第五章 细菌检验技术
细菌—细菌的鉴定(水产微生物课件)
任务五 细菌的鉴定
一、细菌的鉴定 （三）细菌鉴定的主要方法 2. 分子分类法 （1）氨基酸顺序和蛋白质分析 （2）DNA碱基序列 （3）核酸杂交
任务五 细菌的鉴定
一、细菌的鉴定 （三）细菌鉴定的主要方法 3. 血清学试验和噬菌体分型 （1）血清学试验：生物体外进行不同细菌之间抗原与抗体反应试验，主要适用于抗原结构同源程度 高的细菌种内以及个别属内血清型的分类鉴定。 （2）噬菌体分型：噬菌体对宿主的感染和裂解作用常具有高度的特异性。
任务五 细菌的鉴定
二、细菌的分类与命名 （二）细菌的命名 采用生物学双命名法，用属名（在前，第一个字母大写）和种名（在后，小写）进行命名。如结核 分枝杆菌的学名是Mycobacterium tuberculosis
作业
1. 名词解释：荚膜，芽孢，菌落，纯培养，培养基。 2. 细菌的基本结构和特殊结构有哪些？ 3. 按照培养基的物理状态，培养基分为哪几种类型？ 4. 试述细菌各个生长时期的特点。 5. 培养基制备的原则。
任务五 细菌的鉴定
一、细菌的鉴定 （一）鉴定的依据
1. 形态特征 2. 生理生化特征 3. 血清学反应 4. 遗传学特征
任务五 细菌的鉴定
一、细菌的鉴定 （二）细菌的鉴定步骤
1. 获得该菌种的纯培养物 2. 查找权威的鉴定手册 目前国际上公认和普遍采用的细菌分类系统是《伯杰氏细菌学鉴定手册》1923年出版，至1994 年经过几次修订，已经出版了第九版。详细列出了细菌生态学、增值、分离培养和保藏等方法。
细菌检验的基本技术
目录一. 细菌检验的基本技术1.1无菌技术1.2细菌形态学检查方法1.3培养基1.4消毒灭菌二.日常检验工作涉及的项目2.1菌落总数2.2大肠菌群2.3金黄色葡萄球菌2.4沙门氏菌2.5大肠埃希氏菌2.6志贺氏菌三.生物安全基本知识3.1生物安全柜的使用3.2移液管和移液辅助器的使用3.3废弃物处理3.4感染性物质防护技术3.5微生物实验室容器破碎及感染性物质溢出的应急处理一. 细菌检验的基本技术1.1 无菌技术无菌：指物体上不存在活菌。
无菌操作：防止微生物进入机体或其他物品的操作技术。
微生物检验样品的全部过程必须保证无菌操作，必须严格执行无菌操作技术，防止污染和病原菌的扩散。
在进行无菌操作时应注意以下要点：1.1.1进行接种、倾注琼脂平板等均须在无菌室或超净工作台内进行。
以防杂菌污染。
1.1.2无菌室在使用前，用紫外灯照射30min至1h或用5%石炭酸或5%来苏喷雾消毒。
1.1.3所用的物品均应在使用前严格进行灭菌，在使用过程中不得与未经灭菌的物品接触，如不慎碰着应立即更换无菌物品。
1.1.4 、所有的技术操作要按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行。
1.1.5 接种环（针）在每次使用前后，应在火焰上彻底烧灼灭菌。
1.1.6 应采用机械移液器。
禁止用口移液，注射器不能用于吸取液体。
1.1.7从培养瓶或试管培养物中取标本或移种时，在打开瓶塞后及塞回前，管（瓶）口部应通过火焰1～2次，以杀死可能附着管口或瓶口的细菌。
开塞后的管口或瓶口应尽量靠近火焰，试管及烧瓶应尽量平放，切忌口部向上和长时间暴露于空气中。
1.2细菌形态学检查方法细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一。
它可用于细菌的分类与鉴定，并为进一步作生化反应、血清学鉴定提供依据。
在我们检验中经常会遇到对所要鉴别的细菌进行染色。
细菌染色的基本程序是：涂片（干燥）→固定→染色（媒染）→（脱色）→（复染）常用的细菌染色法：单染色法复染色法：1．革兰染色法是细菌学中最经典、最常用的染色法之一。
细菌检验技术ppt课件
+ 原理：某些细菌能力利用培养基中的枸橼酸盐 作为唯一的碳源，也能利用其中的铵盐 作为唯 一氮源，细菌生长过程中分解枸橼酸盐产生碳 酸盐和分解铵盐生成的氨，使培养基变碱，是 指示剂呈碱性反应。
+ 培养基：枸盐酸盐培养基（淡绿色）
