细胞培养与病毒培养实验步骤
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
病毒培养方法
病毒培养方法
病毒培养是一种重要的实验技术，它在病毒学研究、疫苗生产和药物筛选等领域都有着广泛的应用。
正确的病毒培养方法可以保证病毒的纯度和活性，为后续的实验研究提供可靠的基础。
下面将介绍一种常用的病毒培养方法，供大家参考。
首先，准备培养基和细胞。
常用的培养基有DMEM、MEM等，细胞可以选择HEK293、Vero等。
将培养基加热至37摄氏度，使其保持体温。
其次，接种病毒。
将培养基加热后，将其放置在无菌工作台上。
然后，将需要接种的病毒加入培养基中，轻轻摇匀。
接着，将接种好病毒的培养基加入到细胞培养皿中。
将培养皿放置在37摄氏度的恒温培养箱中，培养一定时间。
在培养的过程中，需要定期观察细胞的情况。
通常情况下，细胞会出现明显的变化，比如颜色的改变、细胞的增殖等。
这些都是培养是否成功的重要指标。
最后，收获病毒。
当细胞出现明显的病毒感染迹象时，可以收获病毒。
首先，将细胞培养液离心，离心后的上清液中含有病毒。
然后，将上清液收集起来，经过一系列的离心、过滤等步骤，最终得到纯净的病毒溶液。
总的来说，病毒培养是一项复杂的实验技术，需要严格的操作流程和高超的实验技巧。
只有掌握了正确的病毒培养方法，才能够保证病毒的纯度和活性，为后续的实验研究提供可靠的基础。
希望以上介绍的病毒培养方法对大家有所帮助，谢谢阅读！。
实验十病毒的细胞培养
实验十病毒的细胞培养
一、目的：掌握传代细胞的传代和培养方法，认识BVDV在MCBK细胞上产生的CPE
特征。
二、实验步骤
1、细胞分散液的配制：取10倍浓缩的EDTA、胰蛋白酶细胞分散液1mL，加入9mL双
重去离子灭菌蒸馏水混合即成。
2、细胞生长液：含8%FCS、1%谷氨酰胺、2%双抗的MEM以7.5%碳酸氢钠矫正pH值
为7.2（粉红色，MEM内含有中性红指示剂）。
3、细胞传代与培养：取长满单层的MCBK细胞，弃去细胞培养液，加入细胞培养瓶体
积0.5%的细胞分散液，冲洗整个瓶体，再以细胞分散液摇动消化细胞2次，最后加入少许分散液，于37℃温箱内消化，待细胞变成云雾状（细胞间质已分开），轻轻振克数次，使细胞从瓶壁脱落后，迅速加入细胞生长液，大口吸管吹打数次，分装到2各细胞培养瓶内，37℃温箱静止培养。
4、病毒接种与收获：单层接种（吸附与不吸附）法接毒后，加入细胞维持液。
同步接种
法接毒后，加入细胞生长液，次日换成细胞维持液。
每日观察CPE，当CPE达到75%时置于冰箱内冻结收获。
5、病毒的鉴定：进行形态学（电镜负染、超薄切片观察）、理化学（耐酸、耐乙醚和氯
仿、耐热试验等）、生物学（动物感染、血凝、细胞感染谱试验等）、免疫学（中和试验、荧光抗体试验等）和分子生物学（病毒蛋白分析、PCR、核酸探针试验等）等鉴定。
三、实验报告内容
1、单层细胞传代和培养的注意事项。
2、试述细胞培养的优点。
3、细胞接毒方法的种类及优缺点。
4、病毒鉴定的方法常用的有那些。
病毒的细胞培养操作流程
病毒的细胞培养操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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药厂要做的实验报告(3篇)
第1篇实验名称：新型抗病毒药物的体外活性筛选及药效学评价一、实验目的1. 筛选出具有抗病毒活性的新型药物。
2. 评价该药物的药效学特性，为临床应用提供依据。
二、实验材料1. 药物：待筛选的新型抗病毒药物（以下简称药物A）。
2. 对照药物：已知具有抗病毒活性的药物（如利巴韦林）。
3. 病毒株：流感病毒A/H1N1。
4. 细胞：MDCK细胞（犬肾上皮细胞）。
5. 试剂：细胞培养试剂、病毒培养试剂、药物溶解剂等。
三、实验方法1. 细胞培养：将MDCK细胞接种于96孔板，于37℃、5%CO2培养箱中培养24小时，待细胞生长至约80%时，用于实验。
2. 病毒培养：将流感病毒A/H1N1接种于MDCK细胞，于37℃、5%CO2培养箱中培养，收集病毒感染后的细胞。
3. 实验分组：将96孔板分为空白组、药物A组、药物A高浓度组、药物A低浓度组、对照组和阳性对照组。
4. 药物处理：向各实验组细胞中加入不同浓度的药物A，对照组加入等体积的溶剂，阳性对照组加入已知抗病毒药物。
5. 细胞培养：将各实验组细胞继续培养24小时，收集细胞。
