微生物实验复习提纲

实验一培养基的配置

（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配置（用于分离培养细菌以及测定其数目、天然培养基，）1、称量牛肉膏可以放在小烧杯、表面皿、称量纸中称量，热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速；滤纸不可称量牛肉膏。

2、溶解加水加热搅拌，药品完全溶解（若配置固体培养基，则加入1%~2%的琼脂，再加热融化，此过程需不断搅拌，以防止琼脂糊底或溢出）定容。

若偏酸，滴加1mol/L NaOH

3、调pH 待培养基冷却至室温时检测其pH 不停搅拌并随时用pH试纸检测，

若偏碱，滴加1mol/L HCl

pH调节通常放在加琼脂之前；应注意pH不要调过头，以免回调影响各离子浓度。

液体培养基：滤纸

4、过滤

固体培养基：4层纱布趁热过滤

固体培养基：试管高度的1/5，灭菌后摆斜面、三角瓶的1/2

5、分装

半固体培养基：试管高度的1/3

6、加透气膜

7、包扎将三角瓶的棉塞外包双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿透气膜。

8、灭菌上述培养基121.0℃湿热灭菌20min

9、摆斜面斜面长度不超过试管总长1/2

10、无菌检查37℃温箱培养1-2d

（二）高氏1号培养基的配制（放线菌、组合培养基）

1、称量和溶解可溶性淀粉加冷水调成糊状，再加水加热溶解；微量成分FeSO4*7H2O 现配成高浓度的储备液后加入：100ml+1g=0.01g/ml 再在1000ml+1ml储备液。

2、同上

（三）马丁氏培养基（霉菌、半组合培养基）

1、称量和溶解土豆去皮切块煮开半小时，各成分溶解好后，将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000ml培养液中加3.3ml，加入琼脂加热融化

2、同上

3、链霉素的加入它受热易分解，故临用前将培养基融化后待温度降至45℃左右才能加入。可先将其配成1%溶液，在100ml培养基中加0.3ml，使每ml培养集中含其30μg。

注意事项：称药品时牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖；谨慎调pH，避免

多次回调影响各离子浓度；分装过程中注意不要使培养基沾在管上，以免引起试剂污染。琼脂：凝固剂，无营养价值，不易分解，耐加压灭菌强，96-100度融化，46度凝固

明胶：凝固剂+培养剂，Pr，做氮源，易分解，耐加压灭菌弱，25度融化，20度凝固半固体培养基：0.5%-1%琼脂

固体培养基：1%-2%琼脂、5%-12%明胶

问：培养剂完成后，为什么必须立即灭菌？

细菌生长会消耗培养基，改变pH，释放代谢物，灭菌后细胞破碎产生杂志，增加了实验的不稳定因素。

实验二消毒和灭菌

方法原理适用对象灭菌温度、时间

高压蒸汽灭菌法利用高压蒸汽很高的温度和

压力使菌体的酶、Pr等凝固变

性

培养基、玻璃器皿、水、

缓冲液、金属用具、实验

服、传染性标本

0.1MPa、121℃、

20min

干热灭菌利用高温使微生物细胞内原

生质干燥、细胞膜破坏、Pr

凝固变性、细胞成分氧化变

质玻璃器皿、接种

环、接种针

160-170℃、2h

过滤除菌通过机械作用滤去液体或气

体中的细菌或真菌孢子酶液、抗生素等不耐热溶液的灭菌

（一）高压蒸汽灭菌法步骤

1、加水内锅取出、向外锅中加水，水面与三角搁架相平。

2、装料放回内层锅，装入待灭菌物品，注意不要装的太挤，以免妨碍水蒸气流通影响灭菌效果，装有培养基的容器放置时要防止液体溢出。

3、加盖盖上的排气软管插入排气槽，旋紧螺栓，打开排气阀

4、排气加热，当排除的气流很强并有嘘声时，表明锅内空气已排净（沸腾后约5min）

5、升压关闭排气阀

6、保压当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力。0.1MPa、121℃、20min

7、降压压力自然下降至0

8、无菌检查37℃培养1d

（二）干热灭菌步骤

1、装入物品至烘箱

2、升温温度100℃关闭排气孔。继续至160-170℃

3、恒温2h

4、取出待电温箱温度降到70℃以下取出。未降至切勿打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。

注意事项：

1、高压时切勿忘记加水且水量不可过少，以防止灭菌锅烧干引起炸裂；必须待锅内冷空气排净后才能关上排气阀，不排净冷空气和蒸汽混合锅内压力达不到要求；灭菌完毕后要等到压力降到0才能打开排气阀，开盖取物。否则由于锅内压力骤然下降使容器里的培养基由于内外压力不均匀而喷出试管，使棉塞污染甚至烫伤操作者。