+ 试剂：溴麝香草酚蓝（pH6.0以下呈黄色， pH7.6以上呈蓝色）
3、玻璃器材的清洗
★新购置的玻璃器材：1％～2％盐酸浸泡－→清水 清洗
★用过的无污染器皿：洗涤剂洗刷－→清水清洗 细菌污染的器材：消毒灭菌后再洗刷
★盛培养基试管和平皿：高压灭菌－→趁热倒出－ →洗涤剂洗刷－→清水冲洗
★吸管：3％来苏浸泡－→清水冲洗 ★玻片和盖玻片：3％来苏和清洁液浸泡－→清水
冲洗；染色后的玻片，应肥皂水煮沸10min再洗 涤
★含油脂的器皿：单独灭菌
（四）培养箱
1、电热恒温培养箱 2、二氧化碳培养箱 3、厌氧培养箱
（五）培养基 培养基：是指人工配制的适合细菌生长繁殖 的综合营养基质。 1、培养基的成分及作用
+ 营养物质：肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血 液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐
+水 + 凝固剂：琼脂、明胶 + 抑制剂 + 指示剂
调配 溶化 矫正pH 过滤澄清 分装 灭菌
培养基灭菌
★ 基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15分钟 ★ 含糖培养基：113 ℃灭菌15分钟 ★ 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次 ★ 不耐高温的液体成分：滤过除菌
检定
保存
二、细菌接种与培养技术 （一）无菌技术 1、细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台
+ 糖发酵试验 + 葡萄糖氧化／发酵试验（O/F试验） + 甲基红试验 + V-P试验 + 七叶苷水解试验 + Β－半乳糖苷渗透酶试验
细菌—细菌检查技术(动物微生物课件)
革兰阴性菌
革兰阳性菌
革兰阳性菌
革兰阴性菌
菌体
水滴
涂 片
载玻片
使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜
（2）干燥： 将涂片置于室温下自然干燥；若天气较冷时，可将标本面朝上，在离
酒精灯火焰较远处（温度以不烫手为宜）烘干。 注意：切勿紧靠火焰，温度过高会改变甚至破坏细菌细胞形态。 （3）火焰固定 将已干燥的抹片涂面向上，以钟摆速度通过酒精灯火焰2-3次。待涂片冷却 后进行染色。 细菌抹片火焰固定目的：杀死细菌，染料能着色；细胞壁通透性增加，便 于着色；菌附着于玻片，不被洗掉。
四、结果
油镜下可见： 葡萄球菌菌体呈蓝紫色，葡萄状排列，为革兰氏阳性菌（G+）； 大肠杆菌菌体呈红色，单个散在，为革兰阴性菌（G-）。
葡萄球菌
大肠杆菌
五、革兰氏染色注意事项
选用培养18--24h菌龄的细菌为宜。 革兰氏染色注意载玻片要洁净，滴无菌水和取菌不宜过多，涂片要均匀、
薄，不宜过厚。 火焰固定时不宜过热，否则会改变甚至破坏细胞形态。 水洗时不要直接冲洗涂面，而应使水流从载玻片的一端流下；冲洗时水流
思考题
1.你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键 的环节是什么？ 2.你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。 3.进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细 菌染色会出现什么问题？
细菌标本片的制备及革兰氏染色
革兰氏染色法由丹麦病理学家Christain Gram于1884 年创立，是细菌学中很重要的鉴别染色法。
细菌检验技术
结果
第三节 细菌生化鉴定技术
一、碳水化合物的代谢试验
2、 O/F试验
原理：根据细菌在分解葡萄糖的代 谢过程中对氧分子需求的不同，将 细菌分为氧化、发酵和产碱型三类
第五章 细菌检验技术
本章内容
1 第一节 细菌形态检验技术 2 第二节 细菌接种与培养技术 3 第三节 细菌生化鉴定技术 4 第四节 微生物检验的自动化与微型化 5 第五节 细菌的其他鉴定技术