6. 病毒滴度测定：将各实验组细胞接种于96孔板，加入病毒悬液，于37℃、5%CO2培养箱中培养，观察细胞病变情况，计算病毒滴度。
7. 数据处理：采用SPSS软件进行统计分析，比较各组病毒滴度的差异。
四、实验结果1. 药物A对流感病毒A/H1N1的抑制作用：药物A在不同浓度下对流感病毒A/H1N1具有抑制作用，且随着药物浓度的增加，抑制作用逐渐增强。
2. 药物A与对照药物的比较：药物A在相同浓度下对流感病毒A/H1N1的抑制作用与对照药物相似，表明药物A具有较好的抗病毒活性。
3. 药物A的半数抑制浓度（IC50）：药物A的IC50为10μM，表明药物A具有较好的抗病毒活性。
4. 药物A的安全性评价：药物A在实验浓度范围内对细胞无明显毒性作用。
五、实验结论1. 药物A具有较好的抗病毒活性，对流感病毒A/H1N1具有抑制作用。
细胞培养操作流程
细胞培养操作流程细胞培养是一种人工环境中扩增和维持活细胞的技术。
它对于研究细胞生物学、药物筛选和治疗等方面有着重要的应用。
下面是一个常见的细胞培养操作流程，具体步骤如下：1.准备培养器具和试剂：首先需要准备好培养器具和所需试剂，包括培养皿、离心管、培养基、培养液、胶原蛋白贴士等。
2.细胞的分离和收获：将待培养的组织或细胞样品取出，用适当的方法将细胞分离开来。
可以使用酶消化、机械切割或筛选等方法。
分离好的细胞通过离心将细胞沉淀，将上清液吸掉，得到细胞沉淀。
3.细胞计数和浓度调整：使用细胞计数仪或血球计数室等工具，将细胞计数。
根据需要可以进行浓度调整，使其适合在培养器具中的扩增。
4.细胞的接种和培养：将得到的细胞沉淀重新悬浮于培养基中，并将其放置于培养皿中。
确定适宜的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。
定期观察细胞的生长情况，并更换培养基，以维持细胞的健康生长。
5.细胞的传代：当细胞在培养皿中达到一定密度时，需要进行传代，以防止细胞群体过于致密导致细胞生长受限。
传代前需先将细胞沉淀，并用如十倍的细胞培养基将其重新悬浮。
将悬浮的细胞分装至新的培养皿中，培养基的更换和细胞的观察也是相同的。
6.试验处理：在细胞培养过程中，可能需要对细胞进行各种试验处理，如药物处理、感染等。
根据需要，将试验处理物加入培养基中，确保细胞接触到试剂，并保持正常生长。
7.细胞固定和染色：进行一些试验或者观察时，对细胞进行固定和染色可以帮助观察或者分析细胞的形态、细胞器分布等。
选择适合的固定和染色方法，将细胞固定在培养皿中，并使用染色剂染色。
8.细胞的收集和保存：在实验完毕后，可以用适当的方法将培养皿中的细胞收集起来。
例如，轻轻洗涤细胞，然后加入适当的缓冲液，用吸管吸出，或者使用离心机离心沉淀。
收集好的细胞可以用于下一步的实验，或者进行冷冻保存。
9.培养器具的清洁和消毒：一旦细胞收集完毕，需要对使用过的培养器具进行清洗和消毒，以防止细菌、真菌、病毒等的传播。
新冠检测方法培养法 -回复
新冠检测方法培养法-回复新冠检测方法——培养法随着新冠病毒在全球范围内的传播，对于快速、准确地检测感染者的需求变得尤为重要。
继基因检测（PCR）和抗体检测等方法之后，培养法也成为了一种重要的新冠病毒检测方法。
本文将一步一步介绍新冠检测方法——培养法，以及其在疫情防控中的应用。
第一步：收集样本新冠病毒培养法的第一步是收集样本。
常见的样本类型包括咽拭子、鼻拭子以及痰液等。
这些样本将被送至实验室进行后续处理。
第二步：抽提RNA在进行培养法之前，需要抽提患者样本中的RNA。
这一步骤旨在提取样本中的遗传物质，以便后续步骤中进行病毒的培养和分离。
目前，常用的RNA 抽提方法包括酚-氯仿法和磁珠法等。
第三步：制备细胞培养物新冠病毒需要适当的环境才能生长和繁殖。
因此，制备细胞培养物是进行培养法的关键步骤之一。
常用的细胞株包括Vero E6、Vero CCL-81等。
这些细胞会在实验室中进行培养，以保持其生长状态。
第四步：接种病毒接种病毒是进行新冠病毒培养的关键一步。
在实验室中，将患者样本抽提的RNA引入细胞培养物中。
这样，如果样本中存在新冠病毒，它们将感染细胞并开始生长。
第五步：观察细胞变化进行培养法之后，检测者需要观察细胞的变化。
新冠病毒感染的细胞可能会显示一些典型的特征，例如细胞增殖速度的变化、细胞形态的改变以及病毒颗粒的形成等。
第六步：验证结果通过观察细胞的变化，可以初步判断样本中是否存在新冠病毒。
然而，得出确诊结果需要进一步的验证。
目前，常用的验证方法包括PCR和基因测序等。
