第七章免疫技术ppt课件
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免疫学课件——第七章 血清学反应
免疫学原理与技术
5.血清学反应的影响因素 电解质:抗原与抗体的反应需要在适当浓 度的电解质参与下,才出现可见反应.血清学反 应一般用生理盐水作稀释液,但禽类血清需用 8-10%的高渗氯化钠溶液. 温度:通常用370C水浴中,有的补体结合反 应在冰箱低温结合效果更好. pH:血清学反应常用的pH为6-8,过高或过 低的pH可使抗原抗体复合物重新解离.如pH 降至抗原或抗体的等电点时,可引起非特异性 的酸凝集,造成假象.
免疫学原理与技术
2.结合力和离解力 抗原和抗体的结合为弱能量的非共价键结 合,是分子表面的结合,这一过程受物理化学,热 力学的法则所制约,结合的温度应在0-400C范 围内,pH在4-9范围内,如温度超过600C或pH降 到3以下时,则抗原抗体复合物又可重新解离. 3.抗原抗体的结合比例 抗原与抗体的结合常需要适当的比例才出 现可见的反应,在最适比例时,反应最明显. 带现象:如抗原过多或抗体过多,则抗原抗 体的结合不能形成大的复合物,抑制可见反应 的出现. “格子学说”
免疫学原理与技术
三.血清学反应的应用 1.抗原或抗体的快速检测 2.生物活性物质的超微量测定 3.抗原或抗体在细胞和亚细胞水平的定位 4.抗原组成的分析 5.微生物鉴定和抗原分型 6.血型鉴定
免疫学原理与技术
四.血清学试验的发展趋向 技术上要求高特异性,高敏感性,高分辨率, 精密定位,简易快速;在方法上要求微量化,自动 化,标准化;试剂上要求商品化.
免疫学原理与技术
二.血清学反应的一般特点 1.特异性和交叉性 如肠炎沙门氏菌与鼠伤寒沙门氏菌 Ab1 Ag1
Ab2 Ag2 交叉反应是区分血清型和亚型的重要依据 关系数R R=√r1 *r2 x 100%
免疫学原理与技术
第七章-免疫细胞课件
B1为非特异免疫细胞 B2为特异免疫细胞 —— Ag
B2细胞（CD5-）受外来抗原刺激，经活化，克隆扩增，发生体细胞突变，产生高亲和性特异性抗体。 而CD5+B1细胞对外原抗原只产生有限的应答，主要对一些自己抗原产生应答，其应答特征是不依赖T细胞的，其产生的抗体也无亲和性成熟。故CD5+B细胞产生的抗体为低亲和性和多反应性的IgM型自身抗体，及一些天然抗体。
T细胞亚群的分类：
根据TCRαβT细胞的功能可将其分为二类： 一类为调节性T细胞 辅助性T细胞 (helper T lymphocyte, TH) 抑制性T细胞 (suppressor T lymphocyte, TS) 另一类为效应性T细胞 杀伤性T细胞 (cytolytic T cell, CTL或Tc) 迟发型超敏T细胞 (delayed type hypersensitivity T lymphocyte, TDTH)
胸腺微环境
T细胞在胸腺的分化发育过程
三个阶段： 早期T发育为双阴性细胞阶段 其主要表型为CD4-和CD8-，故称为双阴性细胞（double negative, DN） 第二阶段为不成熟胸腺细胞 由DN细胞经单阳性细胞（CD4-，CD8+）进行分化为双阳性（CD4+，CD8+）细胞（double positive, DP）。 第三阶段为由DP细胞选择分化为只表达CD4+或CD8+的单阳细胞（single positive, SP），然后迁出胸腺，移居周围淋巴器官。
第七章 免疫细胞
第一节 造血干细胞
各种血细胞都起源于 共同的祖先细胞——造血干细胞
