PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题、原因分析及其对策
镁离子浓度不当
总结词
镁离子是PCR反应的重要成分，对PCR的效率和产物质量有 重要影响。
详细描述
镁离子浓度过高可能导致非特异性扩增和产物稳定性下降； 镁离子浓度过低则可能影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失 败或扩增效率低下。因此，需要根据实验条件和试剂盒推荐 ，选择合适的镁离子浓度。
03
pcr问题对策
详细描述
模板质量的好坏直接影响到pcr的扩增 效果，因此需要确保模板的纯度和浓 度，避免使用降解严重的模板，以提 高pcr的产量和特异性。
优化pcr循环参数
总结词
pcr循环参数的优化可以显著提高pcr的效率和特异性。
详细描述
通过调整变性、退火、延伸等温度和时间，可以优化pcr循环参数，提高pcr的效率和特异性。同时， 合理设置预变性时间和循环数，可以有效避免非特异性扩增和产物积累。
优化引物设计
总结词
引物设计是pcr反应的关键，优化引物设计可以显著提高pcr的特异性和效率。
详细描述
引物设计时需考虑特异性、长度、GC含量、引物二聚体和发夹结构等因素，通过合理设计引物，可以避免非特 异性扩增和引物二聚体形成，提高pcr的特异性。
提高模板质量
总结词
模板质量对pcr结果的影响不容忽视， 提高模板质量可以提高pcr的产量和特 异性。
模板质量差
总结词
模板质量的好坏直接影响到PCR的效率和产物质量。
详细描述
模板中可能含有抑制剂、DNA聚合酶抑制剂或DNA聚合酶竞争性抑制剂等物质， 这些物质会影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失败或扩增效率低下。此外，模 板的浓度过低或过高也可能影响PCR结果。
pcr循环参数不当
总结词
PCR循环参数包括变性、退火、延伸等步骤，这些步骤 的温度和时间设置对PCR结果有重要影响。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)2009-03-28 11:38问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因： 1.模板不纯 2.Buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen） 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区 2.引物长度一般在15~30碱基之间。
PCR问题总汇及详细解决方案
PCR问题总汇及详细解决方案
PCR的影响因素很多的，尤其试剂的保存，人为的因素都很重要: 看看试剂是否有过期或保存不当，可能出现部分变质所以P不出来，换新的试剂看看
人为也很重要，冰上操作的时间，步骤等对P的效果很有影响，可找实验经验好点的人再试一试.
如果是怀疑仪器方面的问题，我觉得也有可能，可以去别的试验室借PCR仪看看是否能行.
别用自己的胶检测，用别人的胶检测试试，以前我P的很好，但是胶有问题老是扩散，后来用别人的胶试了试，非常赞.
本文针对PCR产物序列中引入了错误怎么办？PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带？如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带？对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
PCR体系是10ul的，每次PCR完了以后，管壁上有一层水气，需不需要覆盖矿务油？加多少，具体步骤应怎样？
PCR加样孔上有很亮的条带，但没有产物条带？
PCR的产量有许多因素决定他们的主次关系是什么,各因素又是怎么调节的？
PCR产物大约有900bP，哪种测序方法比较好？直接用纯化的PCR产物测序还是克隆到T载体上再测序？纯化PCR产物的方法哪种比较好？
引物间形成了比较多的二聚体，使产物很少。
这种情况该怎么处理?
为什么会产生弥散（smear）条带？如何解决？。
PCR常见问题分析及对策
PCR反应常见问题汇总（转自tiangen）----PCR常见问题分析及对策1.PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
2.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR 循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
普通PCR常见问题及解决对策
普通PCR常见问题及解决对策普通PCR常见问题及解决对策⼀、普通PCR常见问题及解决对策PCR产物的电泳检测时间⼀般为48h以内，有些最好于当⽇电泳检测，⼤于48h 后带型不规则甚致消失。
1. 假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进⾏分析研究。
1.1 模板①模板中含有杂蛋⽩质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋⽩质没有消化除净，特别是染⾊体中的组蛋⽩，④在提取制备模板时丢失过多，或吸⼊酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了⽑病，因⽽要配制有效⽽稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
1.2 酶失活需更换新酶，或新旧两种酶同时使⽤，以分析是否因酶的活性丧失或不够⽽导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴⼄锭。