这些方法可以检测和鉴定新冠病毒的遗传物质，以确认细胞培养物中的病毒是否为新冠病毒。
新冠病毒培养法的应用新冠病毒培养法在疫情防控中发挥了重要作用。
首先，培养法可以帮助研究人员进一步了解新冠病毒的生物学特性，包括其生长繁殖规律以及对宿主细胞的影响等，从而为疫苗和药物的研发提供理论依据。
此外，培养法也可用于检测新冠病毒感染者。
与传统的基因检测方法相比，培养法具有以下优点：一是能够获得大量病毒样本，便于后续研究；二是能够判断病毒的复制能力，揭示感染者的传播潜力；三是可以帮助筛选耐药病毒株，指导药物的选择和使用。
细胞培养与病毒培养实验步骤
细胞培养与病毒培养实验步骤实验⼆传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养⼀、实验⽬的了解倒置显微镜的构造与使⽤，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养⽅法、病毒接种⽅法及收毒⽅法。
⼆、常⽤细胞的种类BHK-21：仓⿏肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：⼈的⼦宫瘤细胞Vero：⾮洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于Vero细胞TK-143：⼈的胸苷激酶阴性细胞Sf9：昆⾍细胞三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、⽣长液：含10%犊⽜⾎清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊⽜⾎清、200U/ml青、链霉素的DMEM5、伪狂⽝病病毒液（PRV）四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞⼀般为37℃昆⾍细胞28-30℃五、常⽤细胞分散剂与作⽤原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发⽣⽔解，导致细胞间质⽔解⽽使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、⼄⼆胺四⼄酸⼆钠（EDTA）：与⼆价钙、镁离⼦结合，从⽽使细胞分散。
3、灰⾊链丝菌酶：由灰⾊链丝菌提取的⼀种酶制剂，是蛋⽩酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、营养液1、⼈⼯综合营养液氨基酸、糖类、⽆机盐类、维⽣素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助⽣长因⼦。
2、⾎清1）⾎清的种类胎⽜⾎清、新⽣犊⽜⾎清、成年⽜⾎清、马⾎清、鸡⾎清、兔⾎清、⽺⾎清、⼈⾎清，其中以新⽣犊⽜⾎清使⽤最为⼴泛。
2）⾎清的处理⽆菌采集，过滤除菌。
⽤前56℃灭活30min。
3）⾎清的作⽤A、能提供细胞⽣存、⽣长和增⽣所必须的⽣长调节因⼦。
B、能补充基础培养液中没有或量不⾜的营养成分。
C、含有⼀些可供贴壁依赖型细胞在培养器⽫表⾯贴附和铺展的⽣长基质成分。
病毒的细胞培养
细胞培养的基本概念
传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接 种到新的培养器皿中。
原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长 的细胞在传代之前称为原代培养。
二 主要优点
㈠ 研究的对象是活的细胞。 ㈡ 研究的条件可以人为的控制。 ㈢ 研究的样本，可以达到比较均一性。 ㈣ 研究的内容便于观察、检测和记录。 ㈤ 研究的范围比较广泛。 ㈥ 研究的费用相对较经济。
5 12h后观察细胞病变，若无明显病变，则每隔3h 观察一次。当有70%细胞发生病变后，将细胞液反 复冻融3次，用吸管反复吹打数次，使病毒完全从 细胞中释放出来
正常形态的鸡 胚成纤维细胞
接毒后发生病变的 鸡胚成纤维细胞
（4）效价测定
某些病毒具有凝集某种哺乳动物红细胞的特性，利 用该特性而进行的试验称为病毒的血凝试验。
细胞冻存方法
（1）选取对数生长期的细胞，用常规传代的方法 将细胞制成悬液并计数，800-1000r/min离心5min ，弃上清。
（2）用细胞冻存液将沉淀重悬，调整细胞浓度至 106-107个/ml，分装于冻存管，注明细胞名称，传 代及冻存日期。