在人和动物周围血中，存在形态不同，功能各异的多种血细胞： 生命周期 红细胞 120天 粒细胞 20-60小时 血小板 5-10天 单核细胞 存在于骨髓 约为5天 存在周围血 可超过200天 淋巴细胞 数月至数年
B2细胞（CD5-）受外来抗原刺激，经活化，克隆扩增，发生体细胞突变，产生高亲和性特异性抗体。 而CD5+B1细胞对外原抗原只产生有限的应答，主要对一些自己抗原产生应答，其应答特征是不依赖T细胞的，其产生的抗体也无亲和性成熟。故CD5+B细胞产生的抗体为低亲和性和多反应性的IgM型自身抗体，及一些天然抗体。
T细胞亚群的分类：
根据TCRαβT细胞的功能可将其分为二类： 一类为调节性T细胞 辅助性T细胞 (helper T lymphocyte, TH) 抑制性T细胞 (suppressor T lymphocyte, TS) 另一类为效应性T细胞 杀伤性T细胞 (cytolytic T cell, CTL或Tc) 迟发型超敏T细胞 (delayed type hypersensitivity T lymphocyte, TDTH)
胸腺微环境
T细胞在胸腺的分化发育过程
三个阶段： 早期T发育为双阴性细胞阶段 其主要表型为CD4-和CD8-，故称为双阴性细胞（double negative, DN） 第二阶段为不成熟胸腺细胞 由DN细胞经单阳性细胞（CD4-，CD8+）进行分化为双阳性（CD4+，CD8+）细胞（double positive, DP）。 第三阶段为由DP细胞选择分化为只表达CD4+或CD8+的单阳细胞（single positive, SP），然后迁出胸腺，移居周围淋巴器官。
第七章 免疫细胞
第一节 造血干细胞
各种血细胞都起源于 共同的祖先细胞——造血干细胞
在人和动物周围血中，存在形态不同，功能各异的多种血细胞： 生命周期 红细胞 120天 粒细胞 20-60小时 血小板 5-10天 单核细胞 存在于骨髓 约为5天 存在周围血 可超过200天 淋巴细胞 数月至数年
免疫学技术ppt课件
和分布情况.阳性细胞以拟标记的细胞为前提,
阳性表达必须在细胞特定的抗原部位,若不在
抗原所在部位的阳性表达和非目标细胞即使
阳性也不应作为判断依据.根据抗原在细胞中
分布和阳性颗粒沉淀部位可分5种类型：
-
19
⑴ 胞膜型 阳性颗粒主要分布于细胞膜表 面,形成一薄层棕黄色颗粒包绕整个细胞.此类 型常见于某些膜抗原,如上皮膜抗原（EMA） 、白细胞共同抗原（LCA）及B细胞、T细胞 、粒细胞相关抗原（GAA）
13
ELISA试验用耗材、试剂及仪器
耗材:移液器、吸头、酶标板、滤纸 试剂:酶标抗体、抗体稀释液、封闭液、底物
溶液、终止液 仪器:酶标仪
-
14
ELISA结果分析
1.根据标准品的含量及检测OD值结果,应用线
性回归方程进行统计分析,可求得待测样品
的定量值
2.上机前将标准品的数量及含量按要求在酶
标仪上进 行设置,机器自动计算打印出标准
c.加入可能含特异性抗原的待检液
d.温育后清洗
e.加入酶标记特异性抗体
f.温育后清洗
g.加入酶作用底物
h.测定颜色反应深浅
-
8
竞争法
a、将已知抗体吸附于载体上 b、温育后清洗 c、加入可能含特异性抗原的待检
液和酶标记的已知抗原液 d、温育后清洗 e、加入酶作用底物 f、测定颜色反应深浅
-
9
生物素-亲和素系统
-
4
Ⅰ.ELISA Ⅱ.免疫组化 Ⅲ.荧光抗体标记 Ⅳ.荧光原位杂交（FISH） Ⅴ.分光光度法
-
5
Ⅰ.酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）
免疫技术的原理与进展PPT课件