1.3 引物引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物⼀条浓度⾼，⼀条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定⼀个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，⼀定要有引物条带出现，⽽且两引物带的亮度应⼤体⼀致，如⼀条引物有条带，⼀条引物⽆条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如⼀条引物亮度⾼，⼀条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应⾼浓度⼩量分装保存，防⽌多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成⼆聚体等。
1.4 Mg2+浓度Mg2+离⼦浓度对PCR扩增效率影响很⼤，浓度过⾼可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚⾄使PCR扩增失败⽽不出扩增条带。
1.5 反应体积的改变通常进⾏PCR扩增采⽤的体积为20ul、30ul、50ul。
PCR技术之——常见问题解析及处理方法
PCR技术之——常见问题解析及处理方法我们进行核酸扩增时，往往会不定的出现一些异常问题，本期我给大家搜集了一些平时经常性遇到的一些问题，希望对大家有所帮助。
（一）相对特异性 PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。
由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应考虑其绝对特异性和相对特异性。
前者指两条引物链的核苷酸序列只与靶DNA片段互补，后者是指两条引物链的核苷酸序列及两者之间的DNA长度对靶DNA片段是特异的，但亦可与其他区域的DNA片段互补，而其PCR产物的长度与靶DNA片段的扩增产物的长度明显不同，应根据两引物问的DNA片段长度，预计PCR产物的大小，并与电泳分析的DNA片段大小比较．或用寡聚核苷酸限制性内切酶片段分析，或用分子杂交、核苷酸序列分析来测定。
（二）标本中存在的有形成分对反应的抑制这一点主要是针对来自临床标本中的杂质加细菌蛋白质和Taq DNA聚合酶抑制因子，须注意避免污染和去除标本中的杂质；将标本加热煮沸使抑制因子与DNA分离。
对于来自标本中的细胞和细胞器的崩解、核酸酶的激活均可使待检的DNA降解，降解的DNA是Taq DNA聚合酶作用良好底物，能与靶DNA竞争，从而扩增大量的非特异性DNA，这种非特异性DNA会使背景干扰超过了前景信号影响PCR循环扩增效率，减少特异性DNA扩增产量。
（三）Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶扩增的特异性受PCR循环次数及延伸时间与温度的影响循环次数太多使延伸时间延长和Taq DNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异性扩增；循环次数太少，则不能得到充足的扩增产物，温度不适宜会影响扩增产物数量，延伸温度一般高于复性温度。
（四）复性温度与时间引物与变性DNA的复性温度对PCR 的特异性有影响，复性温度由引物的碱基成分决定。
在低温度（37℃）下复性可出现比扩增DNA长的非特异性扩增带；而在55～60℃复性的扩增带一般是特异的，复性时间过长或过短都会增加非特异性扩增。
PCR常见问题分析及解决策略
荧光定量PCR常见问题
溶解曲线不止一个主峰：
引物设计不佳：设计特异性引物； 引物浓度不适：降低引物浓度； 退火温度低：调整退火温度；
镁离子浓度过高：降低镁离子浓度；
模板中有基因组污染：注意提取过程； 耗材仪器不匹配； 反应体系污染等：设置阳性阴性对照。
荧光定量PCR常见问题
扩增效率低：
提高PCR特异性最重要的方法之一。
策略之四使用PCR增强剂
甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱等 都可充当PCR的增强剂。 其可能的机理是降低熔解温度，从而 有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸 通过二级结构区。 增强剂浓度要适当。
荧光定量PCR常见问题
荧光定量PCR扩增效率确认： 相关系数（R2）：大于0.98 标准曲线斜率：-3~-3.5 PCR扩增效率（E）：0.9~1.2 重复性好：STD ＜0.2 特异性好
PCR常见问题、 原因分析及其对策
PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案
提高PCR反应特异性的策略 定量PCR常见问题 临床PCR检测的常见问题
PCR标准反应体系
• DNA模板
• 引物
• 反应缓冲液 • Mg 2＋浓度 • dNTPs • dH2O • 耐热聚合酶
反应体系对PCR扩增的影响
PCR常见问题之四-----假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物
原 因
靶序列或扩增产物的交叉污染
对 策
• • 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪 内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材 均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应 一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
现象：正对照有条带，而样品则无
PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案!
PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案！PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最好于当日进行检查，大于48h后带型不规章甚至消逝。
但有时仍会与到这样那样的问题，影响检测结果的推断，详细归类为以下常见的4点，描述如下：问题一：无扩增产物现象：正对比有条带，而样品则无。
缘由：1、模板:含有抑制物，含量低。
2、Buffer对样品不合适。
3、引物设计不当或者发生降解。
4、反应条件：退火温度太高，延长时间太短。
对策：1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量。
2、更换Buffer或调整浓度。
3、重新设计引物（避开链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物。
4、降低退火温度、延长延长时间。
问题二：非特异性扩增现象：条带与估计的大小不全都或者非特异性扩增带。
缘由：1、引物特异性差。
2、模板或引物浓度过高。
3、酶量过多。
4、Mg2+浓度偏高。
5、退火温度偏低。
6、循环次数过多。
对策：1、重新设计引物或者使用巢式PCR。
2、适当降低模板或引物浓度。
3、适当削减酶量。
4、降低镁离子浓度。
5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法。
6、削减循环次数。
问题三：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
缘由：1、模板不纯。
2、Buffer不合适。
3、退火温度偏低。
4、酶量过多。
5、dNTP、Mg 2+浓度偏高。
6、循环次数过多。
对策：1、纯化模板。
2、更换Buffer。
3、适当提高退火温度。
4、适量用酶。
5、适当降低dNTP和镁离子的浓度。
6、削减循环次数。
问题四：假阳性现象：空白对比消失目的扩增产物。
缘由：靶序列或扩增产物的交叉污染。
对策：1、操作时应当心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
2、除酶及不能耐高温的物质外，全部试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策PCR常见问题分析及对策(⽆扩增产物、⾮特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：⽆扩增产物现象：正对照有条带，⽽样品则⽆原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发⽣降解4.反应条件：退⽕温度太⾼，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使⽤试剂盒提取模板DNA或加⼤模板的⽤量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间⼆聚体和链内⼆级结构）或者换⼀管新引物4.降低退⽕温度、延长延伸时间问题2：⾮特异性扩增现象：条带与预计的⼤⼩不⼀致或者⾮特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过⾼3.酶量过多4.Mg2+浓度偏⾼5.退⽕温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使⽤巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离⼦浓度5.适当提⾼退⽕温度或使⽤⼆阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退⽕温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏⾼6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提⾼退⽕温度4.适量⽤酶5.适当降低dNTP和镁离⼦的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空⽩对照出现⽬的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应⼩⼼轻柔，防⽌将靶序列吸⼊加样枪内或溅出离⼼管外；2.除酶及不能耐⾼温的物质外，所有试剂或器材均应⾼压消毒。
所⽤离⼼管及加样枪头等均应⼀次性使⽤。
3.各种试剂最好先进⾏分装，然后低温贮存琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物⼀．原理DNA⽚断的分离与回收是基因⼯程操作中的⼀项重要技术，例如可收集特定酶切⽚断⽤于克隆或制备探针，回收PCR产物⽤于再次鉴定等。
回收实验中两个最重要的技术指标是纯度和回收率：前者未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；后者不理想时往往会⼤⼤增加前期的⼯作量。
PCR常见问题及解决方法
PCR常见问题及解决方法PCR常见问题及解决方法1)、不出现扩增条带a)、引物设计有误：核对引物设计方案。
b)、扩增体系配制错误：重复实验。
c)、扩增反应条件不优化：调整Mg2+浓度、酶量、扩增程序。
d)、模板质粒质量偏差：长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的质粒作为模板。
e)、模板的GC含量：GC含量过高会导致DNA的双链无法完全打开，此时加入Vazyme（诺唯赞生物）的PCR Enhancer(货号P021)可以有效降低解链温度；GC 含量过低会导致扩增效率较差，可适当延长引物长度或通过TD PCR摸索合适的反应条件。
2)、出现非特异性扩增带a)、引物设计不够优化：引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体，可降低引物浓度进行优化，必要时重新设计引物。
b)、模板不纯：模板被污染，需重新制备模板。
c)、试验条件不够优化：如果出现比目的条带小的杂带，可通过提高退火温度、降低循环数调整；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数；另外，可降低Mg2+及酶的浓度。
3)、条带弥散或拖尾a)、模板降解或过量：可通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新纯化模板，对于简单模板(例如质粒、λDNA)，每50ul反应使用1pg-10ng DNA；对于复杂模板(例如基因组、cDNA)，每50ul反应使用1ng-1ug DNA。
b)、酶量加太多：如Vazyme（诺唯赞生物）的高保真系列：50ul反应体系加1U，Taq系列：50ul体系加2U。
4)、条带很暗a)、增加模板量，提高循环数。
b)、多扩几管，胶回收浓缩。
5)、产物有错配a)、检查原始模板是否原本就是突变或错配的。
b)、少量序列存在非严谨序列，有相似重组序列，导致重组错位。
PCR实验中常见问题解决方法
QuikStrip 已变干。
加入 40 μL 水，在装载前轻轻上下移液以混合均匀。
3.电泳凝胶上看不到条带、对照 DNA 和PCR 产物
凝胶未正确制备。
确保正确稀释电泳缓冲液。
融化琼脂糖时需要特别注意较高浓度 (>0.8%) 的凝胶。在倒入凝胶之前，确保溶液 没有“团块 ”和玻璃状颗粒，也可以直接使用配置好的预制胶。省时省力。
凝胶未正确染色。
染色时注意浓度，实在不行就重新染色。
电泳装置或电源出现故障。
请联系电泳仪或电泳设备供应商，帮忙排除故障
4.凝胶染色后，DNA 条带模糊。
凝胶没有染色足够长的时间。
严格按照染色流程说明进行实验操作。
5.染色后，条带可见，但不存在 PCR 产物。
PCR扩增不成功。
注意引物设计是否合理，DNA聚合酶的加入量是否适宜。
PCR实验中常见问题解决方法
PCR实验中常见问题及解决方案
PCR实验中常见问题汇总
问题，管中的液体较少。
样品挥发，损失
确保加热的盖子达到适当的温度。
