、台式离心机、微量移液器、紫外灯、凝胶成像系统、电泳仪、凝胶制备装置等。
2. 试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、NaOH溶液、SDS溶液、KAc溶液、酚/氯仿/异戊醇溶液、无水乙醇、TE缓冲液、琼脂糖、DNA Marker、染色剂等。
3. 菌种：含质粒的大肠杆菌菌株。
四、实验步骤1. 菌液的制备：将含质粒的大肠杆菌菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
2. 收集菌体：取适量培养液，4000r/min离心2min，收集菌体。
3. 菌体裂解：向菌体中加入NaOH和SDS溶液，65℃水浴10min，使蛋白质与DNA变性。
4. 质粒DNA的纯化：向裂解液中加入KAc溶液，混匀后4℃静置10min，使质粒DNA沉淀。
5. 离心：4000r/min离心10min，收集沉淀。
6. 洗涤：向沉淀中加入70%乙醇，混匀后4℃静置10min，再次离心，收集沉淀。
7. 干燥：将沉淀干燥至完全无水。
8. 溶解：向沉淀中加入适量TE缓冲液，溶解质粒DNA。
9. 琼脂糖凝胶电泳检测：取适量质粒DNA溶液，加入上样缓冲液，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
五、实验结果与分析1. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，质粒DNA在凝胶上呈现清晰的单一条带，表明质粒DNA已成功提取。
DNA和RNA提取常见问题分析及对策
基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方 提取缓冲液的经典配方
Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合 2+或Mn2+离子，抑制 螯合Mg 离子，抑制DNase活性； 活性； 螯合 活性 NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； 提供一个高盐环境， DNP充分溶解 存在于液相中； 充分溶解， CTAB溶解核酸，使核酸便于分离； 溶解细胞膜 β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变， 巯基乙醇是抗氧化剂
质粒DNA－ 质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法流程图
对数期菌体 上清液 沉淀
溶液I充分重悬 溶液 充分重悬
抽提
干燥溶解
溶液II裂解 溶液 裂解
酒精沉淀
质粒DNA溶液 溶液 质粒
溶液III中和 溶液 中和
离心洗涤
质粒DNA－ 质粒DNA－煮沸法
煮沸法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 DNA比质粒DNA分子大得多 DNA 而质粒DNA为共价闭合环状分子； DNA为共价闭合环状分子 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性， 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 DNA溶液时 DNA容易发生变性 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； DNA在冷却时即恢复其天然构象 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 DNA 而复性的超螺旋质粒DNA DNA分子则以溶解状态存在液相 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 从而可通过离心将两者分开。 中，从而可通过离心将两者分开。
碱裂解法抽提质粒的原理
碱裂解法抽提质粒的原理SDS碱裂解法制备质粒DNA的原理：细菌悬浮液暴露于高pH的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被十二烷基硫酸盐包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效沉淀下来，离心去除后，就可从上清液中回收质粒DNA。
1．试剂（1）溶液Ⅰ：Tris-HCL（pH8.0）25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L,溶菌酶（临用时加）5mg/ml（2）溶液Ⅱ（新鲜配制）：NaOH 0.2mol/L,SDS 1﹪(W/V)（3）溶液Ⅲ（100ml）：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml（4）酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）（5）无水乙醇和70﹪乙醇（6）无DNA酶的胰RNA酶（7）TE2．实验流程（1）挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于20ml 含有相应抗生素的LB液体培养基中，于37℃剧烈震摇下培养过夜。
（2）将1.2ml培养物倒入微量离心管中，于4℃以5000g离心5分钟（两次），将剩余的培养物贮存于4℃。
（3）吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
（4）将细菌沉淀重悬于100μl溶液Ⅰ中，剧烈振荡。