免疫记忆与疫苗
免疫记忆是指免疫系统对曾经接触过的抗原产生记忆，当再次接触该抗原时，能 够快速启动再次免疫应答过程。记忆T和记忆B细胞在体内长期存活，当再次接触 相同抗原时，能够迅速增殖分化为效应细胞，启动更强烈的免疫应答。
疫苗是一种经过人工处理的减毒或灭活的病原体或其成分，用于刺激机体产生特 异性免疫应答，从而达到预防疾病的目的。疫苗的接种能够使机体快速启动免疫 应答过程，产生足够的抗体来中和病原体，阻止其黏附和增殖，从而预防疾病的 发生。
针对不同年龄段和不同人群，新型疫苗的接种策略也得到 了优化，例如采用联合疫苗接种和个性化接种等策略，提 高了疫苗的接种率和保护效果。
免疫疗法在癌症治疗中的应用
01
免疫检查点抑制剂
通过抑制免疫检查点，如CTLA-4和PD-1等，激活T细胞对肿瘤的免疫
反应，从而达到治疗癌症的目的。
02
肿瘤疫苗
利用肿瘤抗原制备的疫苗，通过激发机体免疫系统对肿瘤的免疫反应，
02
免疫技术的原理
免疫系统的组成与功能
免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成，具 有防御、自稳和监视功能，是人体抵御病原微生物入
侵和清除体内异常细胞的关键防线。
输标02入题
免疫器官包括胸腺、骨髓、淋巴结、脾脏等，是免疫 细胞产生、分化、成熟和存储的场所。
01
03
免疫分子包括抗体、补体、细胞因子等，它们参与免 疫应答和炎症反应，发挥调节和杀伤作用。
THANKS感谢观看02非特异性免疫由屏障结构、吞噬细胞 和自然杀伤细胞等组成，具有直接或 间接杀灭病原微生物的作用。特异性 免疫分为体液免疫和细胞免疫两种类 型，体液免疫主要由B细胞介导，通 过产生抗体来消灭病原体；细胞免疫 主要由T细胞介导，通过激活靶细胞 来杀伤病原体。
第七章免疫组织化学技术【实用资料】
（immunofluorescence cytochemistry）
免疫组化
原位杂交技术
膀胱癌和癌旁组织上用ADAM12 T3 反义探针检测到阳性杂交信号(C,D)， 而正义探针在癌旁的正常组织中只见 到很弱或阴性信号(E,F)。D和F分别是 C和D的黑视野图像。
定量免疫 组化技术
免疫组织化学技术基本流程
（protein A immunocytochemistry） （7）生物素-亲合素系统介导的免疫组织化学方法
（biotin-avidin system cytochemistry）
3．按应用方式不同分类
（1）免疫电镜组化技术 （immunoelectromicroscopy cytochemistry）
固定剂选择
• 血涂片：丙酮，福尔马林（胞质蛋白，BCR） • 细胞涂片：95%乙醇、carbowax. • 冰冻切片：乙醇、丙酮、多聚甲醛 • 石蜡切片：福尔马林（需抗原修复）、氯化汞（胞浆蛋白）
PLP/PLDP（糖类、脂类）、乙醇、丙酮
固定方法
• 浸泡法 • 蒸汽法 • 注射、灌注法 • 微波固定
• 注意事项： • 自然冷却、避免蒸干、条件统一，结构改
变，适当加入螯合剂
免疫组织化学技术基本流程
一、样品的制备 二、抗原抗体反应 三、化学呈色反应 四、免疫组织化学结果及其分析
染色策略
ABC PROCEDURE UTILIZING CATALYZED SIGNAL AMPLIFICATION (CSA)
组织细胞的固定
（Fixation）
➢ 要求：
➢ 完整性、天然性、抗原性、便于后期操作
➢ 策略：
➢ 快速脱水、阻断酶活、保持抗原性
《免疫》PPT课件
免疫
课程导入