吸取样本后，尽快盖上PCR 管的盖子。防止挥发。
移液不准确
确保吸取 20 µL 引物混合物和 5 µl Lambda DNA 模板到 PCR 管中。样本量少时需要采用高精度移液器。
确保PCR的正确操作，温度设计是否合理。
6.染色后，凝胶上可见条带和对照 PCR 产物，其中一部分样品不存在。
PCR 反应中添加了错误体积的 DNA 和引物。
熟练使用移液器进行精准移液定量，确保移液的准确度
PCR 常见问题及解决方案
PCR 常见问题及解决方案1没有扩展条带可能的原因及对应的解决方案如下：酶失活或在反应体系中未加入酶。
Taq DNA 聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
模板含有杂质。
特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA 脱嘌呤而影响PCR 的结果。
变性温度是否准确：PCR 仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。
反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq 酶以前，将反应体系95℃加热5~10 分钟。
引物变质失效。
人工合成的引物是否正确。
是否纯化，或因储存条件不当而失活。
引物错误。
利用BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。
DNA 凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA 凝胶和PCR 程序的问题。
2PCR 产物量过少可能的原因和对应的解决方案如下：退火温度不合适。
以 2 度为梯度设计梯度PCR 反应优化退火温度。
DNA 模板量太少。
增加DNA 模板量。
PCR 循环数不足。
增加反应循环数。
引物量不足。
增加体系中引物含量。
延伸时间太短。
以 1 kb/分钟的原则设置延伸时间。
变性时间过长。
变性时间过长会导致DNA 聚合酶失活。
DNA 模板中存在抑制剂。
确保DNA 模板干净3扩增产物跑电泳条带弥散可能的原因和对应的解决方案如下：酶量过高。
减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
dNTP 浓度过高。
减少dNTP 的浓度。
MgCl₂浓度过高。
可适当降低其用量。
模板量过多。
质粒DNA 的用量应<50 ng，而基因组DNA 则应<200 ng。
引物浓度不够优化。
对引物进行梯度稀释重复PCR 反应。
循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR 循环。
退火温度过低。
电泳体系有问题：①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；②凝胶没有凝固好；③琼脂糖质量差。
若为PCR 试剂盒则可能：①由于运输储存不当引起试剂盒失效；②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
PCR检测常见问题与解决途径
PCR检测常见问题与解决途径利用PCR方法检测转基因成分时,经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带;尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论,有时可造成严重后果;为了提高转基因检测的准确性和可靠性,PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生;一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性,尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增;本文对PCR检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述;一、假阳性：一假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果;如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果,提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性;实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现;二造成假阳性的原因1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染,或样本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染；2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染;3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题;因为PCR产物拷贝量大一般为1013拷贝/ml,远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物污染,就可形成假阳性;4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染;据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题;5. 实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力,其污染可能性也很大;在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问题比较常见;三假阳性问题的试验控制在每次PCR检测时,一定设立阴性对照样品和阳性对照样品;阴性对照样品检测为阴性时,表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时,表明DNA提取RNA提取、RNA反转录、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常;在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下,才能对检测样品进行判定;只有设立试验全程的对照,才能证明试验结果成立;造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找;试验对照包括：1、DNA阳性对照：以含有目的片段的DNA或质粒作为模板进行扩增,证明PCR试剂是否有效、扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的片段;注意：阳性样品扩增效率高,应严格控制,避免其成为潜在的污染源;2、DNA阴性对照：以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增,用于证明扩增过程中无假阳性现象;3、空白对照：以纯水作为模板进行扩增,用于证明扩增过程中无假阳性现象;4、PCR抑制物对照：在与阳性对照相同的反应体系中,加入相同数量的待测样品DNA,如果未扩增出目的片段,证明此待测样品DNA中存在PCR抑制物;5、空白提取对照：空白提取对照扩增结果为阳性,说明DNA提取试剂可能受到污染;6、阳性提取对照：阳性提取对照扩增结果为阴性,说明提取过程可能有误;如果DNA阳性对照扩增结果为阴性,或者DNA阴性对照和空白对照扩增结果为阳性,则说明PCR试剂或扩增过程存在问题;四假阳性解决途径由于PCR 