构建shRNA干扰稳定细胞系ppt课件
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瞬时转染检测干扰效果
将shRNA干扰质粒瞬时转染，提取mRNA做半定量PCR，或者提取蛋白做western检测干扰 效果。如下图，sh1和sh2有效果，sh3没有效果。
NC Mock sh1 sh2 sh3
XRN1
ACTB
来自百度文库
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构建shRNA稳定表达细胞系
将pRNAT-U6-shRNA质粒用BglII酶切线性化（必须的，可以 增加整合效率），回收，转染进10cm培养皿的细胞，转染后 48小时加G418筛选。不同细胞对G418敏感情况不一样，之前 需要做好浓度测试（Hela细胞对应的G418浓度）大概是 500ug/ml-1000ug/ml。一开始细胞会大量死去，10cm皿传 6cm，6cm皿传3.5cm皿（细胞太稀不利于生长）。之后细胞 会增长，3.5cm皿传6cm皿，6cm皿传10cm皿。当90%以上 的细胞都有荧光之后，这个稳定细胞系差不多就成功了。然后 做一下实时定量PCR或者western检测一下干扰效果，就可以 用于更进一步实验了。 注：不要纠结于挑细胞单克隆，一是挑单克隆太复杂，二是没 有必要。
2
使用BLOCK-iT™ RNAi Designer设计siRNA序列
综合Rank、 Tushcl规则，选 择3条左右进行 实验验证， siRNA不是 100%有效果的。
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pRNAT-U6.1/Neo质粒
pRNAT-U6.1/Neo is designed for mammalian transfection. It carries a Neomycin resistance gene as the selectable marker, which can be used for establishing stable cell line. The GFP marker (coral GFP, cGFP) under CMV promoter control can be used to track the transfection efficiency. It uses U6 promoter for siRNA expression.
GATCCAGATGAACTTACCGTAGAATTCAAGAGATTCTACGGTAAGTTCATCTTTTTTTA
AGCTTAAAAAAAGATGAACTTACCGTAGAATCTCTTGAATTCTACGGTAAGTTCATCTG
Terminator TTTTTT AAAAAA
A^AGCTT TTCGA^A
Target Sequence:sense
Hairpin Target Sequence：antisense
AGATGAACTTACCGTAGAA
TTCAAGAGA TTCTACGGTAAGTTCATCT（反向互补）
TCTACTTGAATGGCATCTT（互补） AAGTTCTCT AAGATGCCATTCAAGTAGA（反向）
索取质粒，请联系，QQ：676743449）
4
根据siRNA序列设计shRNA合成片段
右图是pSUPER质粒的设计图，与 pRNAT-U6.1/Neo区别不大。
序列转换工具（反向、互补、反向互 补）：
XRN1
shXRN1-S shXRN1-AS
BamHI 5--3 G^GATCC 3--5 CCTAG^G
shXRN1-S、shXRN1-AS（59nt）送到DNA合成公司按照合成引物的方式合成
5
质粒构建
1、将合成的两条链稀释成10uM，各取10ul，退火（95度5分钟，缓慢降至室温，可以 用PCR仪做）； 2、用BamHI和HindIII将pRNAT-U6.1/Neo质粒切开（质粒不需要很多，但务必切干 净），回收； 3、连接（2ul载体、1ul酶、4ul 5Xbuffer、13ul片段）、转化； 4、挑单克隆，摇菌，提质粒，酶切（BamHI/HindIII)验证（质粒多切一点，如果切出 60bp左右的带是阳性克隆）； 5、送测序。
构建shRNA干扰稳定细胞系
设计siRNA序列 根据siRNA序列设计shRNA片段 构建shRNA 瞬时转染检测干扰效果 构建稳定细胞系
创造价值，追求卓越
BioChen出品
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使用BLOCK-iT™ RNAi Designer设计siRNA序列
选择设计siRNA，而 不是shRNA； 输入基因的登录号或 者序列； 使用默认参数或者按 需修改参数。
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瞬时转染检测干扰效果