注：溶菌酶促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。
溶菌酶对反应液的pH有很大的依赖关系，当其低于8.0时，细胞裂解的效果就大为逊色。
因此，溶液Ⅰ不仅使用了Tris-HCL缓冲体系，同时好加入了适量的葡萄糖而有利于pH的调节。
乙二胺四乙酸（EDTA）因其是二价金属离子（如Mg2＋等）的螯合剂，故少量地存在便可抑制核酸酶的活性，从而保护质粒DNA免被降解。
（5）加200μl溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。
确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触。
注意不要振荡。
将离心管放置于冰上5分钟。
注：SDS的作用在于使细胞裂解，以释放出质粒及染色体的DNA。
碱裂解法提取基因组dna的原理
碱裂解法提取基因组dna的原理
碱裂解法是一种用于提取基因组DNA的方法。
其原理是通过碱性条件下，破坏微生物细胞壁和膜，使得DNA从胞内中释放出来，加入酸性物质后使得DNA质粒被还原为单股线形式，最终形成可溶于水的DNA溶液。
具体步骤如下：
细菌分离：利用细菌分离技术，将菌落分离出来，得到单一种类的细菌样品。
细胞收集：将细菌样品转移到离心管中，并进行离心来收集细胞。
碱裂解：使用含有NaOH和SDS（十二烷基硫酸钠）的缓冲液，对细胞进行碱裂解，破坏细胞壁和膜，并释放DNA进入溶液中。
中和：加入氢氯酸（HCl）中和反应液，使溶液变为酸性。
沉淀：将反应液中的DNA沉淀出来，用乙醇洗涤、干燥等步骤进行纯化。
重溶：添加缓冲液或去离子水等溶剂，将DNA溶解于液体中，得到基因组DNA。
碱裂解法提取基因组DNA具有操作简单、适用范围广、获得的DNA量大等优点。
由于该方法不需要特殊的设备和试剂，被广泛应用于微生物基因组研究领域中。
碱裂解法原理及步骤总结
实验原理
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法。
该方法提取质粒DNA是基于
线性染色体DNA与共价闭环质粒DNA在拓扑学上的差异而达到分离目的的。
在pH12.0~ 12.5的碱性条件下,染色体线性DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开;共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。
当pH调至中性并在高盐及低温条件下,大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍为可溶状态。
通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA留在上清中,然后用有机溶剂酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA
●是基于线性染色体DNA与共价闭环质粒DNA在拓扑学上的差异而达到分离目的
●在pH12.0~12.5的碱性条件下
●细菌的细胞壁和细胞膜被破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放出来，线性DNA双螺旋
结构被破坏而发生变性。
●共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态
●pH调至中性并在高盐条件下,大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS
的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍为可溶状态
三种溶液
平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大
量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了
醋酸：
是为了中和NaOH
75%酒精：
主要是清洗盐份和抑制Dnase；同时溶液III的强
酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上
步骤
具体步骤参见对应试剂盒
DNA提取基本步骤：
●材料准备
●破碎细胞或包膜——内容物释放
●核酸分离纯化
●沉淀或吸附核酸,并去除杂质
●溶解核酸于缓冲液或水中。
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法提取质粒原理
PCR (聚合酶链反应，polymerase chain reaction) 是一种可以在体外放大特定DNA
片段的技术，也称为扩增（amplification）技术。
PCR法可以有效地检测和扩增DNA片段。
该方法被用来在受检实体中提取、检测、识别和检测DNA多样性。
质粒可以通过PCR线性化来提取，也就是说，可以使用多个特异性引物（特异性对特
定片段的DNA的结合）及特定的片段的DNA作为模板，以获得一条目标片段（目标片段）。
碱裂解特定质粒原理是利用酵素将核酸中几个碱基分解，从而模拟碱基降解，如激酶
能够代表核酸序列几个碱基中的某一碱基。
碱裂解法检测质粒的方法通常用PCR技术来实现，这是因为扩增的方式允许在给定片段的碱基顺序上获得更高的灵敏度和特异性。
碱裂解能够确定质粒的结构，利用一种叫做“碱裂解”的方式，这种方式可以将一段DNA拆分成其他的片段，从而了解其结构，增强检测能力。
碱裂解技术包括酶具（如酶切酶），这些对特定碱基序列特异性，可以用来解析特定质粒，检测出质粒中特定载荷裂解