本章内容
学习目标： 掌握：革兰染色的原理、操作及结果判断；细菌接种技 术、培养 方法、细菌在不同培养基中的生长现象、生化反应的原理。 熟悉：细菌染色标本检查的基本程序，细菌培养常用培养基和器材。 了解：细菌不染色标本的检查方法和用途；免疫学技术、分子生物 学技术及自动化检测技术等鉴定微生物。
方法：将待检菌种接种于葡萄糖蛋 白胨水中,35℃培养18~24小时后,往 培养基中加入甲基红指示剂少许,观 察结果。
结果
第三节 细菌生化鉴定技术
4、V-P试验
原理：细菌分解葡萄 糖产生丙酮酸，丙酮 酸脱羧生成乙酰甲基 甲醇，在碱性环境中， 乙酰甲基甲醇被氧化 为二乙酰，二乙酰与 胍基化合物结合，生 成红色化合物，是为 V-P试验阳性。
第三节 细菌生化鉴定技术
二、蛋白质和氨基酸的代谢
3、尿素酶试验
原理：细菌产生脲 酶，水解尿素生成 氨和二氧化碳，培 养基呈碱性反应
方法：将待检菌 接种于尿素培养 基中，35℃培养 18～24h取出观察。
-
+
结果
第三节 细菌生化鉴定技术
细菌学检验基本技术
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18
大肠杆菌革兰染色阴性
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19
金黄色葡萄球菌革兰染色阳性
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20
变形杆菌周身鞭毛
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21
绿脓杆菌单鞭毛
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22
肺炎链球菌荚膜
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23
钩端螺旋体
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霍乱弧菌
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破伤风芽胞杆菌
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第三节 细菌的分离培养方法
所谓细菌的分离培养就是提供某细菌生长所需的各种条 件（营养、温度、湿度、酸碱度和气体），将其从微生 物混合物中培养出来的方法。
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7
三、化妆品细菌学检验样本
（一）采样数量 每批两个大包装抽取4个包装，10g或10ml （二）样本的处理 1. 液体样品：10倍稀释，油性物用液体石蜡、土温-80 2. 膏霜乳剂样品：亲水性-玻璃珠，疏水性-先行乳化 3. 固体样品的处理：均质后取上清液 （三）样品送检原则及注意事项 1. 维持样品污染原状（出厂污染状态） 2. 去除残留防腐剂及抑菌剂（吐温-80和卵磷脂 ） 3. 注意事项（室温存放，多项目时先做微生物）
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五、消毒及卫生用品
（二）一次性使用的卫生用品 同一批号3个运输包装中至少随机抽取12个最小包装
量；1/4用于检测、1/4用于留样、2/4就地封存准备复 测。
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11
六、空气样本
平板沉降法和采样器采集法 （一）空气微生物采样器分类 按照采样方式的不同可分为两类(Ⅰ和Ⅱ类)，Ⅰ类是将
氧培养箱法 ，气体喷射培养法（或称转管法））
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35
