生命体中的超氧化物歧化酶_综述_

4
心超滤浓缩 H 冷冻干燥得淡蓝色成品。 从 一 些 植 物 和 微 生 物 中 提 取 )*% 可 使 用 >?;@;A?8 法，它的特点是采用经典的硫酸铵分级沉 淀 提 取 粗 酶 ， 它 可 避 免 ’77/89 4 :8;9/<;7= 法 使 ’I 4 )*% 失活的缺点。亲和层析法和高压液相色 谱法 （ $P25）均具有提纯步骤少，专一性好，自 动化和纯化率高等特点，但所需试剂和仪器较复 杂昂贵，目前多在科研中使用。利用生物技术生 产 )*% 在 国 外 引 起 重 视 ， 是 一 个 很 有 前 途 的 方 向。日本选用耐草快 （ G+ G 4 二甲基 4 CQC 4 双吡啶 姆，简称 PR）除草剂的烟草愈伤组织为材料生产 )*%，在叶绿素中光系统 S 产生的电子使 PR 还原 成 PR 游离基，后者与 *, 直接反应产生 *, 4 ，故可 制备 PR 的愈伤组织并诱导产生 )*%。来自 PR 愈 伤组织的 )*% 为单一电泳区带，分子量为 , T G+ 万，与一般烟叶相比，活性高很多。 C+ )*% 的活力测定 据报道 H )*% 活性在糖尿病 H 慢性肾功能不全 与正常者间有显著差异 H 吸烟者红细胞 )*% 和精浆 )*% 含量均较非吸烟者低 H 而这与不育可能有关 U 在 )*% 的分离纯化过程中 H 活力监测也至关重要 H 可见适宜的 )*% 活力测定方法的研究具有重要的 现实意义。 脉冲辐射分析法，快速冷冻法结合的 L)V 分 析法，截流光谱分析法，极谱氧电极法和极谱法 可直接获得 )*% 与 *, 4 反应的动力学信息，测定 反应过程中 *, 4 浓度的变化，因而称之为直接法。 因受试剂和仪器的限制，此类方法一般难于在实 验室推广。 )*% 活性测定的另一大类方法是间接法。由 于 )*% 的作用底物是 *, 4 ，它的存在寿命很短， 而上述直接法又不能得到普遍推广，因此一般常 用间接的活力测定方法。其原理是：有一产生 *, 4 的系统，使 *, 4 再产生一个便于检测的反应，通过 监测 )*% 对这个反应的抑制程度间接测定 )*% 活 力。此类方法有经典的邻苯三酚自氧化法，改良 的邻苯三酚自氧化法，四氮唑蓝法，肾上腺素自 氧 化 法 H 联 二 茴 香 胺 法 以 及 黄 嘌 呤 氧 化 酶 4 W(& 法，碱性二甲基亚砜 4 鲁米诺法，化学发光免疫 法 （ 52S6）等。 )*% 活性测定方法已较成熟，近年来国内外 仍有一些报道和专利。杜鸣等 B ! D 合成了 C 种硫代碳 酰胺化合物，这些化合物具有试剂稳定，与 *, 4 反
药用酶。 ’E2+ 年 F?GG 和 H7;D;G 首次从牛红细胞中分 离出 一种 蓝色 的含 铜蛋 白质 ! K7=9C5687;G " 3 ’E(E
I’J
年 ， FCC98< 和 L8;<9M;CN I - J 因 其能 催化 超氧 阴 离子 （ /- * ）的歧化反应而将其命名为超氧化物歧化酶 （ ./0），并阐明了超氧阴离子自由基的生物学意 义，自此有关 ./0 的研究受到国内外学者的广泛 关注，涉及到化学、生物、医药、日用化工、食 品诸领域。在 ./0 的制备、结构功能研究及抗衰 老、抗辐射、抗炎和抗癌及其作用机理、吸收机 理研究方面已取得很大进展。 ’B ./0 的来源、分布及种类 ./0 是一类广泛存于生物界的金属酶类，是 生物体防御活性氧毒害的关键性防线。 H77D7 等推 测，在所有需氧细胞包括最简单的微生物体内都 可能含 ./0。 ’E)2 年， O7DD 发现厌氧菌硫酸还原 菌中有 ./0 活力，以后在多种专性厌氧菌中发现 有 ./0 活力存在，只是活力很低，不易检测。侯 金泉等考察发现蚯蚓、葡萄、大蒜及一些保健饮 料 中 富 含 ./0。 迄 今 为 止 ， 人 们 已 从 细 菌 、 真 菌、原生植物、藻类、昆虫、植物、两栖动物和哺 乳动物中分离提纯得 ./0，其中 ./0 含量最丰富的 是动物的肝脏组织，动物的血液中也富含 ./0。微 生物中 ./0 含量与该菌的需氧程度和耐氧能力有很 大关系，一般菌体耐氧能力强，其 ./0 含量就高，
作者单位 1 中国科技大学食品科学与工程系 -,,- * ,+ * -+ 收稿 3 -,,- * ’, * ’’ 修回
合肥
-2,,$-
盛良全， 副教授， 硕士生导师， 博士。
安徽卫生职业技术学院学报
#$$# 年第 % 卷第 # 期
・!"・
抑制，而受 &# ’# 和 ()( 的抑制。 #* % #* %* % (’) 的结构 +,-.(’) 的结构
个亚基的分子量约为 #@;)，含 $* 0 C %* $ 个 M. 和 N> 原子。它们在空间结构上与 +,(’) 不同，含有 较高程度的 " C 螺旋，而 ! C 折叠较少。电子密度 分辩图显示 M.(’) 和 N>(’) 的每个亚基包含两个 结构域，一个结构域由三个 " C 螺旋组成，另一个
・!"・