了的区域片段，以及分析质粒的尺寸。
通过PCR与碱裂解技术，可以高效提取质粒，检测其结构，从而改善生物体的检测以
及疾病的治疗。
此外，碱裂解技术还可以进一步改善基因密码的加密状态，以及鉴定新的
质粒结构。
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法是一种常用的提取质粒的方法，其原理主要基于碱性条件下DNA的
特性。
在这种方法中，碱性条件能够使得DNA变性，即双链DNA分子被分解成
两条单链DNA。
这种变性的DNA在碱性条件下会呈现出单链的形态，使得质粒
得以被提取出来。
在进行碱裂解法提取质粒时，首先需要将含有目标质粒的细菌进行培养，使得
细菌大量繁殖并产生大量的质粒。
随后，通过离心等方法将细菌进行分离，得到含有目标质粒的细菌菌体。
接下来，将细菌菌体进行溶解，使得细菌菌体内的细胞壁和膜被破坏，释放出含有质粒的细胞内液。
此时，碱性条件的作用就体现出来了。
通过加入碱性溶液，使得DNA发生变性，双链DNA分子被分解成两条单链DNA。
在这种碱性条件下，质粒的DNA与
细菌染色体的DNA会有不同的解旋速度，从而使得质粒的DNA得以被分离出来。
质粒的DNA呈现出线性形态，方便后续的提取和纯化。
在质粒的DNA被分离出来后，可以通过中性化等方法使得DNA重新回到双
链的形态，从而得以进行后续的分析和应用。
碱裂解法提取质粒的原理简单而有效，被广泛应用于分子生物学领域中。
总的来说，碱裂解法提取质粒的原理是基于碱性条件下DNA的变性特性。
通
过使DNA变性，质粒的DNA得以被分离出来，从而实现了质粒的提取。
这种方
法简单易行，成本低廉，适用于大规模的质粒提取工作。
因此，碱裂解法在分子生物学研究中具有重要的应用价值。
碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多课件
DNA分子中含有大量的重复序 列，这些重复序列在染色体 DNA和质粒DNA中有所不同 。
染色体DNA与质粒DNA的差异
01
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，染色体DNA的长度通常在数 百万到数十亿个碱基对之间，而质粒DNA的长度通常只有几千到
几十万个碱基对。
02
染色体DNA是细胞核的一部分，是细胞遗传信息的载体， 而质粒DNA存在于细胞质中，可以自主复制和传播。
Part
03
染色体DNA与质粒DNA的大 小比较
染色体DNA的大小
01
染色体DNA的大小通常在数百 万至数十亿碱基对之间，是细 胞核内主要的遗传物质。
02
不同生物的染色体DNA大小差 异很大，与物种的基因组复杂 度有关。
03
人类染色体DNA大约由2.8亿 个碱基对组成，是相对较大的 DNA分子。
质粒DNA的大小
质粒DNA是染色体外的 遗传物质，通常较小，只 有几千至几万个碱基对。
质粒DNA在细菌中常见 ，用于基因克隆和表达等 分子生物学实验。
质粒DNA的大小远小于 染色体DNA，是相对较 小的DNA分子。
染色体DNA与质粒DNA大小的比较
染色体DNA的大小远大于质粒DNA，是细胞内 最大的DNA分子。
质粒DNA通常用于基因克隆和表达等实验，而 染色体DNA则承载着生物体的遗传信息。
碱裂解法原理适用于提取质粒DNA，而不适用 于提取染色体DNA，因为染色体DNA分子较大 ，不易进入裂解液中。
Part
碱裂解法在染色体DNA分离中的应用
染色体DNA较大，不易进入细胞质中，在碱处理时更稳定， 不易被破坏。
碱裂解法是一种相对简单、快速且有效的分离质粒DNA的方法，广泛应用于基因克隆和 分子生物学研究中。
天然DNA的提取原理及提取技术讲解
溶液I
(50mmol/L葡萄糖,10mmol/L EDTA, 25mMTris-HCl pH8、0)
作用:分散细胞
溶液II
(0、2mol/L NaOH, 1%SDS) (SDS,十二烷基硫酸钠)
作用:细胞壁肽聚糖碱性下水解,核酸与蛋白质变性。
溶液III (3mol/L KAc,PH4、6)
作用:酸性下质粒DNA复性,变性蛋白、线性DNA 沉淀。
质粒DNA得提取－碱裂解法
染色体DNA比质粒DNA分子大得多,且染色 体DNA为线状分子,而质粒DNA为共价闭合环状 分子;
当用碱处理DNA溶液时,线状染色体DNA容 易发生变性,共价闭环得质粒DNA在回到中性pH 时即恢复其天然构象;
变性染色体DNA片段与变性蛋白质与细胞碎 片结合形成沉淀,而复性得超螺旋质粒DNA分子 则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两 者分开。
8 4 ℃,12000rpm离心5min,弃上清液 9 在超净工作台吹干 10 加入50ulTE, -20℃保存备用。
液氮罐
制冰机
上得差别,通过加入离子变性剂,去污剂使蛋白质或 多糖变性,核蛋白解聚。
CTAB SDS
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安静
除蛋白质
氯仿/异戊醇抽提(氯仿可使蛋白质变性并有助于液
相与有机相得分离;异戊醇则有助于消除抽提过程中 出现得气泡)。
使用变性剂变性 (SDS、异硫氰酸胍等) 高盐洗涤(当溶液中得中性盐得浓度大于1mol/L 时,
CTAB法 (hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)
SDS法
(十二烷基磺酸钠,Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS)