2、干热灭菌物品不要摆放太拥挤，以免阻碍空气流通影响灭菌效果；灭菌物品不要接触电烘箱铁板，以防包装纸烤焦起火。

结果分析--灭菌不彻底原因：锅内温度压力达到要求值；锅内待灭菌物品过多；灭菌时间不够长；国内空气未排尽。

实验三土壤微生物的分离、纯化及无菌操作技术

1、常用分离纯化方法：单细胞挑取法、平板划线法、稀释倒平板法

2、原理：将含有各种微生物的土壤悬液稀释后涂布接种到选择培养基平板上，在不同条件下培养，从而使各类微生物在各自的培养基上形成单菌落（由一个细

胞繁殖而成的集合体，即是一个纯培养体）。

（一）土壤稀释分离法分离纯化细菌、放线菌、霉菌

1、取土壤表层以下5-10cm，放入无菌袋备用

2、无菌操作制备土壤稀释液

（1）制备土壤悬液：称土样5g，迅速倒入含有99mL无菌水的三角瓶中，震荡5-10min，加玻璃珠，使土样充分打散，即成为10^-2土壤悬液

（2）稀释：用无菌移液管吸10^-2土壤悬液1mL，吹入9mL无菌水中即为10^-3稀释液，如此重复制备10^-3--10^-8稀释液。注意操作时管尖不能接触到液面，每一个稀释度换用一只移液管，每次吸入土液后要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。

3、涂布法测定菌落数的方法

（1）倒平板：操作在酒精灯火焰旁，左手拿住培养皿打开一条缝隙，右手拿三角瓶并将培养基迅速倒入培养皿（铺满皿底1/3），加盖轻摇

（2）涂布法（无菌操作）：将200μL菌悬液滴在平板表面中央位置，右手拿无菌涂布器先沿一条直线轻轻来回推动，再沿另一垂直线来回推动。

（3）接种量和培养基：

霉菌----- 取10^-2、10P^-3两管稀释液各0.2mL，分别接入两个土豆蔗糖培养基平板中（每100mL培养基+灭菌的乳酸1mL），涂布均匀。

放线菌--10^-4、10P^-5 两管稀释液（每管中加入10%酚液5~6滴，摇匀，静置片刻）各0.2mL，分别接入两个高氏1号培养基平板，涂布均匀。

细菌------10^-6、10P^-7 牛肉膏蛋白胨琼脂平板

细菌1~2d 快

4、培养将接种好的平板倒置，于28-30℃恒温培养霉菌3~5d 中

放线菌5~7d 慢

（二）划线分离法（目的：获得单个菌落）

连续划线：挑取菌种在平板上划“之”字形

划线方法

分区划线：分区域划线

注意事项：

细菌10^7个细菌>放线菌>霉菌

1、1g土壤中含霉菌10^5个而酵母菌主要见于果园和菜园土壤中

放线菌10^6个故土壤分离细菌时要取较高的稀释度，否

则菌落连成一片不能计数。

2、土壤稀释分离操作中，每稀释10倍最好更换一次移液管，使计数准确。

3、放线菌培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。

菌落的读数方法：计算相同稀释度的平均菌落数，选择平均菌落数在30~300之间的进行计数

总菌数/5g=同一稀释度几次重复的菌落平均数X稀释倍数（10^-2即为10^2）1、为什么高氏1号培养基和土豆蔗糖固体培养基中要分别加入酚和乳酸？

酚：显色乳酸：抑制细菌生长

2、划线分离时为什么每次都要将接种环上剩余物烧掉？

其目的是要获得单独生长的菌落,接种环上多余菌体、划线时重叠都可能使菌落长成片,所以应该避免.