的敏感性和效率特别高,所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现假阳性;尤其是PCR扩增产物和质粒分子很容易造成实验室的污染,导致假阳性现象发生;1、规范实验室设计实验室设置上分配液区、DNA提取区、扩增区、电泳区;物流应按分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区顺序,严禁倒流;在连续而独立的空间中完成不同实验步骤;不同工作区域相互隔离,通过传递仓传递;PCR前处理区样品制备室、DNA提取室和PCR准备室设置正压通风系统,并设置通风柜或生物反应柜造成局部负压；后PCR室PCR室及电泳室为高度污染区设置负压通风系统,防止大量游离分子及气溶胶,对其它区域造成环境污染;配制PCR反应体系配备冰箱及生物安全柜,此实验室要求无模板DNA存在和向PCR 反应体系中加入模板DNA配备生物安全柜及冰箱要求在不同区域进行;2、规范试剂耗材管理1验证：新购买的试剂需进行实验前验证；2分装：双蒸水、引物和dNTP均应分装储存,并标明日期,以防污染；试剂的分装应在装有紫外灯的超净工作台上进行；试剂分装成小份一次使用后弃去;3消毒：除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒;必要时,在加样本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸;3、规范实验室操作1控制污染源：PCR产物和质粒操作空间是最大的污染源,应严格防止将这个空间的物品带出；2一次性用具：使用实验服和一次性手套,使用带有滤膜的移液器枪头,一次性反应管和离心管；3定期消毒：定期对实验室进行紫外照射,用10%漂白剂、3％双氧水或专用商业产品清理实验室台面及死角;4定期通风：对实验室定期进行正压、负压通风处理；5小心操作：操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；加样时,最后加阳性对照;4、技术处理1在DNA 模板和多聚酶加入前,紫外线照射反应管内容物以破坏污染的PCR 产物;一般选用波长254nm 照射30min Nature , 1990 , 34:27 ；2PCR 实验中使用dUTP ,而不用dTTP ;在扩增前使用UraciI N 一g1ycosylase 尿嘧啶糖基化酶处理可降解交叉污染的PCR 产物,而不降解基困组DNA 模板,然后热灭活此酶,再进行扩增反应Gene,1990,93：125;美国PE 公司提供此类试剂盒；3在PCR 反应前加入一种光化学试剂,反应完成后激活该试剂,光化学试剂可交联DNA 链,使之不能再扩增Nucleic Acids Res,1991,19 ：99;二、假阴性一假阴性现象与判断方法如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果,提示本次实验中可能有假阴性结果;但这里应注意,许多国产PCR试剂盒中阳性对照采用质粒DNA,和标本相比来说,不需纯化提取核酸的步骤,因此,如果在标本核酸纯化提取步骤有问题,即使阳性对照均呈阳性,标本检测中还可能有假阴性;设置内标准基因对照是判断假阴性较好的指示系统;在每一反应管中同时对内标准基因对照进行扩增,若内标准基因对照未能扩增出来,说明该反应管的结果可能有问题;二造成假阴性的原因1．仪器因素PCR实验对仪器的依赖性是很高的,离心机、扩增仪都是造成PCR假阴性的因素;扩增仪的主要问题是孔间差,引起扩增失败或扩增效率降低;而离心机的影响则更容易被忽视;国内使用离心机很少使用离心加速度XXXg作为参数指标,而常使用转数作为参数指标,这里就存在着一个问题,由于离心机的大小不同,有效跳心半径也不相同,因此同样的转速所产生的离心力相差很大有的在数倍以上,所以在相同的离心时间下,有可能模板并没有离心下来,造成PCR假阴性;这个问题在其他实验也有,但因其他实验都是测定大分子蛋白沉淀,对离心的速度要求较低所以不太明显;建议使用小型台式离心机的实验要注意一下这个问题;2．试剂质量问题PCR实验的成功与否试剂的质量至关重要,试剂的质量问题涉及多个方面：细胞的裂解；模板的抽提；引物位点的选择；Taq酶的活性等等;其中任一环节出了问题都会引起结果的假阴性;这些都是试剂质量的问题,因此选用高质量的PCR试剂非常重要;酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性;需注意的是有时忘加Taq 酶或溴乙锭;引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因;有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为：①选定一个好的引物合成单位;②引物的浓度不仅要看OD 值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR 有可能失败,应和引物合成单位协商解决;如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度; ③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效;3．核酸模板问题1模板中含有杂蛋白质；2模板中含有Taq 酶抑制剂；3模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白；4在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚；5模板核酸变性不彻底;在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改;4、物理原因：PCR仪控温不准,也是PCR 失败的原因之一;有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪内的变性、退火和延伸温度;5、靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR 扩增是不会成功的;6．操作人员素质问题PCR实验的环节很多,而且对每一环节的质量要求都很高,例如少加、漏加试剂、离心不充分、循环参数设计错误等等都能造成结果的假阴性;三假阴性问题的试验控制在每次PCR检测时,一定设立阴性对照样品和阳性对照样品;阴性对照样品检测为阴性时,表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时,表明DNA提取RNA提取、RNA反转录、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常;在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下,才能对检测样品进行判定;造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找;试验对照包括：1、DNA阳性对照：以含有目的片段的DNA或质粒作为模板进行扩增,证明PCR试剂是否有效、扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的片段;注意：阳性样品扩增效率高,应严格控制,避免其成为潜在的污染源;2、DNA阴性对照：以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增,用于证明扩增过程中无假阳性现象;3、空白对照：以纯水作为模板进行扩增,用于证明扩增过程中无假阳性现象;4、PCR抑制物对照：在与阳性对照相同的反应体系中,加入相同数量的待测样品DNA,如果未扩增出目的片段,证明此待测样品DNA中存在PCR抑制物;5、空白提取对照：空白提取对照扩增结果为阳性,说明DNA提取试剂可能受到污染;6、阳性提取对照：阳性提取对照扩增结果为阴性,说明提取过程可能有误;如果DNA阳性对照扩增结果为阴性,或者DNA阴性对照和空白对照扩增结果为阳性,则说明PCR试剂或扩增过程存在问题;四假阴性解决方案1．反应体系不灵敏：1检查PCR试剂是否失效；2检验引物是否降解：3优化PCR 扩增体系与程序;2、PCR反应存在抑制物：1稀释模板DNA,进行扩增分析；2纯化模板DNA,除去蛋白质、多酚、多糖等抑制物；3检测PCR体系中是否含有扩增抑制物;3、DNA提取失败：1选择与优化样品DNA提取方法；2验证DNA提取试剂是否失效;三．非特异扩增一现象PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带;非特异性条带的出现,二原因：1. 