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存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬 菌 体，其或只含DNA，或只含有RNA。
2
二、DNA提取的几种方法
(一） 非基因组DNA的提取 ➢ 质粒DNA的提取
• 碱裂解法 • 煮沸法 ➢ 线粒体、叶绿体DNA的提取 • 差速离心结合SDS裂解法
3
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
12
（二）基因组DNA的提取－ SDS法 SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
13
（三）基因组DNA－其它方法 根据细胞裂解方式的不同有：
➢ 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法
➢ 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ➢ 生物方式：酶法
4
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法流程图
对数期菌体
上清液
沉淀
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
溶液II裂解 溶液III中和
酒精沉淀 离心洗涤
质粒DNA溶液
5
质粒DNA－煮沸法
煮沸法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
➢ 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
6
细胞器DNA－差速离心法
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
8
（二）基因组DNA的提取－ CTAB法 CTAB提取缓冲液的经典配方
核酸的提取及鉴定
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象， 因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最 重要、最基本的操作 。
1
一、核酸的分类
DNA (脱氧核糖核酸)
主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA
（cpDNA），质粒DNA。
组份 终浓度
Tris-HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）
NaCl
CTAB
β-巯基乙醇
100 mM
20 mM
1.4M
2%(W/ V)
0.1% （V/V）使 用前加入
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； ➢ CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； ➢ β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
15
（三）基因组DNA－其它方法
➢ 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
16
（四）动物基因组DNA的提取
主要方法： (1)浓盐法 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。 1）用1M 氯化钠提取,得到的DNP粘液 2) 与含有少量异戊醇的氯仿一起摇荡,使乳化 3) 离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相 中间，而DNA位于上层水相中 4) 用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。
10
（二）基因组DNA提取－ CTAB法
CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
11
（二）基因组DNA的提取－ SDS法
SDS法原理
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
差速离心法原理
➢ 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速 进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
7
（二）基因组DNA的提取－ CTAB法 CTAB法原理
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
组份
Tris-
HCl （pH8. 0）
EDTA （pH 8.0 ）
NaCl
SDS
终浓 10
度
mM
20 mM 0.4M 2%
14
（三）基因组DNA－其它方法
根据核酸分离纯化方式的不同有：
➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
9
（二）基因组DNA的提取－ CTAB法 CTAB提取缓冲液的改进配方
组份
终浓 度
Tris-
EDTA
HCl
（pH8.
（pH8.0）0）
100
20
mM
mM
NaC l
1.4 M
CTAB
3%(W /V)
PVP40
5%(W /V)
β-巯基乙 醇
2%（V/V） 使用前加 入
❖ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