显微操作仪使用规程

显微操作仪使用规程

一、原理

采用显微操作系统（倒置显微镜/体视显微镜+显微操作器）将供体物（基因、细胞核或细胞其他成分）直接注入宿主细胞（去核卵母细胞、胚胎细胞或体外培养的细胞）中，研究供体物的功能或者获得转基因动植物的技术。

二、显微注射操作过程

2.1 针头装液

1、使用无菌的微量加样器从微注射针头的后部加入0.5～1μl的注射样品。

2、使用玻璃毛细管拉出毛细管针头，里面有与毛细管平行的细丝，有利于液体从后部向针头方向运动。只需在针头后部浸入1mm深度，不需使用手指或其他东西接触，就足以使少量的样品到达针尖部。

2.2 针头定位

1、将装液后的针头的游离端安在连接器上，然后旋紧连接器以固定针头，再将其固定到微操作仪的托针管上。

2、把载有待注射细胞的盖玻片转移到里面有缓冲培养基的平皿中，将其放在中央。

3、将培养皿放在显微镜载物台上，尽量将盖玻片上所画圆圈的一个对准光照的中心区，这时光的亮度最好。

4、用低倍物镜对准细胞调焦。

5、将针头推入视野中心，在视野中针头呈阴影状。

6、轻轻的落下针头，直至到达培养基中后停下。

7、通过显微镜观察，移动针头，必要时调整微操作仪，直到针头的阴影在视野的上方。然后确定针头的位置，使其约处在视野中心。

8、轻轻下调针头，直到针头变得清晰一些

9．调到工作放大倍数，调准细胞焦距，找到针尖。

10、如果找不到，重新使用低倍镜，尽量将针头调到视野的中心，重复上述的步骤。

11、小心下调针尖，直到其完全聚焦。

2.3 显微注射的操作

1、使用最低放大倍数（50×），把焦距对准位于盖玻片上注射标记区域的细胞平面上。用肉眼将注射针头对准到照度最亮处的中心，降下针头，直到进入培养基。把针头调入到视野的中心，轻轻放下针头，直到看清楚为止。然后将放大倍数调至工作倍数，即320×，对准细胞表面调焦。将针头调整到中心，下降针头，对准焦距。移动显微镜载物台，使针尖对准细胞核或核周的胞质。

2、小心落下针尖，使其进入细胞核或核周的胞质。

3、使用注射器施加注射压

4、轻轻上提针头，直到离开细胞。

5、移动显微镜载物台，找到下一个细胞，重复2～4步骤。

[注意事项]

1 在整个过程中，注射针尖应远离人员和实验室中的仪器。注射针在持针器上安装不牢时，注射器、管子及注射针内的压力，可能将注射针射出。

2 在反向充填液体时，适当地在显微镜下观察注射针尖，以决定在加压时是否注射针阻塞或偏斜。阻塞通常可通过将针尖轻轻敲击一个固定物而得以缓解。针尖偏斜的注射针是适合于显微注射的，但其使用应做细微调整或补偿注射中加压所造成的额外偏斜。

3 注射速度过快能扰乱细胞质成分，细胞裂解或细胞从底层移位。当注射体积小于估计的细胞体积的10%，并且注射样品的流动速度几乎不导致可见的细胞质移位时，注射效果最好。

4 用紫外光可看到注入标记物后的活细胞，但会对细胞造成不可恢复的损伤，因此应尽可能缩短紫外光照射时间。

5 如果对已经注射的细胞进行免疫荧光测定或其他处理，最好使用可固定的葡聚糖，以防在冲洗中造成标记物的扩散损失。

三、维护保养

1、显微操作仪属于高级精密仪器，在使用时一定要严格按照操作流程进行，以免损坏仪器。

2、注射速度过快将扰乱细胞质成分，造成细胞破裂后细胞移位。

3、显微操作仪注射手柄应采用专用油，防止干燥，发霉。

4、安装针的时候要装紧牢固，防止漏油，防止空气进入。

5、一旦有注射针断在注射管中，应立即处理防止堵塞注射管。