引物设计与浓度问题引物设计：引物碱基的G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带;ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列;避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带;引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败;引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性;引物浓度：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会;2. Mg2+离子浓度过高：在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜;Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少;3. 退火温度过低：变性后温度快速冷却至40℃～60℃,可使引物和模板发生结合;由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞;退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度;对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想;引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值解链温度=4G+C＋2A+T复性温度=Tm值-5～10℃在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性;复性时间一般为30～60sec,足以使引物与模板之间完全结合;4. PCR循环次数过多：当其它参数确定之后,循环次数主要取决于DNA 浓度;一般而言25-30轮循环已经足够;循环次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增加;通常经25-30 轮循环扩增后,反应中Taq DNA 聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够,需要进一步扩增,可将扩增的DNA 样品稀释103-105倍作为模板,重新加入各种反应底物进行扩增,这样经60 轮循环后,扩增水平可达109-1010;扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C＝Co1+P n;其中：C 为扩增产物量,C0 为起始DNA 量, P 为增效率, n 为循环次数;在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应;平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平;因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应,减少非特异性产物;5. 酶的质和量,催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U指总反应体积为100ul时,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少; 往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增;四．PCR扩增出现涂抹带1、原因：往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起;2、对策：1 减少酶量,或调换另一来源的酶；2减少dNTP的浓度；3适当降低Mg2+浓度；4增加模板量,减少循环次数;五、标准问题转基因成分检测一般按照标准方法进行,引物和PCR反应体系一般都经过了严格的循环验证;有时标准方法可能存在问题,导致假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的产生;标准方法可能存在的问题有：1.引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR 扩增时,扩增出的PCR 产物为非目的性的序列;靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性;2. Mg2+ 浓度不合理：Mg2+ 离子浓度对PCR 扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR 扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR 扩增失败而不出扩增条带;3. 反应体积的改变：通常进行PCR 扩增采用的体积为20ul 、30ul 、50ul ;或100ul ,应用多大体积进行PCR 扩增,是根据检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败;4.PCR温度设置不合理：变性对PCR 扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性；退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR 扩增效率;六、检测极限问题当样品中转基因成分很低时,反应体系内可能不含有扩增模版,因而容易造成假阴性结果;PCR理论检测极限是在反应体系中存在一个拷贝的目标DNA分子,由于人的判读能力限制和PCR效率等原因,定性检测实际极限值一般是理论检测极限值的10-30倍;也就是说,如果转基因成分低到检测极限时,检测不到转基因成分的可能性会很大,或者说出现假阴性的概率很大;出现假阴性的原因是由于抽样误差,反应体系中不存在有效扩增的模版分子;此时是不适合做PCR检测的;根据作物基因组的大小,可以计算出不同作物的理论检测极限并估计出实际检测极限;例如在100微升的反应体系中,小麦基因组有0.58万个拷贝,一个转基因拷贝的重量比理论检测极限是0.0174%,玉米的理论检测极限是0.003,其他作物的理论检测极限一般在0.001%-0.01%;如果反应体系是20微升,理论检测极限值将提高5倍,小麦为0.085%,玉米为0.015%, 其他作物将在0.005-0.05%之间;反应体系是20微升的定性检测实际极限值一般是在0.05-0.5%;低于这个含量时,反应体系中有时不含扩增模版DNA,因此很难得到正确的检测结果;七．怎样查找污染源如果不慎发生污染情况,应从下面几条出发,逐一分析,排除污染;一设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况;选择阳性对照时,应选择扩增弱,且重复性好的样品,因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列,反而可能成为潜在的污染源;如果以含靶序列的重组质粒为对照,100 个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增;阴性对照的选择亦要慎重,因为PCR 敏感性极高,可以从其它方法Sourthern 印迹或点杂交等检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子;此外,每次扩增均应包括PCR 体系中各试剂的时机对照,即包括PCR 反应所需的全部成分,而不加模板DNA,这对监测试剂中PCR 产物残留污染是非常有益的;如果扩增结果中试剂对照为阳性结果,就是某一种或数种试剂被污染了;此时,要全部更换一批新的试剂进行扩增,扩增时设立不同的反应管,每一管含有一种被检测试剂,在检出污染试剂后,应马上处理;二环境污染：在排除试剂污染的可能性外,更换试剂后,若不久又发现试剂被污染了,如果预防措施比较严密,则考虑可能为环境污染;环境污染中常见的污染源主要有：1. 