（3）冷冻保存：将冻存管于4℃放置30min，然后 移入-80℃超低温冰箱过夜，再放入液氮罐长期保 存。亦可使用程序降温剂逐渐降温，冻存速度先 为每分钟下降速度1-2℃，当温度达到-25℃时，可 调整下降速度为每分钟5-10℃，温度降至-100℃时 ，再放入液氮罐中长期保存。
（4）细胞生长状况的观察
原理： 应每日或隔日观察一次细胞，及时了解细胞形态
、数量及培养液pH值、污染与否等情况，以便采取相 应的措施处理。
肉眼观察 显微镜观察
（5）细胞的冻存
传代细胞应有充足的冻存储备。 一则防止细胞因污染等原因造成细胞系的绝种。
培养细胞的流程
培养细胞的流程
细胞培养是生物学实验中非常重要的一项技术，它可以用于细胞生物学研究、药物筛选、疾病模型建立等多个领域。
下面将介绍一般细胞培养的流程。
首先，准备工作。
在进行细胞培养前，需要准备培养皿、培养基、细胞传代所需的胰酶等材料。
同时需要消毒工作台和培养箱，确保实验环境的无菌。
接着，解冻细胞。
如果是从冷冻状态中取出细胞进行培养，首先需要将冻存管放入37摄氏度的水浴中迅速解冻，解冻后将细胞转移到预先加热的培养基中。
然后，传代细胞。
当细胞生长到一定密度时，需要进行传代操作，以保证细胞的健康生长。
传代操作需要用到胰酶等酶类物质，可以将细胞从培养皿中剥离出来，然后转移到新的培养皿中。
接下来，细胞培养。
将细胞悬浮在培养基中，放入培养箱中进行培养。
培养箱中需要保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度，以提供良好的生长环境。
最后，细胞观察和实验。
在细胞培养的过程中，需要定期观察细胞的形态和生长状态，确保细胞的健康生长。
同时可以进行相关的实验，如药物处理、基因转染等。
综上所述，细胞培养是一个复杂而又重要的实验技术，需要严格控制实验条件，确保细胞的健康生长。
通过以上流程，可以有效地进行细胞培养，并为后续的实验提供可靠的细胞基础。
细胞培养与病毒培养实验步骤
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于Vero细胞TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM5、伪狂犬病病毒液（PRV）四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。
用前56℃灭活30min。
3）血清的作用A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。
C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。
实验室细胞培养的一般步骤
实验室细胞培养的一般步骤细胞培养是一项重要的实验室技术，广泛应用于生命科学研究以及医药产业中。
下面将为您介绍一般的细胞培养步骤，希望能为您提供一些指导意义。
第一步：制备培养基细胞培养的第一步是制备适合细胞生长的培养基。
培养基通常包括营养物质、氨基酸、维生素、生长因子等，可以为细胞提供足够的养分和环境条件。
根据不同的细胞类型和实验目的，制备不同种类和浓度的培养基。
第二步：分离细胞在细胞培养之前，需要将细胞从组织、器官或已有培养物中分离出来。
通常采用酶消化、机械剪切或离心等方法来分离细胞。
分离后，细胞可以在培养基中生长和繁殖。
第三步：细胞接种将分离出的细胞接种到含有培养基的培养皿或培养瓶中。
接种密度要适当，不宜过稀或过密。
同时，需要将培养基中的氧气和二氧化碳平衡，通常使用CO2培养箱来提供适宜的气体环境。
第四步：细胞培养经过接种后，细胞开始在培养基中生长和分裂。
在培养过程中，需要控制细胞的温度、湿度和pH值，保持适宜的生长条件。
此外，定期更换新鲜的培养基可以提供足够的营养物质，维持细胞的正常生长。
第五步：细胞检测和观察细胞培养的过程中，需要定期对细胞进行检测和观察。
包括细胞数量的计数、形态的观察和生长曲线的绘制等。
通过这些检测和观察，可以了解细胞的健康状态、增殖速率以及其他相关参数。
第六步：细胞应用或冻存根据研究或实验的需要，可以选择将细胞用于进一步的实验、传代培养或冻存保存。
冻存细胞需要使用适当的冻存液，将细胞缓慢冷冻并存放在液氮罐中，以便长期保存。
细胞培养是一项需要耐心和细心的工作，每一步都需要严格控制条件和遵循操作规范。
只有如此，才能获得可靠的实验结果和高质量的细胞培养。
希望本文能为您提供参考，更好地开展细胞培养工作。