四、细菌的生长现象
细菌学检验基本技术课件
液体培养法等。
倾注法是将样品与液体培养
04
基混合，然后倒入培养皿中，
使细菌在培养基上生长繁殖。
液体培养法是将样品与液体
06
培养基混合，然后在液体培
养基中培养细菌。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ菌培养技术
01
02 培养基的选择：根据细菌种类和生长
培养温度和时间：根据细菌种类和生
需求选择合适的培养基
长需求选择合适的培养温度和时间
C
代谢组学：研究细菌的代 谢途径和调控机制
D
系统生物学：研究细菌的 生物学系统及其相互作用
谢谢
03
04 培养方法：采用平板培养、液体培养、
细菌鉴定：通过观察细菌形态、生长
半固体培养等方法
特性、生化反应等方法进行细菌鉴定
细菌鉴定技术
01
形态学鉴定：通过显微镜观察 细菌的形态、大小、颜色等特 征进行鉴定
03
血清学鉴定：利用细菌的抗原 与抗体反应进行鉴定
05
生物信息学鉴定：利用生物信 息学方法，如基因序列比对、 系统发育分析等，进行鉴定
3
细菌学检验在医学、食品、环境等 领域具有广泛的应用
4
细菌学检验可以帮助诊断疾病、评 估食品安全、监测环境污染等
细菌学检验的重要性
01
细菌学检验是医学检 验的重要组成部分， 对疾病的诊断、治疗 和预防具有重要意义。
04
细菌学检验可以指导 抗生素的合理使用， 减少抗生素滥用和耐
药菌株的产生。
02
细菌学检验可以帮助 医生确定病原体，为 治疗提供依据。
快速检测技术的发展
01
免疫学检测：利用抗体和抗原
的特异性结合，快速检测细菌
(医学检验技术专业)微生物学检验教学
《微生物学检验》教学大纲课程代码：00031025课程名称：微生物学检验课程总学时：136学时（其中理论68学时，实验68学时）课程类别：必修课课程性质：专业课面向专业：医学检验技术专业开设单位：基础教学部病原生物与免疫学教研室一、课程的性质、地位和任务《微生物学检验》是医学检验技术专业的一门专业课程。
本课程总论部分主要介绍微生物学及微生物学检验的基本知识，各论部分主要介绍常见病原微生物的生物学特性，包括形态染色特征、培养特性、生化反应特点、抗原性和分类，致病性和免疫性，微生物学检验的标本采集要求与方法、检验鉴定程序、具体的鉴定方法及鉴定要点和报告方式。
通过实验课程的学习，巩固和加强对微生物学及微生物学检验理论知识的认识和理解，提高学生的实际操作能力，培养学生创新思维和实事求是的科学态度。
二、课程教学目标（一）理论、知识方面1.明确微生物学检验的研究内容，学习微生物学检验的目的，认识医学微生物分类的意义及各类医学微生物的主要特性。
2.掌握医学微生物的主要生物学性状、遗传与变异机理、理化因素及生物因素对医学微生物的影响。
3.熟悉病原微生物的主要传播途径、致病性及免疫性。
学会对各类病原性微生物感染的常用实验室诊断方法。
4.明确病原微生物感染的特异性防治和药物治疗原则。
5.掌握常见的微生物所致疾病的临床症状和诊断指标6.了解对各类病原微生物的防治原则。
（二）能力、技能方面1.熟练掌握显微镜的使用和保养。
2.正确阐述常见的病原微生物的生物学性状，致病物质，主要传播途径及引起疾病的类型。
3.掌握常见的病原微生物感染的诊断方法。
4.将理论知识与具体的实验操作相结合，熟练掌握各种基本的医学微生物学诊断方法的机理，熟练各种基本实验的操作。
5.能运用学到的微生物学及微生物学检验专业知识，对各类临床标本进行病原微生物学的鉴定，及时地发出规范、准确的鉴定报告。
三、课程教学内容和要求第一篇微生物学检验基础绪论（1学时）1.教学内容及基本要求【教学内容】（1）微生物与微生物学（2）医学微生物学发展简史（3）微生物学及微生物学检验【基本要求】：掌握:微生物的定义与特点;微生物的分类。
细菌检验技术PPT课件
维持实验室温度在20-25℃，湿度在 50%-70%，以保证实验结果的稳定性。
设备配置
根据实验需求，配置相应的仪器和设 备，如显微镜、培养箱、灭菌器等， 确保其性能良好、准确可靠。