%"/0 年 123456789. 得到了 +,-.(’) 的三维结 构，是由两个基本上相似的亚基组成的二聚体， 每个亚基的分子量为 %:;)，含有一个铜原子和一 个锌原子。两个相同亚基之间通过非共价键的疏 水 相 互 作 用 而 缔 合 ， 类 似 于 圆 筒 的 端 面 。 %"<# 获 得 了 牛 红 细 胞 +,-.(’) 的 $* #.B 分辨率电子密度图，显示出亚基的结构核 心是一个由八股反平行的 ! 折叠围成的圆筒状结
*
故真核微生物的 ./0 含量高于原核生物，好氧微生 物显著高于厌氧化生物。 根据 ./0 所含金属辅基的不同，一般可将其 分为 A5PG./0、 FG./0、 L7./0 三种类型。 A5PGQ ./0 是真核生物酶，主要存在于真核细胞的细胞 质和叶绿体的基质中，动物血肝、奶、植物叶、 果等均含 A5PG./0。一般来说， FG./0 和 L7./0 是原核生物酶， FG./0 主要存在于原核细胞、真 核细胞以线粒体的基质中； L7./0 主要存在于原 核细胞及少数植物中。 L7./0 和 FG./0 出现在生命进化的早期，而 A5PG./0 是 在 以 后 的 发 展 中 单 独 进 化 而 成 的 。 ’EE( 年 有 研 究 报 道 发 现 了 一 种 新 型 ./0 即 R;./0，此外，在牛肝中还存在一种 A9PG./0。一 般来说， ./0 是细胞内酶， ’EE- 年，在人的血清 里分离到一种独特的具有 ./0 活性的因子，简称 @A * ./0，即胞外 ./0，这种 ./0 在多种哺乳动 物的体内也发现。 -B ./0 的结构和性质 经过长期的科学研究和探索，科学家们已从 动植物和微生物等几十种不同种属中分离提纯得 到 ./0，其中阐明氨基酸顺序的有十几种。通过 对已完成氨基酸序列分析结果的比较，发现不同 来源的 ./0 在氨基酸序列上有高度的同一性，显 示出进化上明显的保守性，而这种保守性，又充 分反应出 ./0 在生物体内的重要性。其中 L7./0 和 FG./0 性质相似，它们与 A5PG./0 在蛋白质 一级结构，空间结构，分子量，光谱性质及不同 制剂的敏感性等方面差别较大。 A5PG./0 呈蓝绿 色，分子中的铜为二价，有顺磁性，紫外、可见 特征吸收峰在 -$+G=、(+,G=。 A5PG * ./0 活力受 HAR、 K- /- 抑制。 FG * ./0 呈紫红色，特征吸收 峰 在 -+,G=、 %)$G=， 活 力 不 受 HAR、 K- /- 的 抑 制，受氯仿 * 乙醇溶液、 .0. 抑制。 L7./0 呈褐 色，特征吸收峰在 -+,G=、2$,G=，活力不受 HAR
?@A
年 ， =52.>6 等
构，称之为 ! 桶 （ ! C D566>E），整个结构含 " 螺 旋较少。从牛红细胞 +,-.(’) 的氨基酸序列看， 每个铜原子分别与 ! 个组氨基酸残基 （ &28!!* !:* :%* %%< ） 配位， -. 则与 @ 个组氨酸残基 （ &28:%* :"* /< ）和一 个天冬氨酸 （ ) <% ）配位。 +,、 -. 共同连接组氨酸 咪唑桥”结构，天冬氨酸 %## 与组氨酸 :% 组成 “ :" 和组氨酸 !! 之间形成氢键，由此构成了 +,、 -. 之间的第二座桥。这两座桥在酶的催化过程中 对酶的结构起着重要的作用。半胱氨酸 + 00 和 + !! 的 C (& 基 构 成 唯 一 的 一 对 键 内 二 硫 键 ， 对 维 持 +,-.(’) 的稳定性也起着重要作用。 15B5. 光谱测定牛血 +,-.(’) 的二级结构表 明 @* $F " 螺旋 G !%* 0F 的 ! C 结构及 0%* "F 的无 序结构 G 与 H C 射线晶体结构分析和傅立叶红外光 谱得出的结论十分相近。与 +,-.(’) 的二级结构 相比较，其金属取代衍生物 +,I2(’) 的 ! C 结构 含量相对减少而无序结构含量增加。用光谱法测 定 +,I2(’) 活 性 为 +,-.(’) 的 !$F ， 这 说 明 (’) 的活性随 ! C 结构的减少，无序结构的增加而 降低，这是由于在 (’) 中，其每个亚基的活性中 心均是 ! C 折叠相互环绕而形成的一个长而深的活 性通道，铜和锌位于其中，锌起稳定结构的作 用，而铜主要起催化作用。 ! C 折叠的减少，可能 改变了活性中心的结构，尤其是 +, J KK L 周围固有 的配位环境，因而使酶活性降低。 #* %* # M.(’) 和 N>(’) 的结构 M.(’) 和 N>(’) 一般为二聚体或四聚体，每
医学基础与药学研究
白质；溶液的 #$ 大于蛋白质的等电点时，阳离子 表面活性剂 （ 如 %&’(）可沉淀蛋白质。多元醇和 糖类一直用来作为保护生物大分子活性的稳定 剂，在 )*% 中加入不同浓度的海藻糖溶液均可提 高酶活力，以 "+ ,-./0 1 2 海藻糖溶液保护作用最 明显，随着时间的延长，海藻糖使 )*% 的稳定性 增加，保护作用更明显。 ,+ ,+ 3 )*% 的作用底物和作用机理 )*% 的作用底物是生物体内产生的超氧阴离 子自由基 （ *, ），作用机理是：