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
细胞培养的步骤和方法
细胞培养的步骤和方法细胞培养是一种重要的实验技术和研究手段，可以用于研究细胞的生物学特性、生理代谢、信号转导、分化和增殖等。
一个成功的细胞培养实验需要遵循一系列步骤和方法。
本文将介绍10条关于细胞培养的步骤和方法，并展开详细描述。
一、选择适当的培养基和细胞系选择适当的培养基对于细胞培养的成功至关重要。
不同种类的细胞需要不同的培养基来支持其正常生长和生存。
在选择培养基时应注意添加生长因子、激素、血清、抗生素等物质的种类和浓度，以及pH值、温度等因素。
选择合适的细胞系也是非常重要的。
不同的细胞系有不同的生长特性，适宜的细胞系可以提高细胞培养的效率和成功率。
二、消毒实验室设备和培养物品在进行细胞培养前，应仔细消毒实验室设备和培养物品，以防止细菌、真菌和病毒等污染。
常用的消毒方法包括紫外线辐射、70%乙醇喷雾消毒、高压蒸汽灭菌等。
如果不经常清洁和消毒实验室，很容易引入外部细胞，对细胞的培养和实验结果产生影响。
三、准备细胞培养所需的物品和试剂在进行细胞培养前需要准备一系列的物品和试剂，包括培养基、培养皿、移液器、无菌滤纸、细胞分离液、细胞传代液、显微镜干片等。
在使用这些物品和试剂时，需要注意消毒和无菌操作，避免污染和感染。
四、细胞孵育细胞培养需要在特定条件下进行，比如适宜的温度和湿度、含氧气和二氧化碳的环境等。
在孵育细胞时，需要将培养皿放置在细胞培养箱中，保持稳定的生长环境。
同时需要定时检查细胞的状态和生长情况，以及培养基和滤纸的状态，及时更换和添加。
五、细胞分离细胞分离是细胞培养中一个重要的步骤，可以将细胞从培养皿中分离出来，方便进一步的研究。
细胞分离可以通过化学和机械方法实现。
化学方法包括使用谷胱甘肽、胰蛋白酶、胰蛋白酶-EDTA等消化酶，机械方法包括手动刮取、离心、过滤等。
在进行细胞分离前需要确保培养皿没有污染和细胞不存在过多的死亡或脱落。
六、细胞计数和检测细胞计数和检测是细胞培养中另一个重要的步骤，可以帮助研究人员对细胞培养过程中的生长和死亡情况进行了解和分析。
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定方法病毒滴度测定方法是一种用于测定病毒在溶液中的浓度的实验方法。
病毒滴度是指单位体积中含有的病毒颗粒数，通常以每毫升（mL）为单位。
病毒滴度的测定对于病毒学研究和疫苗生产具有重要意义。
本文将介绍常见的病毒滴度测定方法及其操作步骤。
一、细胞培养法。
1. 准备培养皿和细胞悬液，将含有适量细胞的培养皿放入培养箱中孵育，直至细胞生长至适当密度。
用无菌PBS或生理盐水洗涤细胞，用含有适量生长培养基的管中悬浮细胞。
2. 制备病毒稀释液，将病毒溶液以一定比例加入生长培养基中，得到一系列不同浓度的病毒稀释液。
3. 感染细胞，将不同稀释度的病毒溶液加入培养皿中的细胞悬液，孵育一定时间后观察细胞形态变化。
4. 计算滴度，根据感染的细胞数量和病毒稀释液的稀释倍数，利用统计学方法计算出病毒的滴度。
二、血凝法。
1. 准备血凝管，将一定量的新鲜血液加入血凝管中，加入适量的病毒溶液，轻轻摇匀。
2. 孵育，将血凝管放置在37摄氏度的恒温箱中孵育一段时间，观察血凝情况。
3. 计算滴度，根据血凝管中凝结的情况，结合之前加入的病毒溶液的稀释倍数，计算出病毒的滴度。
三、组织培养法。
1. 准备组织培养皿和组织细胞，将含有适量细胞的组织培养皿放入培养箱中孵育，直至细胞生长至适当密度。
2. 感染组织细胞，将病毒溶液加入培养皿中的组织细胞，孵育一定时间后观察细胞形态变化。
3. 计算滴度，根据感染的细胞数量和病毒溶液的稀释倍数，利用统计学方法计算出病毒的滴度。
以上是常见的病毒滴度测定方法及其操作步骤，选择合适的方法取决于实验目的、病毒类型和实验条件。
在进行病毒滴度测定实验时，应严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文能对病毒滴度测定方法有所了解和帮助。
(整理)传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养.
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于Vero细胞TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM5、伪狂犬病病毒液（PRV）四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。