实验操作规范与注意事项
实验前准备
实验前确保实验材料。
实验操作流程
细菌免疫学检测技术是利用抗原-抗体反应的特异性进行细菌检测和鉴定的方法 。该方法具有较高的灵敏度和特异性，常用于临床诊断和流行病学调查等领域。 常见的免疫学检测技术包括凝集试验、沉淀试验和酶联免疫吸附试验等。
细菌核酸检测技术
总结词
通过检测细菌的核酸序列，进行快速、准确的细菌鉴定。
详细描述
随着分子生物学技术的发展，细菌核酸检测技术已成为一种快速、准确的细菌鉴定方法。该方法通过 检测细菌的核酸序列，利用基因测序或实时荧光定量PCR等技术，可以快速地鉴定出细菌的种类和耐 药基因等。常见的核酸检测技术包括16S rRNA测序和多重PCR等。
酶联免疫吸附试验
发展新型酶标记抗体和抗原，提高检测特异性和 灵敏度。
个性化诊疗与精准医疗的结合
耐药性检测
通过对细菌耐药基因的检测，为临床提供精准的抗生素选择依据， 降低耐药性的产生。
病原体分型
通过对病原体基因型别的检测，为临床提供个性化的诊疗方案，提 高治疗效果。
个体化免疫治疗
利用个体化免疫治疗策略，针对不同病原体感染制定个性化的免疫 治疗方案，提高治疗效果和病患生存率。
01
辅助以对症治疗，如止咳、化痰 、平喘等。
02
加强患者护理，提高免疫力，预 防并发症。
案例二：食品安全检测中的细菌检验技术应用
食品安全检测的重要 性
提高食品行业的信誉， 促进国际贸易。
细菌鉴定及检测方法
细菌鉴定及检测方法
1、首先要获取被鉴菌种的纯培养菌落；
2、其次利用革兰染色或者抗酸染色确定其染色；
3、根据形态及其排列，按照科、属、类次序继续鉴定；
4、最后利用知识、经验等方法做出判断，得出结果，给出鉴定。
细菌鉴定方法：
1、生化鉴定：为细菌鉴定中最重要的一种鉴定手段，主要借助细菌对营养物质分解能力的不同及其代谢产物的差异对致病菌进行鉴定，生化鉴定包括蛋白质分解产物实验、酶触实验、堂分解产物实验等等方法。
2、血清鉴定：一般用于含有较多血清型的细菌，常用玻片凝集试验，也可以用免疫荧光法、协同凝集实验、间接血凝试验等方法灵敏的检测样本中致病菌的特异性抗原。
用已知的抗体检测未知待检测的细菌，或者采用已知抗原检测患者血清中的抗细菌抗体的效价，特异性比较高，一般在生化鉴定基础之上给出确定诊断结果。
3、分子生物学检测：一般适用于人工培养基无法生长或者生长速度过于缓慢以及营养要求高不容易培养的细菌，检测方法含有核酸杂交、生物芯片以及基因测序等等；其中核酸杂交包括斑点杂交等等技术。
4、微生物自动鉴定系统鉴定
5、质谱技术：利用新兴的电力生物质谱对细菌核酸、蛋白质、堕胎等物质进行质谱分析。
细菌检验技术—细菌的其他鉴定技术(微生物检验课件)
二、核酸杂交(Hybridization)
定义
两条来源不同，但具有互补序列的 核酸，按碱基配对原则复性形成一个杂 交体，这个过程即杂交，或称分子杂交。
分类
DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA
鉴定细菌的其它试验
1.杆菌肽试验
❖ 原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全敏感，而其他链球菌则耐药。 ❖ 培养基：BAP ❖ 方法：同纸片法药敏0.04U/片 ❖ 结果：＞10mm敏感；＜10mm耐药 ❖ 意义：A群链球菌敏感
2. O/129试验
❖ 原理： O/129（二氨基喋啶）对弧菌属有抑制作用，而对 气单胞菌属无抑制作用
某些细菌在代谢过程中能产生溶血素，可使人或动 物的红细胞发生溶解，不同的细菌有不同的溶血反 应，借此可鉴别细菌。
（1） α（甲型）溶血: 菌落周围出现较窄的半透明的 草绿色溶血环。
（2） β （乙型）溶血: 菌落周围出现较宽的透明溶血 环。
（3）γ（-丙型）溶血: 菌落周围无溶血环。
甲型（α-）溶血
意义：肺炎链球菌阳性
7.氢氧化钾拉丝试验
❖ (1)原理：G-细菌的细胞壁在稀碱溶液中易于破裂，释放 出未断裂的DNA螺旋，菌悬液呈现粘性，可用接种环搅拌 后拉出粘丝来.