在你的左臂外侧，你很可能会发现一个微小 的疤痕，这是接种预防肺结核的卡介苗所留下的 印记，称为卡疤。我国规定，新生儿在满足条件 的情况下，需在出生24小时后尽快注射卡介苗。 世界卫生组织也明确建议，没有感染艾滋病病毒 的新生儿或儿童需尽快接种卡介苗。
天花---印第安人灭绝的元凶
18世纪中叶，琴纳出身于英国的一个牧师 家庭。他发现，牧场挤牛奶的女工经常接触患 牛痘的母牛，在感染牛痘后，再也不会感染天 花。他从中得到启发，经过20多年的研究后， 终于在1796年5月的一天早晨，开始了征服天花 的实践：他用清洁的刀片在一个名叫杰米的8岁男孩的胳膊上划了几下，在切口 处涂上牛痘浆液，从此杰米再不会感染天花了。事实证明，这是一种预防感染天 花的有效办法。预防天花的疫苗从此诞生了。
免疫系统
免疫器官 免疫细胞
吞噬细胞 淋巴细胞
（1）免疫器官
它们能促进免疫细胞发 挥免疫功能。
扁桃体 胸腺
脾
淋巴结
（2）免疫细胞主要是淋巴细胞
某种病原体 抗原
刺激
淋巴 细胞
产生
相应的特殊蛋白质 抗体
抗体： 由淋巴细胞产生的抵抗病原体的特殊蛋白质 抗原： 引起人体产生抗体的物质，如：病原体等
琴纳与天花病毒的故事 1 感染牛痘后，再也不会感染天花 2 预防天花疫苗的诞生
1. 第一道防线
病 原 体 皮 肤
（1）皮肤具有保护作用，能阻挡病原体入侵
（2）呼吸道黏膜上纤毛的清扫作用
第一道防线组成： 皮肤和粘膜 功能： 阻挡或杀死病原体，清扫异物。
当人体虚弱，免疫力下降时，或人体皮肤受伤的时候，病菌 会侵入人体。
2. 第二道防线 毛 细 血 管
吞噬细胞（白细 胞的一种）
课程导入
在你的左臂外侧，你很可能会发现一个微小 的疤痕，这是接种预防肺结核的卡介苗所留下的 印记，称为卡疤。我国规定，新生儿在满足条件 的情况下，需在出生24小时后尽快注射卡介苗。 世界卫生组织也明确建议，没有感染艾滋病病毒 的新生儿或儿童需尽快接种卡介苗。
天花---印第安人灭绝的元凶
18世纪中叶，琴纳出身于英国的一个牧师 家庭。他发现，牧场挤牛奶的女工经常接触患 牛痘的母牛，在感染牛痘后，再也不会感染天 花。他从中得到启发，经过20多年的研究后， 终于在1796年5月的一天早晨，开始了征服天花 的实践：他用清洁的刀片在一个名叫杰米的8岁男孩的胳膊上划了几下，在切口 处涂上牛痘浆液，从此杰米再不会感染天花了。事实证明，这是一种预防感染天 花的有效办法。预防天花的疫苗从此诞生了。
免疫系统
免疫器官 免疫细胞
吞噬细胞 淋巴细胞
（1）免疫器官
它们能促进免疫细胞发 挥免疫功能。
扁桃体 胸腺
脾
淋巴结
（2）免疫细胞主要是淋巴细胞
某种病原体 抗原
刺激
淋巴 细胞
产生
相应的特殊蛋白质 抗体
抗体： 由淋巴细胞产生的抵抗病原体的特殊蛋白质 抗原： 引起人体产生抗体的物质，如：病原体等
琴纳与天花病毒的故事 1 感染牛痘后，再也不会感染天花 2 预防天花疫苗的诞生
1. 第一道防线
病 原 体 皮 肤
（1）皮肤具有保护作用，能阻挡病原体入侵
（2）呼吸道黏膜上纤毛的清扫作用
第一道防线组成： 皮肤和粘膜 功能： 阻挡或杀死病原体，清扫异物。
当人体虚弱，免疫力下降时，或人体皮肤受伤的时候，病菌 会侵入人体。
2. 第二道防线 毛 细 血 管
吞噬细胞（白细 胞的一种）
免疫学技术及其应用45页PPT
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。—Байду номын сангаас苏联
免疫学技术及其应用
51、山气日夕佳，飞鸟相与还。 52、木欣欣以向荣，泉涓涓而始流。