用前56℃灭活30min。
3）血清的作用A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。
C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。
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实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中得培养一. 实验目得了解倒置显微镜得构造与使用，了解不同传代细胞得形态及接毒后得病变特 征,掌握细胞得传代培养方法、病毒接利方法及收毒方法。
二、常用细胞得种类BHK-21:仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2:猪肾传代细胞Hela ：人得子宫瘤细胞Ver 。
：非洲绿猴肾细胞Marc-145:来源于Vero 细胞TK-143:人得胸昔激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、lOOml 细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头BHK-21 (baby hamster kidney)细胞生长液:含10%犊牛血清、200U/inl 青、链霉素得DMEM 2、 3、 0、25%胰酶4、维持液:含2-5%犊牛血清、200U/inl青、链霉素得DMEM5、伪狂犬病病毒液(PRV)四.传代细胞培养得条件要求1)细胞密度:2-3X105个/ml2)pH 范围最适 pH7、0-7、4,耐受 pH6、6-7、83)培养温度哺乳动物细胞一般为37°C昆虫细胞28-3(rC五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸得竣基与其她氨基酸得氨基之间得多肽链发生水解, 导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散得单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠(EDTA):与二价钙、镁离子结合■从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶川I灰色链丝菌提取得一种酶制剂,就是蛋口酶、氨肽酶与竣肽酶得混合物。
六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嚓吟、陀唏、辅助生长因子。
2、血清1)血清得种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2)血清得处理无菌采集■过滤除菌。
用前56°C灭活SOmino 3）血清得作用A、能提供细胞生存.生长与增生所必须得生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足得营养成分。
C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附与铺展得生长基质成分。
D、有中与毒性物质保护细胞不受伤害得作用。
E、给培养液提供ft好得缓冲系统。
F、提供蛋白酶抑制剂/呆护细胞免受细胞释放得蛋口酶得损害。
4）应用血清存在得问题A、血清中存在不少有害于细胞生长与繁殖得物质:补体、免疫球蛋白、生长抑制因子。
B、血清得成分不明确,影响对结果得分析。
C、不同动物、不同批次得血清成分与活性差别较大，使得培养结果不稳定。
七.传代细胞系培养1、优点：1）可以无限得传代。
2) 不少细胞系对病毒很敏感。
3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原得大量生产。
4) 生长旺盛，繁殖快速,对营养条件不苛刻。
2、缺点:在传代过程中遭到支原体与病毒得污染。
3、培养方法1）取长满单层得细胞一瓶,倾去培养液。
2）加入2inl胰酶消化液，于37°C培养箱放置儿分钟,至细胞间出现空隙或细胞变圆后,倒去消化液。
3）加入生长液,反复吹打儿次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶中。