❖ (2)方法：取1滴40g/L氢氧化钾水溶液（应新鲜配制）于 洁净玻片上，取新鲜菌落少许与其搅拌混匀，观察能否拉 出粘丝。
❖ (3)结果：拉出粘丝者为阳性。
三、生物芯片Βιβλιοθήκη 术❖ 生物芯片（biochip）的概念 指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大 分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物 样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排 列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通 过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效 地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。
第5章细菌形态学检查
从细胞质的基础颗粒长出，伸到细胞外面的细长呈波状弯曲的丝状物。 功能：鞭毛运动可鉴定、与致病性有关、具有抗原性（H抗原）
菌发出比鞭毛更更细、短、直、硬和多的丝状蛋白附属 物，与运动无关，菌毛中空，可分为普通菌毛和性菌毛 功能：普通菌毛附黏膜，性菌毛传递遗传物质
荚膜
细菌细胞壁外包绕的一层粘液性物质，厚度≥0.2μm边界 明显者称为荚膜，厚度＜0.2μm者称为微荚膜 功能：荚膜护菌强致病---抗吞噬作用、抗有害物质损伤、 抗干燥作用、黏附作用
医学微生物学实验室规则：
学生进微生物实验室必须穿好工作服，离室需脱下 反折，要经常清洗消毒； 进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律 存放指定的储物柜内； 严禁在实验室进食、饮水和抽烟； 手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒 液泡手； 实验过程中避免一切不良的个人习惯；操作中产生 的垃圾不得随意抛掷，要扔在指定的桶内
（二）细菌涂片标本的制备
1.涂片
④再次灭菌试管口，棉塞略加烧灼放回原处。 ⑤将接种环上之菌涂于载玻片的NS上，制成的菌膜直
径约1cm左右均匀薄层。
⑥接种环用火焰烧灼灭菌放回原处。
注：取菌量不应过多，以免造成菌体重叠。
（二）细菌涂片标本的制备
2.干燥
①室温中自然干燥。
②加速干燥，将标本离火焰半尺高处略烘。
[实验内容]
一、光学显微镜油镜的使用和保护法
二、细菌的革兰染色检查法
三、细菌基本形态和特殊结构的观察
实验一 细菌的形态学检查
[目的要求]
1.掌握显微镜油镜的使用和保护。
2.掌握细菌的基本形态和特殊结构。
3.掌握细菌涂片标本的制备及革兰染色的步骤，
判断革兰染色性及明确其临床意义。
细菌的一般检验方法
细菌的一般检验方法
其次是显微镜观察，通过显微镜观察样本中的微生物形态特征，如细胞形状、大小、排列方式等，可以初步判断细菌的种类。
生化试验是另一种常用的细菌检验方法，通过检测细菌代谢产
物的生化反应，如呼吸、发酵、氧化等，来鉴定细菌种类。
此外，分子生物学方法也被广泛应用于细菌检验中，包括PCR （聚合酶链式反应）、DNA测序等技术，可以对细菌进行快速准确
的鉴定和分类。
除了以上方法，还有一些特殊的检验方法，如抗生素敏感性试验、免疫学检测等，用于评估细菌对抗生素的敏感性和进行免疫学
诊断。
总的来说，细菌的一般检验方法涵盖了培养、显微镜观察、生
化试验和分子生物学方法等多种技术手段，通过综合运用这些方法
可以对细菌进行准确的鉴定和分析。
细菌鉴定方法
一淀粉水解试验（一）实验原理细菌对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶将大分子物质分解。
胞外酶能分泌扩散到细胞外，将物质分解成小单位如糖、氨基酸、甘油与脂肪酸。
这些小单位的物质能被细菌吸收和利用。
水解过程可通过底物的变化来证明，如细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色；水解明胶可观察到明胶被液化；脂肪水解后产生脂肪酸改变培养基的pH，其中的中性红指示剂使培养基从淡红色变为深红色。