模板提取时真空抽干装置；2. 凝胶电泳加样器；3. 电泳装置；4. 紫外分析仪；5. 切胶用刀或手术刀片；6. 离心机；7. 冰箱门把手,冷冻架,门把手或实验台面等；此时可用擦拭实验来查找可疑污染源：1用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；20.1ml 去离子水浸泡；3取5ml 做PCR 实验；4电泳检测结果;8. 气溶胶;如果经过上述追踪实验,仍不能查找到确切污染源,则污染可能是由空气中PCR 产物的气溶胶造成的,此时就应该更换实验场所,若条件不允许,则重新设计新的引物与原引物无相关性;八．污染处理一环境污染1. 稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L 盐酸擦拭或浸泡,使残余DNA 脱嘌呤；2. 紫外照射UV法：紫外波长nm一般选择254/300nm,照射30min 即可;需要注意的是,选择UV 作为消除残留PCR 产物污染时,要考虑PCR 产物的长度与产物序列中碱基的分布,UV 照射仅对500bp 以上长片段有效,对短片段效果不大;UV 照射时,PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体,这些二聚体可使延伸终止,但并不是DNA 链中所有嘧啶均能形成二聚体,且UV 照射还可使二聚体断裂;形成二聚体的程度取决于UV 波长,嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列;在受照射的长DNA 链上,形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基,其他非二聚体的光照损伤如环丁烷型嘧啶复合体,胸腺嘧啶乙二醇,DNA 链间与链内的交联和DNA 断裂等均可终止Taq DNA 聚合酶的延伸;这些位点的数量与二聚体位点相当;如果这些位点0.13/碱基在DNA 分子上随机分布,一个500bp片段的DNA 分子链上将有32 处损伤位点,那么,105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤;相反,如果100bp 的片段,每条链上仅有 6 处损伤,105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤;这就是UV 照射有一定的片段长度限制的原因;二反应液污染可采用下列方法之一处理：1. DNase I 法：PCR 混合液未加模板和Taq 聚合酶加入0.5U DNase I,室温反应30min 后加热灭活,然后加入模板和Taq 聚合酶进行正常PCR 扩增;该方法的优点是不需要知道污染DNA 的序列；2. 内切酶法：选择识别4 个碱基的内切酶如Msp I 和Taq I 等,可同时选择几种,以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷,室温作用1h 后加热灭活进行PCR；3. 紫外照射法：未加模板和Taq 聚合酶的PCR 混合液进行紫外照射,注意事项与方法同上述UV 照射法；4. g 射线辐射法：1.5kGy 的辐射可完全破坏0.1ng 基因组DNA,2.0 kGy 可破坏104 拷贝的质粒分子,4.0 kGy 仍不影响PCR,但高于此限度会使PCR 扩增效率下降;引物可受照射而不影响PCR,g 射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA 的;三尿嘧啶糖苷酶UNG法由于UV 照射的去污染作用对500bp 以下的片段效果不好,而临床用于检测的PCR 扩增片段通常为300bp 左右,因此UNG 的预防作用日益受到重视和肯定;1. 原理：在PCR 产物或引物中用dU 代替dT;这种dU 化的PCR 产物与UNG 一起孵育,因UDG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键,可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸,从而失去被再扩增的能力;UNG 对不含dU 的模板无任何影响;UNG 可从单或双链DNA 中消除尿嘧啶,而对RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用;. dUTP 法：用dUTP 代替dTTP,使产物中掺入大量dU;在再次进行PCR 扩增前,用UNG 处理PCR 混合液即可消除PCR 产物的残留污染;由于UNG 在PCR 循环中的变性一步便可被灭活,因此不会影响含dU 的新的PCR 产物;3. dU 引物法：合成引物时以dU 代dT,这样PCR 产物中仅5ˊ端带dU;UNG 处理后,引物失去了结合位点而不能扩增;对长片段1-2kb 以上的扩增用dUTP 法效率较用dTTP 低,而用dU 法就可克服这一缺点;dU 引物最好将dU 设计在3ˊ端或近ˊ端;该法仅能用于引物以外试剂的处理;4. 优点：可以去除任何来源的污染；UNG 处理可以和PCR 扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU 存在,可彻底消除污染源;。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
PCR常见问题及解决方案
PCR常见问题及解决方案问题可能原因解决方法无产物或产量低模板浓度偏低或偏高电泳检测模板浓度,调整模板用量模板降解重新制备;基因组DNA、cDNA应小量分装后低温保存模板中含有抑制反应的杂质纯化模板引物浓度不足调整引物浓度,特别是针对长片段PCR引物存在二级结构重新设计引物,避免二级结构;优化退火温度引物降解引物应高浓度小量分装,-20℃保存,避免反复冻融Mg2+浓度偏低适当提高Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度dNTP降解-20℃保存,小量分装,避免反复冻融酶纯度低,扩增效率差选用高质量DNA聚合酶酶量不足适当增加酶量用酶不当针对模板、目标片段的特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)缓冲液失效更换缓冲液或使用预混PCR反应体系模板变性不充分适当延长变性时间;对高GC或复杂结构模板,提高起始变性温度至98℃退火温度偏高降低退火温度,应比引物Tm低至少5℃ 延伸时间不足增加延伸时间,特别是针对长片段PCR 循环数目不够增加循环数PCR管污染质量可靠的PCR管通常不需灭菌,否则应先高温高压灭菌处理;用过的PCR管不可清洗后重复使用PCR仪故障检查程序和模块温度其他使用PCR增强剂非特异产物过多,引物二聚体拖尾严重体系污染设计对照实验寻找污染源,操作时应注意避免交叉污染引物浓度过高适当减少引物浓度引物序列特异性差重新设计引物Mg2+浓度过高降低Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度dNTP浓度过高降低dNTP浓度酶量过多减少酶量,以0.5 U间隔递减退火温度过低提高退火温度延伸时间过短增加延伸时间,以1 min间隔递增循环次数过多减少循环次数模板结构过于复杂或目标片段过长特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南);使用PCR增强剂其他HotStart PCRTouchDown PCR巢式PCR引物3’末端存在互补序列重新设计引物引物浓度过高降低引物浓度模板浓度过低提高模板浓度退火温度不合适优化退火温度循环次数过多减少循环次数其他HotStart PCR引物浓度过高调整引物浓度引物序列特异性差或模板上存在同源序列重新设计引物模板降解重新制备模板模板浓度过高降低模板浓度dNTP浓度过高减少dNTP用量Mg2+浓度过高降低Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度酶量过多或质量差减少酶量,以0.5 U间隔递减;更换质量可靠的酶变性温度过低提高变性温度,以0.5℃递增退火温度过低提高退火温度延伸时间过长缩短延伸时间循环次数过多减少循环次数,以2个循环间隔递减体系污染设计对照实验,消除污染源其他HotStart PCR TouchDown PCR 巢式PCR假阳性目标片段与非特异扩增片段间存在同源性设计阴性对照,确认为引物问题后重新设计引物体系污染设计阴性对照判断是否有污染,去除污染源。