53、富贵非吾愿，帝乡不可期。 54、雄发指危冠，猛气冲长缨。 55、土地平旷，屋舍俨然，有良田美 池桑竹 之属， 阡陌交 通，鸡 犬相闻 。
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。—Байду номын сангаас苏联
免疫学技术及其应用
51、山气日夕佳，飞鸟相与还。 52、木欣欣以向荣，泉涓涓而始流。
53、富贵非吾愿，帝乡不可期。 54、雄发指危冠，猛气冲长缨。 55、土地平旷，屋舍俨然，有良田美 池桑竹 之属， 阡陌交 通，鸡 犬相闻 。
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
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待检样品（细胞上清） 指示细胞（CTLL-2） 按不同稀 释度加入
37ºC，16-20小时 加入3HTdR（1-5Ci）
37ºC，4-6小时 收集细胞
测定
图白 细 胞 介 素
2 的 测 定 示 意
-
待检样品（细胞上清） 指示细胞（L929）
按不同稀 释度加入
干 扰
素
的
37ºC，4小时 弃取上清，加入VSV
(二)、制备单克隆抗体的方法
在免疫学实验中常需要取得纯化的特异性 抗体。单克隆抗体是利用细胞杂交技术形成 可分泌某种特异性抗体的肿瘤细胞，进行持 续传代而获得的特异性抗体。经典模式为通 过抗原免疫动物(通常为小鼠)获得有关B细胞 ，使其与同系骨髓瘤细胞融合，选择出能产 生针对该抗原的特异性抗体的稳定杂种瘤细 胞，既有可持续传代的肿瘤细胞特性又有可 分泌特异性抗体的特性．
测 定 示
37ºC，24-48小时
意
图Байду номын сангаас
观察细胞病变（镜检或比色）
待检样品（细胞上清） 指示细胞（L929）
肿
按不同稀 释度加入
瘤 坏
死
因
子
37ºC，24小时
的
弃取上清，洗涤
测
定
加入结晶紫染液，洗涤
示
意
图
加入细胞裂解液，比色
SmIg的荧光抗体检测法
SmIg的酶免疫检测法
染料
补体
补体依赖的细胞毒试验（CDC）
E-花环
花环形成细胞 B细胞
绵羊红细胞 T细胞
EA-花环
EAC-花环
常用的免疫细胞功能检测技术
一、转化、增殖试验
1、淋巴细胞转化试验 2、混合淋巴细胞培养
二、细胞毒检测
1、T细胞介导的细胞毒试验 2、NK活性测定 3、ADCC作用测定
细胞因子检测的特点
1、免疫原性较弱 2、样品含量低 3、样品具有时效性 4、生物效应特异性差
细胞因子检测的方法
1、免疫标记技术检测——抗原性测定 2、细胞生物学方法检测——生物活性测定 3、分子生物学技术检测——mRNA表达测定
细胞因子生物学方法检测的类型
一、细胞增殖试验 二、细胞病变保护试验 三、细胞毒试验 四、趋化试验
1
2
5 10 20 50 100
未标记抗原含量
ELISA
间接法
夹心法
竞争法
第三节 免疫细胞检测技术
1、细胞表面标志检测 2、细胞功能检测 3、细胞因子检测
常用的免疫细胞表面标志检测技术
一、免疫标记检测 1、荧光抗体法 2、酶免疫检测法 3、免疫金银染色法 二、补体依赖的细胞毒试验（CDC） 三、花环形成试验 1、E花环 2、EA花环 3、EAC花环
第二节 体外抗原抗体反应及其应用
1、体外抗原抗体反应 2、经典的血清学反应 3、免疫标记技术
抗原抗体结合物析出的原因
+++ ——+— —
+++———
———+++
——— ++—+ +
电解质
析出
抗原抗体反应的特点
1、特异性 2、适合比例性 3、可逆性
特异性
特异性反应
交叉反应
无反应