将shRNA干扰质粒瞬时转染，提取mRNA做半定量PCR，或者提取蛋白做western检测干扰 效果。如下图，sh1和sh2有效果，sh3没有效果。
NC Mock sh1 sh2 sh3
XRN1
ACTB
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构建shRNA稳定表达细胞系
将pRNAT-U6-shRNA质粒用BglII酶切线性化（必须的，可以 增加整合效率），回收，转染进10cm培养皿的细胞，转染后 48小时加G418筛选。不同细胞对G418敏感情况不一样，之前 需要做好浓度测试（Hela细胞对应的G418浓度）大概是 500ug/ml-1000ug/ml。一开始细胞会大量死去，10cm皿传 6cm，6cm皿传3.5cm皿（细胞太稀不利于生长）。之后细胞 会增长，3.5cm皿传6cm皿，6cm皿传10cm皿。当90%以上 的细胞都有荧光之后，这个稳定细胞系差不多就成功了。然后 做一下实时定量PCR或者western检测一下干扰效果，就可以 用于更进一步实验了。 注：不要纠结于挑细胞单克隆，一是挑单克隆太复杂，二是没 有必要。
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使用BLOCK-iT™ RNAi Designer设计siRNA序列
综合Rank、 Tushcl规则，选 择3条左右进行 实验验证， siRNA不是 100%有效果的。
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pRNAT-U6.1/Neo质粒
pRNAT-U6.1/Neo is designed for mammalian transfection. It carries a Neomycin resistance gene as the selectable marker, which can be used for establishing stable cell line. The GFP marker (coral GFP, cGFP) under CMV promoter control can be used to track the transfection efficiency. It uses U6 promoter for siRNA expression.
GATCCAGATGAACTTACCGTAGAATTCAAGAGATTCTACGGTAAGTTCATCTTTTTTTA
AGCTTAAAAAAAGATGAACTTACCGTAGAATCTCTTGAATTCTACGGTAAGTTCATCTG
Terminator TTTTTT AAAAAA
A^AGCTT TTCGA^A
Target Sequence:sense
Hairpin Target Sequence：antisense
AGATGAACTTACCGTAGAA
TTCAAGAGA TTCTACGGTAAGTTCATCT（反向互补）
TCTACTTGAATGGCATCTT（互补） AAGTTCTCT AAGATGCCATTCAAGTAGA（反向）
索取质粒，请联系，QQ：676743449）
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根据siRNA序列设计shRNA合成片段
右图是pSUPER质粒的设计图，与 pRNAT-U6.1/Neo区别不大。
序列转换工具（反向、互补、反向互 补）：
XRN1
shXRN1-S shXRN1-AS
BamHI 5--3 G^GATCC 3--5 CCTAG^G
shXRN1-S、shXRN1-AS（59nt）送到DNA合成公司按照合成引物的方式合成
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质粒构建
1、将合成的两条链稀释成10uM，各取10ul，退火（95度5分钟，缓慢降至室温，可以 用PCR仪做）； 2、用BamHI和HindIII将pRNAT-U6.1/Neo质粒切开（质粒不需要很多，但务必切干 净），回收； 3、连接（2ul载体、1ul酶、4ul 5Xbuffer、13ul片段）、转化； 4、挑单克隆，摇菌，提质粒，酶切（BamHI/HindIII)验证（质粒多切一点，如果切出 60bp左右的带是阳性克隆）； 5、送测序。
构建shRNA干扰稳定细胞系
设计siRNA序列 根据siRNA序列设计shRNA片段 构建shRNA 瞬时转染检测干扰效果 构建稳定细胞系
创造价值，追求卓越
BioChen出品
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使用BLOCK-iT™ RNAi Designer设计siRNA序列
选择设计siRNA，而 不是shRNA； 输入基因的登录号或 者序列； 使用默认参数或者按 需修改参数。