PCR常见问题分析及解决策略
Mg 2＋浓度
•过低无扩增产物
•浓度适当
dNTPs
•避免反复冻融
•pH值适当 •避免污染
dH2O
如何选择最合适的DNA聚合酶
Taq酶 PCR用耐热 DNA聚合酶
pfu酶
Hotstart Taq酶 Taq plus 混合酶 Long Taq Taq platinum
PCR常见问题、 原因分析及其对策
PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案
提高PCR反应特异性的策略 定量PCR常见问题 临床PCR检测的常见问题
PCR标准反应体系
• DNA模板
• 引物
• 反应缓冲液 • Mg 2＋浓度 • dNTPs • dH2O • 耐热聚合酶
反应体系对PCR扩增的影响
荧光定量PCR常见问题
溶解曲线不止一个主峰：
引物设计不佳：设计特异性引物； 引物浓度不适：降低引物浓度； 退火温度低：调整退火温度；
镁离子浓度过高：降低镁离子浓度；
模板中有基因组污染：注意提取过程； 耗材仪器不匹配； 反应体系污染等：设置阳性阴性对照。
荧光定量PCR常见问题
扩增效率低：
如何选择最合适的DNA聚合酶 -----根据PCR实验需求
特异性-----基因组扩增、RT-PCR
保真性-----基因筛选、测序、克隆 长片段扩增-----构建基因图谱、测序等 扩增效率-----复杂模板扩增（GC含量高、二级结构） PCR试剂盒-----复杂模板扩增、大规模基因检测
PCR常见问题之一-----无扩增产物
PCR常见问题之四-----假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物
原 因
靶序列或扩增产物的交叉污染
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.PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低.6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：①必要时重新设计引物。
②减低酶量或调换另一来源的酶。
③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
③适当降低Mg2+浓度。
④增加模板量，减少循环次数。
克隆PCR产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。
1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。
应测定比值范围。
连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。
室温保温1小时，或4oC过夜。
在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。
室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4oC过夜。
PCR产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。
如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。
少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。
为此需在克隆前做凝胶纯化。
如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？A）涂布未转化的感受态细胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。
B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。
例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。
用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。
培养过夜，产生1000个菌落。
转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA的总量。
铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。
具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。
转化率为：1000克隆X10（3次方）ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug 转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。
C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。
可能是连接酶污染了核酸酶。
T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。
对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4oC过夜。
B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。
为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。
如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。
如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
C）插入片段不适于连接。
用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。
UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。
D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。
加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。
详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。
E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：将PCR反应的试管与反应板紧贴。
当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。
不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。
对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。
没有扩增产物：在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。
泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。
检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。
检查模板和引物的用量。
增加循环次数和/或模板DNA的用量。
泳道中出现模糊条带：减少循环次数或模板DNA的用量。
提高退火温度，但不要超过68℃。
重新设计引物或设计更长的引物。
其他值得注意的条件：建议使用0.2-ml薄壁管。
厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。