酶工程作业题及答案

⏹为什么滞后合成型的酶要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成？滞后合成型的酶之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成，主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。

只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。

若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。

该类型酶所对应的mRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。

⏹酶的发酵生产过程中，要使酶的产率提高，可以采取哪些措施？使用优良的产酶细胞；使用优良的发酵生产设备；采用先进的分离纯化技术和设备；控制好工艺条件；采取某些行之有效的措施。

添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。

例如，乳糖诱导β-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。

诱导物一般可以分为3类:酶的作用底物,作用底物的类似物 ,酶的催化反应产物.控制阻遏物的浓度阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。

1.产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。

为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。

2.分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。

较采用其他难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源添加一定量的环腺苷酸（cAMP）对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。

添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。

将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。

由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如‘新洁而灭’等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。

添加产酶促进剂产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。

例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高1～20倍；添加聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol）可以提高糖化酶的产量。

产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度酶发酵动力学研究的内容包括哪些？1.细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规律。

2.产酶动力学主要研究细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律。

3.基质消耗动力学主要研究发酵过程中基质消耗速率以及各种环境因素对基质消耗速率的影响规律。

⏹简述酶沉淀的主要方法及其原理。

沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶或杂质的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。

简述凝胶层析的原理以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。

凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。

较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。

简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH值和凝胶孔径，而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。

由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应.1．浓缩效应样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。

当通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大的Cl—有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸离子(PI=6．0)泳动速度最慢，被称为慢离子。

由于快离子的迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，即低电导区。

电导与电势梯度成反比，因而可产生较高的电势梯度。

这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。

因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面，由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，所以，也就聚集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的分离胶时，已形成一薄层。

2．电荷效应当各种离子进入pH8．9的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。

3．分子筛效应由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而；迁移率不同而被分离。

此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。

5、简述定点突变技术的主要技术过程及其在酶分子修饰中的应用。

定点突变是在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。

定位突变技术用于酶分子修饰的主要过程如下：（1）、新的酶分子结构的设计根据已知的酶RNA或酶蛋白的化学结构和空间结构及其特性，特别是根据酶在催化活性、稳定性、抗原性和底物专一性等方面存在的问题，合理设计新的酶RNA的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，确定欲置换的核苷酸或氨基酸及其位置。

（2）、突变基因碱基序列的确定对于核酸类酶，根据欲获得的酶RNA的核苷酸排列次序，依照互补原则，确定其对应的突变基因上的碱基序列，确定需要置换的碱基及其位置。

对于蛋白类酶，首先根据欲获得的酶蛋白的氨基酸排列次序，对照遗传密码，确定其对应的mRAN上的核苷酸序列，再依据碱基互补原则，确定突变基因上的碱基序列，并确定需要置换的碱基及其位置。

（3）、突变基因的获得根据欲获得的突变基因的碱基序列及其需要置换的碱基位置，首先用DNA合成仪合成含有被置换了碱基的寡核苷酶，再用此寡核苷酶为引物通过聚合酶链反应（PCR）等技术获得所需的大量突变基因。

（4）、新酶的获得将上述定位突变获得的突变基因进行体外重组，插入到适宜的基因载体中，然后通过转化、转导、介导、基因枪、显微注射等技术，转入到适宜的宿主细胞，再在适宜的条件下进行表达，就可获得经过修饰的新酶。

定点突变技术在酶分子修饰中试一种行之有效的常用方法，定点突变技术为氨基酸置换修饰和核苷酸置换修饰提供了先进、可靠的手段。

酶的定点突变与酶的定向进化的比较。

酶的定向进化 1酶分子的合理设计蛋白质空间结构测定；蛋白质分子设计；基因工程2 酶分子的定向进化酶的体外定向进化属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。

定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。

定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段1.什么是固定化酶，固定化酶的特性与游离酶相比有哪些改变？固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶.将酶或含酶菌体固定化制成固定化酶或固定化菌体以后，由于受到载体等的影响，酶的特性可能会有些变化：1.固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。

2.固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。

3.酶经过固定化后，其作用的最适pH值往往会发生一些变化。

这一点在使用固定化酶时，必须引起注意（一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质）。

4.固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。

固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。

2.酶在非水介质中的催化反应具有哪些新特征和优势？①可进行水不溶或水溶性差化合物的催化转化，大大拓展了酶催化作用的底物和生成产物的范围；②改变了催化反应的平衡点，使在水溶液中不能或很难发生的反应向期望的方向得以顺利进行，如在水溶液中催化水解反应的酶在非水介质中可有效催化合成反应的进行；③使酶对包括区域专一性和对映体专一性在内的底物专一性大为提高，使对酶催化作用的选择性的有目的的调控的实现成为可能。

④大大提高了一些酶的热稳定性；⑤由于酶不溶于大多数的有机溶剂，使催化后酶易于回收和重复利用；⑥可有效减少或防止由水引起的副反应的产生；⑦可避免在水溶液中进行长期反应时微生物引起的污染；⑧可方便地利用对水分敏感的底物进行相关的反应；⑨当使用挥发性溶剂作为介质时，可使反应后的分离过程能耗降低。

3.酶在有机溶剂介质中与在水溶液中的催化特性有何改变？酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别；对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从而影响酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、间选择性和热稳定性等，而显示出与水相介质中不同的催化特性。

（1）底物专一性：在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底物特异性会发生改变。

（2）对映体选择性：酶在有机介质中催化，与在溶液中催化比较，由于介质的特性发生改变，而引起酶的对映体选择性也发生改变。

一般来说，酶在水溶液中催化的立体选择性较强，而在疏水性强的有机介质中，酶的立体选择性较差。

（3）区域选择性：酶在进行催化反应时具有区域选择性，即酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。

一般说来，酶在水溶液中的区域选择性比在有机介质中的区域选择性较强，在不同的有机介质中酶的区域选择性也有所不同。

（4）键选择性：酶在有机介质中进行催化时具有键选择性。

即在同一个底物分子中有2种以上的化学键都可以与酶反应时，酶对其中一种化学键优先进行反应。

键选择性与酶的来源和有机介质的种类有关。

在不同的有机介质中，酶的也有所不同。

（5）热稳定性：许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的热稳定性更好。

4.简述有机介质中酶催化反应的影响因素及控制。

影响因素主要有:酶、底物、有机溶剂种类、水含量、温度、pH值和离子强度等。

二、酶的选择: 1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、处理法不同特性亦有差别；2、酶反应速度与酶浓度成正比；3、另注意酶的稳定性、底物专一性,对映体选择性、区域选择性、键选择性等。