抗原A
抗原B
火箭电泳 对流电泳 免疫电泳
主要的免疫标记物
类别
标记物
荧光素
FITC、RB200、TRITC
镧系元素螯合物
放射性核素 3H、14C、32P、57Gr
125I、131I
酶
HRP、AP
化学发光物 Luminol、lucigenin 金属颗粒 胶体金、铁蛋白
用途 免疫组化 免疫分析测定 免疫分析测定
免疫组化 免疫分析测定 免疫分析测定 免疫组化 免疫分析测定
第一节 基本技术
(一)、分离纯化抗原或抗体的一般理化技术 １、沉淀法 常用有机溶剂沉淀法、盐析法，用于蛋白粗提。 2、过滤法 也称分子筛，一般用凝胶层析，为不完全筛。常用有葡聚糖、琼
脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。 3、离子交换色谱法 常用有离子交换纤维素、离子交换葡聚糖等。 4、亲合色谱法 常用有抗原或抗体交联葡聚糖、琼脂糖凝胶、戊二醛等。 5、电泳法 1) 区带电泳(Zone electrophoresis) 2) 免疫电泳 6、离心法
抗原C
适合比例性
抗体含量
抗原含量
前带
等价带
后带
抗体过剩
抗体抗体比例合适
抗原过剩
网格学说（lattice theory）
可逆性
K（亲和常数）=
Ag+Ab Ag Ab
抗原抗体反应的影响因素
1、电解质 2、酸碱度（pH值6-8） 3、温度（37-42。C）
经典血清学反应的种类
类型 凝集反应 沉淀反应 溶血（菌） 反应 补体结合 反应
淋
丝裂原（抗原）刺激
巴
细
胞
转
3H-TdR
化
试
验
原
理
示
放射性测定
意
细
胞
毒
靶细胞
效应细胞
试
验
原
分离上清
理
示
意
放射性测定
可检测的细胞因子
白细胞介素（Interleukin）—— IL-1、IL-2、…… IL-18 干扰素（Interferon）—— IFN-、IFN-、IFN- 肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor）—— TNF- 、 TNF- 集落刺激因子（Colony-stimulating factor）—— M-CSF、G-CSF 转化生长因子（Transforming growth factor）—— TGF- 趋化因子（Chemokine）—— IL-8、GROs、MCP-1 生长因子（Growth factor）—— EGF、FGF、IGF、PDGF
标记免疫技术的分类
一、按测定用途分类： 1、免疫组化技术 2、免疫测定技术 二、按标记物分类： 1、酶免疫技术 2、荧光免疫技术 3、放射免疫技术 4、发光免疫技术 5、金免疫技术
直接法 补体法
间接法 双标记法
结合相 游离相
结 合、40 游 离 相 30 放 射 性 20 含 量 比 10 值
抗原 颗粒性 可溶性 红细胞 G-细菌 固定补 体抗体
中和反应
外毒素 病毒
抗体 凝集素 沉淀素 溶血素 溶菌素
辅助物
补体 补体
敏感度（ g抗体氮） 0.01 5-10 0.001-0.3 （同上）
补体
SRBC 溶血素 抗毒素 靶细胞 中和抗体 靶细胞
0.1 0.01 （同上）
直接凝集反应
颗粒性抗原 凝集素
正向间接凝集反应
载体颗粒
可溶性抗原
反向间接凝集反应
载体颗粒
抗体
可溶性抗原
间接凝集抑制反应
待检样品
凝集
待检样品
凝集抑制
Coombs试验
抗人免疫球蛋白
液相内沉淀反应
絮状沉淀反应
环状沉淀反应
抗血清 抗原
+—
抗原 抗体
+—
免疫比浊
凝胶内沉淀反应
免疫扩散技术
免疫电泳技术
单向扩散试验 双向扩散试验