（二）实验方法将淀粉培养基溶化后，冷至45℃左右，以无菌操作制成平板。
取18-24h的纯培养物点于平板上，每皿可点种3-5个菌株，适温培养2-4d，形成菌落后，在平板上滴加卢戈氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板成蓝色。
如果菌落周围有无色透明圈出现，说明淀粉已经被水解，实验为阳性，否则为阴性。
透明圈的大小一般说明水解淀粉的能力。
（三）实验试剂的配制肉汤蛋白胨琼脂成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH7.2。
淀粉培养基制法：在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2％的可溶性淀粉，校正pH 值至7.6，分装三角瓶，121℃20min灭菌备用。
卢戈氏(Lugol)碘液：碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，混匀，定容。
二糖发酵试验(一)实验原理单糖发酵是将葡萄糖，乳糖或麦芽糖等分别加入蛋白胨水培养基内，使其最终浓度为0.75-1％。
并加入一定量酚红指示剂及小倒管，制成单糖发酵管，接种细菌经37℃培养18-24小时，若能分解糖产酸则酚红指示剂由红变黄，若能分解甲酸有CO2和H2等气体形成，小倒管内则聚集有气泡；不分解，则指示剂不变色。
(二)实验材料1．菌种：大肠杆菌，伤寒杆菌18-24小时琼脂斜面培养物。
2．培养基：葡萄糖发酵管，乳糖发酵管等。
(三)实验方法1．将伤寒杆菌，大肠杆菌按照液体接种方法分别接种于葡萄糖及乳糖发酵管内。
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第一节 细菌形态检验技术 第二节 细菌接种与培养技术
第三节 细菌生化鉴定技术 第四节 微生物检验的自动化与微型化 第五节 细菌的其他鉴定技术
学习目标： 掌握：革兰染色的原理、操作及结果判断；细菌接种技 术 、培养方法、细菌在不同培养基中的生长现象、生化反应 的原理。 熟悉：细菌染色标本检查的基本程序，细菌培养常用培养基 和器材。 了解：细菌不染色标本的检查方法和用途；免疫学技术、分 子生物学技术及自动化检测技术等鉴定微生物。
（三）其他染色法 1. 特殊结构染色法 （3）芽孢染色法
（三）其他染色法 1. 特殊结构染色法 （4）异染颗粒染色法
Albert染色 奈瑟染色
（三）其他染色法 1. 负染色法
墨汁荚膜染色（脑脊液中的新型隐球菌，×400）
第一节 细菌形态检验技术
二、不染色标本镜检 1. 压滴法
压滴法镜 检结果： 尿涂片， ×400
★ 基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15分钟 ★ 含糖培养基：113
℃灭菌15分钟
★ 含鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次
★ 不耐高温的液体成分：滤过除菌
二、细菌接种与培养技术
（一）无菌技术 细菌检验的操作应在无菌室或生物安全柜内进行 无菌室、生物安全柜使用前后均需进行消毒灭菌 细菌检验使用过的物品使用前后需严格灭菌处理 标本的采集严格无菌操作 无菌试管、烧瓶的使用时注意管口灭菌
本章重点：★革兰染色的原理、操作方法及意义
★细菌培养及生长现象 ★细菌生化反应及临床应用
第一节 细菌形态检验技术
一、染色标本镜检 （一）染色标本检查的一般程序
（二）常用的染色方法 1. 单染色法
细菌标本经涂片、干燥固定后，滴
加染液染色1分钟，水洗后待玻片燥 后即可镜检
（二）常用的染色方法 2. 革兰染色法 【方法】
3、甲基红试验
原理：细菌发酵葡萄糖，产 生丙酮酸，进一步分解生成 大量混合酸，使培养pH下降 至4.4以下，加入甲基红后， 呈现红色反应。为甲基红试 验阳性。 方法：将待检菌种接种于葡 萄糖蛋白胨水中,35℃培养 18~24小时后,往培养基中加 入甲基红指示剂少许,观察结 果。
主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌
一、碳水化合物的代谢试验
1、糖（醇、苷）类发酵试验
