(完整版)海藻酸钠固定酵母细胞实验资料

海藻酸钠固定酵母细胞实验资料

1实验原理

海藻酸钠是应用最广泛的水溶性海藻酸盐。海藻酸钠遇到钙离子可迅速发生离子交换，生成凝胶。利用这种性质，将海藻酸钠溶液滴入含有钙离子的水溶液中可产生海藻酸钙胶球。本实验便是将酵母细胞与海藻酸钠溶液混匀后，通过注射器或相似的滴注器将上述混合液滴入CaCl2溶液中，Ca2+从外部扩散进入海藻酸钠与细胞混合液珠内，使海藻酸钠转变为不溶于水的海藻酸钙凝胶，由此将酵母细胞包埋在其中。

2实验操作过程中的几个注意点

2．1控制好配制海藻酸钠溶液的火候、浓度，实验成败的关键步骤配置海藻酸钠溶液。加热使海藻酸钠溶化是操作中重要的一环，涉及到实验的成败。教材提示是要用小火或者间断加热，反复几次，直到完全熔化。在实验操作中，教师要提醒学生按照教材的提示进行，不然会发生焦糊现象。笔者多次实际操作发现酒精灯上隔石棉网加热，匀速搅拌基本不会发生焦糊现象，而且需要时间略长，为节省时间可选用电炉加热，加快熔化，但一定要间断加热，可以用试管夹移动烧杯。完全熔化的海藻酸钠成半透明状，最好要无颗粒无气泡，类似于平常家庭中冲调好食用的藕粉。海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响后续实验效果。教材提示是0.7 g海藻酸钠，加入10 mL蒸馏水，边加热边搅拌，直至完全熔化，用蒸馏水定容至10 mL。实际操作中，很多学生忘记定容，也有教师认为不需要定容。其实在加热搅拌的过程中，蒸馏水会蒸发，加热时间越长失去的蒸馏水越多,所以加热熔化结束后一定要定容，不然浓度肯定偏大，影响后续步骤中凝胶珠的形状。

2.2控制海藻酸钠溶液与酵母细胞混合时的温度，保证酵母细胞的活性海藻酸钠溶液与酵母细胞混合，一定要将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至40℃以下，通常让学生自己用手感觉烧杯壁，感觉不到烫手就差不多。再加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀。如果不等海藻酸钠溶液冷却就混合酵母细胞，大多数酵母细胞会被烫死，这样制作的凝胶珠用来发酵，葡萄糖发酵液几乎无酒味。

2.3通过调节海藻酸钠与酵母细胞混合液浓度，从而不出现蝌蚪状凝胶珠海藻酸钠与酵母细胞混合好之后，转移至注射器中，以恒定的速度缓慢将注射器中的溶液滴加到配置好的CaCl2溶液中，形成凝胶珠。此步骤在实际操作中要做得好是有困难的,从注射器中流出的混合液不是一滴一滴的，在CaCl2溶液中就会形成蝌蚪状凝胶,甚至形成面条状。究其原因是混合液浓度过大导致，符合要求的混合液浓度不能大不能小，成流体状态，在注射器里如果要用力挤才能流出，混合液浓度肯定偏大。按照教材中的数据学生最后得到的混合液浓度都略偏大，可在混合液中滴加少量蒸馏水稀释。加多少蒸馏水才能使浓度适宜？除了观察混合液的质态，笔者觉得可以做预实验，这样指导学生的效果很好。具体是不把海藻酸钠与酵母细胞混合液全部转移到注射器中，而是用玻璃棒挑或倒少量（约0.5 mL）送到注射器的前端，滴加到CaCl2溶液中，观察形成的凝胶珠形状，如果有长尾巴或成面条状就是浓度太大，这时可在混合液中加蒸馏水搅拌均匀，然后再挑少量送到注射器的前端，滴加到CaCl2 溶液中，会发现尾巴明显变短，如仍有小尾巴或成长椭圆形，继续在混合液中加蒸馏水，直至形成的凝胶珠成圆形，再将所有混合液转移至注射器中。这一过程要注意蒸馏水千万不能加过，每次滴加量以5滴为好。另外注射器不要垂直向下，要有一定的角度，注射器距离CaCl2溶液也要保持一定的距离，30 cm左右，有利于凝胶珠成圆形。

2.4做到溶液无气泡，从而不出现漂浮在CaCl2溶液上的凝胶珠在学生制作的凝胶珠中也经常出现有漂浮在CaCl2溶液上的，原因是这些凝胶珠中含有大气泡，重量轻。这样的凝胶

珠也不符合要求。要没有气泡，需要注意的是在溶化海藻酸钠和配制海藻酸钠与酵母细胞混合液的时候，搅拌要匀速和轻柔。如果出现气泡，用玻璃棒搅破。还有在将混合液转移至注射器之后，要将注射器内的空气排空，再进行滴加。

2.5要将凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30 min左右，使其固化成型注射器中的混合液滴加到CaCl2溶液中之后，要将这些凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30 min左右，以使Ca2+从外部扩散进入海藻酸钠与细胞混合液珠内，使海藻酸钠转变为水不溶的海藻酸钙凝胶，即凝胶珠固化成型。不然凝胶珠容易破裂，不符合要求，在后面用于发酵过程中，凝胶珠就会散开，失去包埋的作用。

2.6用固定化酵母细胞（凝胶珠）发酵葡萄糖溶液的控制将固定好酵母细胞的凝胶珠用蒸馏水冲洗2～3次，加入质量分数为10％的葡萄糖溶液中，检验能否进行酒精发酵。这里要注意葡萄糖浓度不能过大，过大了酵母菌会脱水死亡。酒精发酵是酵母菌无氧呼吸，所以容器一定要密封，教材中使用200 mL锥形瓶，是非常适合学生实验的，使用橡皮塞密封方便，观察现象也方便。但教材图4－13所给的锥形瓶未密封，对学生有一定的误导。置于18～25℃的环境中，24 h后让学生观察葡萄糖溶液中有气泡生成，3～5 d后打开瓶塞可闻到明显酒味，也可让学生运用学过的方法（重铬酸钾）检测酒精。发酵的时间与温度有关，温度低时间要长些。

3实验结果的评价

一个实验是否取得成功，要看实验结果是什么，如何评价这个实验结果。本实验可以从以下4个方面对实验结果进行评价。

3.1检验制作的凝胶珠的质量是否合格检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。

3.2观察制作的凝胶珠的颜色和形状正确制作的凝胶珠颜色在米白到米黄色之间,形状圆球形，干燥之后颜色加深，形状也会略有皱缩。如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败。

3.3观察发酵的葡萄糖溶液利用固定的酵母细胞发酵葡萄糖溶液产生酒精,可以看到凝胶珠周围产生很多气泡,同时打开瓶塞会闻到酒味,也可进行酒精检验和含量测定。如果没有或很少的气泡和酒味,则说明包埋的酵母细胞数目很少,或者已经死亡。

3.4教师不仅要对学生制作的固定化酵母细胞（凝胶珠）进行评价，还要对学生的操作过程进行评价。此外，对酵母细胞固定化原理和实验操作方法的理解，也应是评价的有机组成部分。