再在每个小瓶中补充生长液至lOml,然后置37C培养箱培养，培养1-2天即可长成单层。
八.病毒（PRV）在传代细胞中得培养1、选长满单层得细胞,倒掉培养液。
2、加入适量得病毒悬液3、置温箱中感作（吸附）45min-lho4、取出瓶子,倒掉或不倒掉培养液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至80%以上得细胞病变。
5、收毒:将病变得细胞置于-2（rc冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中振摇儿次，以使细胞完全从瓶壁上脱落。
然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。
低温贮藏备用。
实验三.原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）一、实验目得了解不同原代细胞得形态,掌握鸡胚成纤维细胞得制备与培养方法。
二材料1、9-11日龄鸡胚2、照蛋灯与蛋座3、碘酊棉球与酒精棉球4、大剪子、眼科剪、小银子5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、6、胰酶、生长液、维持液三、细胞培养得条件要求1)细胞密度原代细胞:4-6X10'个/ml 传代细胞：2-3X10'个/ml2)pH 范圉最适 pH7、0-7、4,耐受 pH6、6-7、83)培养温度哺乳动物细胞一般为37°C昆虫细胞28-3(rC四.操作步杯1、取9-12日龄孵育&好得鸡胚，依次用碘酊与酒精消毒气室部。
2、无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿粪膜，夹住鸡胚颈部, 取出鸡胚放于灭菌平皿中。
3、用眼科剪、银去除鸡胚头.四肢及内脏，用DMEM冲冼2次。
4、将冲洗后得鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。
5、将剪碎得组织块倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分冲洗,并静置儿分钟，待组织块下沉,吸弃上层液体，再加DMEMo如此反复冲洗2-3遍。
6、于沉淀组织块内加入约4倍量得0、25%胰酶，并调pH至7、6-7、&振荡混匀后置37°C水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次，使细胞消化完全（组织块变散松,沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。
7、取出，静置儿分钟，小心吸弃上层胰酶溶液，用DMEM轻洗2次后，加入生长液5ml,用大口径吸管反复吹打,使细胞游离。
8、静置儿分钟,使未消化好得组织块下沉。
9、细胞计数取细胞悬液0、5ml+2ml0. 1%结晶紫一枸椽酸（0、Imol/L）溶液,室温或37°C 温箱中5-lOinin,充分振荡后进行计•数。
按口细胞计数法计算4角4个大方格内得细胞总数（N）。
每ml悬液中得细胞数（n）=N/4X10000XK（稀释倍数）。
活细胞数应在90%以上。
10、将计•数好得细胞稀释到合适得浓度,使细胞量约为4-6X10&个/ml,分层于细胞培养瓶中，每瓶Iml,再补加DMEM生长液至lOml,盖上盖子，置于37°C 恒温箱中培养。
五.结果得观察于培养后每天观察结果,至长层单层。
细胞量较大时，一天即可半:成单层，细胞呈纤维状。
：靈需实验四病毒感染力得滴定（Tcn）5。
得测定）一.实验目得了解病毒感染力测定得儿种常用方法,掌握半数细胞培养物感染量TCID旳得操作步骤、计算方法及含义。
二、测定病毒感染力得方法半数致死量LD“( 50% lethal dose):用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EIDso(egg 50% infective dose):用鸡胚来检测半数细胞培养物感染S TCIDso(50% tissue culture infective dose):用细胞来检测蚀斑形成单位(plaque forming unit, PFU):用细胞来检测三、材料1、长满单层得细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液(PRV)四.TCIDo得操作步骤1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍得稀释，从10"-10"%2、将稀释好得病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔,每孔接种lOOWo3、在每孔加入细胞悬液loom,使细胞量达到2^3X10^个/ml。