原理：多糖→单糖→丙酮酸 →酸性产物(或产气) →pH↓ →呈酸性变色(或出 现气泡) 方法： 将待检细菌以无菌操 作接种到糖发酵管中，置 35℃温箱培养18～24h，观察 结果。
结 果
一、碳水化合物的代谢试验
2、 O/F试验
原理：根据细菌在分解 葡萄糖的代谢过程中对 氧分子需求的不同，将 细菌分为氧化、发酵和 产碱型三类 方法：取2支HL葡萄糖培 养管煮沸驱氧，冷却后接 种细菌。将其中一管敞开， 另一管用液体石蜡封管， 培养18 ～ 24h观察结果
（二）细菌接种与分离技术
灭菌接种环（针）—冷却—挑取标本（细菌）—接 种—灭菌接种环（针）
平板划线法
分区划线
连续划线
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
连续划线法
斜面接种
半固体穿刺接种
液体接种
（三）细菌培养方法
• 一般培养（需氧培养）：培养需氧或兼性厌氧菌 培养温度：35℃ ～ 37 ℃ 培养时间：18～24小时
• 二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱 • 厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养 法、硫乙醇现象
细菌在液体培养基中生长现 细菌在半固体培养基中的现象 象
菌 膜
对 照 沉 淀 浑 浊
在穿剌线上生长 沿穿剌线扩散生长
第三节 细菌生化鉴定技术
（二）常用的染色方法 2. 革兰染色法 【结果】
紫色——革兰阳性菌（×1000）
红色——革兰阴性菌（×1000）
（二）常用的染色方法 3. 抗酸染色法 【结果】
抗酸染色结果（×1000）：红色为 抗酸杆菌，蓝色为非抗酸杆菌
（三）其他染色法 1. 特殊结构染色法 （1）荚膜染色法
（三）其他染色法 1. 特殊结构染色法 （2）鞭毛染色法
4、V-P试验
原理：细菌分解葡 萄糖产生丙酮酸， 丙酮酸脱羧生成乙 酰甲基甲醇，在碱 性环境中，乙酰甲 基甲醇被氧化为二 乙酰，二乙酰与胍 基化合物结合，生 成红色化合物，是 为V-P试验阳性。 方法：把待检细菌接种在葡萄糖蛋 白胨水中，35℃培养18~24h后，按 每毫升培养液加入0.1ml含2％肌酸 或肌酐的40％KOH溶液,数分钟或数 小时后观察结果。
培养基
液 体 培 养 基
培养基的种类（按物理性状分类） 液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯 种细菌。 半固体培养基：含0.2％～0.5％琼脂，用于观察 细菌的动力。 固体培养基：含2％～3％琼脂，用于细菌的分 离培养。
培养基制备程序 调配—溶化—调Ph—过滤澄清—分装—灭菌—检定 —保存 培养基灭菌
二、不染色标本镜检 2. 悬滴法
三、其他显微镜检查
第二节 细菌接种与培养技术
红 外 接 种 灭 菌 器
一、基本条件
一、基本条件 生物安全柜
培养箱
培养基成份 • 培养基：人工配制的适合细菌生长繁殖的综合 营养基质。 • 营养物质：牛肉膏、蛋白胨、肉浸液、糖醇类 、血液、鸡蛋及动物血清、生长因子、无机盐 等 • 水 • 凝固剂：琼脂、明胶 • 抑制剂：孔雀绿、煌绿、胆盐、抗生素等 • 指示剂：溴麝香草酚蓝，溴甲酚紫、酚红等
空白对照
阴性
结果
阳性
5、 β-半乳糖苷酶试验（ONPG）
原理：有的细 菌可产生β-半 乳糖苷酶，能 分解邻硝基酚 β-D半乳糖苷 (ONPG)而生 成黄色的邻硝 基苯酚，该试 验也称为 ONPG试验。 方法：将被检制成 菌悬液，加入1滴 甲苯充分振摇， 37℃水浴5 分钟， 使酶释放，然后再 加入0.25ml ONPG， 混匀后，置于37℃ 水浴中温育，菌悬 液呈黄色为阳性反 应。
培养基种类（按用途分） 基础培养基：普通琼脂平板 营养培养基：满足营养需求较高细菌的生长，如血 琼脂平板、巧克力琼脂平板等 鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌 ，如克氏双糖铁培养基（KIA）及各种生化反应用 培养基 选择培养基：具有选择性抑制非目的菌生长作用， 用于选择性培养目的菌，如SS平板、中国蓝琼脂 平板、伊红美蓝琼脂平板等 增菌培养基：用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉 汤、GN增菌肉汤 特殊培养基：厌氧培养基、L型细菌培养基