4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
(100M1生长液+100M细胞悬液)5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
6、结果得计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法五、TCI九得计算方法CPE:细胞病变效应1、Reed"Muench 两氏法距离比例=（高于50%病变率得百分数-50%）/（A-于50%病变率得百分数-低于50% 病变率得白分数）= (91、6-50)/(91、6-40)=0、8IgTCIDso^距离比例X稀释度对数之间得差+高于50%病变率得稀释度得对数=0、8X(-1) +(-3) =-3、8TCID5O=1O"^'V O. Iml 含义:将该病毒稀释lO’r接种loom可使50%得细胞发生病变。
2. Karber 法IgTCID沪L-d(s-O、 5)L:最高稀释度得对数D:稀释度对数之间得差S:阳性孔比率总与IgTCIDso—l-lX (3、375-0> 5)=-3、 875TCIgFlCr'E/O、Iml 含义:将该病毒稀释10'、接种loom可使50%得细胞发生病变。
实验五血清中与试验-X实验目得了解中与试验得基本原理与儿种不同得测定方法•掌握固定病毒一稀释血清法得操作步骤与计算方法及含义。
二.原理抗体与相应得病毒粒子特异性地结合，使病毒得感染力丧失。
三、用途 1、疾病诊断 2、病«分离株得鉴定 3、不同病毒株得抗原关系研究 4、疫苗免疫原性得评价5、免疫血清得质量评价6、测定实验动物血清中就是否存在抗体四.分类（-）蚀斑（痘斑）减数试验将病«-正常血清混合物以及病毒一待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定上匕较病毒一正常血清组与病«-待检血清组产生得蚀斑数，两者得差数表示待检血清得中与能力。
以试验组得蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就就是其蚀斑减数试验效价。
（二）交义保护试验先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击■根据实验动物被保护得情况，判定待检V得种类或型别。
这一方法得缺点就是试验周期太长,并且需要大量得实验动物。
可用于以下儿方面:应用已知V鉴定未知V;应用已知免疫血清鉴定未知V;应用已知V鉴定未知血清。
（三）终点法中与试验 1、固定病毒一稀释血清法将不同稀释度得血清与固定量得病毒液（一般为100或200个TCIDso. EIDso 或LDso）混合，置适当得条件下感作一定时间，再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物•测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生病毒感染得能力及其效价。
以能保护50%组织培养细胞、鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡得血清最高稀释倍数，作为该血清得50%中与效价（PD5O）O 2、固定血清一稀释病毒法在固定量得血清中■加入等量不同稀释度得病毒■用对照非免疫血清（对照组）与待检血清同时进行测定•讣算每一组得TCID5O>EID SO或LD SO,然后计算中与指数。
五.材料长满单层得细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）6、待检血清.PRV阳性对照血清、PRV阴性对照血清六、操作步骤lx固定病毒一稀释血清法1）测定病毒液得TCID旳2）将测好TCIB。
得病毒液稀释成200个TCIB。
得病毒悬液。
3）在96孔微量培养板中将血清（预先569灭活30min）作连续倍比稀释（具体方法就是在96孔板中先加入50m生长液，再加50M1待检血清,混匀后，吸50M1至下一孔，如此下去。