土壤浸提液中硝酸盐氮氧同位素组成的反硝化细菌法测定
土壤反硝化过程速率测定方法
土壤反硝化过程速率测定方法
土壤反硝化是一种重要的土壤生物过程，对于土壤氮素循环有着重要的影响。
因此，准确测定土壤反硝化过程速率非常重要。
本文介绍了几种测定土壤反硝化过程速率的方法。
1. 氮气法：将土壤样品与氮气混合，通过测量氮气中的N2O浓
度变化来确定反硝化速率。
这种方法被认为是一种准确且可靠的方法，但需要使用气体色谱仪等昂贵的设备。
2. 水草法：将土壤样品放置于水草中，通过测量水草中的氮含
量变化来确定反硝化速率。
这种方法简单易行，但需要较长的实验时间，且受到环境因素的影响较大。
3. 热水提取法：将土壤样品加热水浸泡，通过测定水中的硝酸
根离子浓度变化来确定反硝化速率。
这种方法简单易行，但需要较长的实验时间，且受到土壤水分等因素的影响较大。
4. 矿物质氮法：通过添加矿物质氮，观察反硝化速率的变化。
这种方法简单易行，但需要进行前期的校准实验。
总体来说，不同的测定方法有各自的优缺点，需要根据实际情况选择合适的方法。
同时，为了保证结果的准确性，需要注意实验操作过程中的细节问题。
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硝化强度和反硝化强度的测定方法
硝化强度和反硝化强度的测定方法
反硝化强度的测定
（1）接种：称取x ml活性污泥混合液，分别置于150 mL 三角瓶中，加入50 mL 含NO-3-N 的液体培养液，
（2）培养：
并用保鲜膜或橡皮塞密封，外套黑色塑料布，放置于恒温培养箱( 25℃) 中密封避光培养24 h，
（3）过滤分析：将悬浮液过滤分析上清液中NO-3-N的含量。
用培养前后NO-3-N 浓度的变化来计算土壤反硝化作用的强度。
按如下公式计算。
X2= ( c2- c1 )·( v1+ v2 )·k/ ( t·m)式中：X2为单位时间内单位质量的土壤所消耗的NO-3–N，mg/ ( kg ·h)
土壤取5g
c2和c1为培养前后硝态氮的含量，v1和v2分别为培养液体积和取样中所带入的水分，m用MLSS取代，t为培养时间。
表1 反硝化培养液组成( mg· L- 1 )
培养液种类
培养液组成
KH2PO4K2HPO4NO-3-N 葡萄糖
3 倍碳源0. 2 0. 2 150 450
关键在于确定取样量的确定
硝化强度：用测定硝化速率的方法确定
1.1.1硝化强度、反硝化强度
表2.4 微生物指标
序号指标方法
1 硝化强度溶液培养法（据亚硝酸盐的残余量测定硝化作用强度）i
2 反硝化强度溶液培养法（据硝酸盐的残余量测定反硝化作用强度）ii
i 许光辉,微生物,郑洪元,李凤珍,卢耀波. 土壤微生物分析方法手册[M]. 农业出版社, 1986.
ii 郑仁宏, 邓仕槐, 李远伟, 等. 表面流人工湿地硝化和反硝化强度研究[J]. 环境污染与防治, 2007, 29(1): 37-43.。
反硝化细菌法结合痕量气体分析仪_同位素比质谱仪分析水体硝酸盐氮同位素组成
ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１０９６．２０１２．２０００８反硝化细菌法结合痕量气体分析仪／同位素比质谱仪分析水体硝酸盐氮同位素组成徐春英 李玉中＊ 郝卫平 李巧珍 董一威 房福力 郭智成（中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所／农业部旱作节水农业重点开放实验室，北京１０００８１）摘 要 建立了反硝化细菌法结合痕量气体分析仪（ＴｒａｃｅＧａｓ）／同位素比质谱仪分析水体硝酸盐氮同位素组成的方法。
对反硝化细菌生长、培养条件和方法的精密度及稳定性进行了分析，并利用标准样品ＵＳＧＳ３４研究了样品反硝化孵育时间、ＴｒａｃｅＧａｓ捕集Ｎ２Ｏ气体时间对δ１５ Ｎ测定的影响。
结果表明：恰当的氧气量才能培养出有效的反硝化细菌；本方法精密度及稳定性较好，同一制备时间内硝酸盐δ１５ Ｎ的ＳＤ在０．０９‰～０．１４‰之间，６个月内ＳＤ为０．１２‰；样品反硝化孵育３～２４ｈ可以得到稳定的δ１５ Ｎ；ＴｒａｃｅＧａｓ捕集时间为５００ｓ时得到的δ１５ Ｎ校正值与真实值最接近。
应用本方法对养殖场污水和灌溉井水的硝酸盐δ１５ Ｎ进行了测定。
关键词 反硝化细菌；水体；硝酸盐；氮同位素；痕量气体；同位素比质谱 ２０１２－０１－０５收稿；２０１２－０３－２５接受本文系国家水体污染控制与治理重大专项课题（Ｎｏ．２００８ＺＸ０７４２５－００１）、国家科技支撑计划课题（Ｎｏ．２０１１ＢＡＤ３２Ｂ０３）和中央级公益性科研院所基本业务费专项资金项目资助＊Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｙｚ＠ｉｅｄａ．ｏｒｇ．ｃｎ１ 引 言由于农业集约化生产肥料过度施用及生活污水随意排放等原因，硝酸盐污染地下水问题日趋严重。
已有数据表明，中国多个地区均存在大面积的地下水硝酸盐污染，且有日益严重的趋势［１～５］，对当地饮水安全及人体健康构成了严重的威胁［６］。
硝酸盐氮氧同位素组成的差异为识别硝酸盐的污染来源提供了直接手段，其测定方法也一直在发展之中。
从早期只能测试氮同位素的蒸馏法、扩散法和燃烧法，发展到可同时测试氮氧同位素的高温燃烧法［７～１０］，该方法是利用阴离子交换树脂吸附和富集ＮＯ!３，然后用ＨＣｌ洗脱，用Ａｇ２Ｏ中和含有洗脱液的ＮＯ!３，形成ＡｇＣｌ沉淀，除去Ｃｌ!；溶液中的ＮＯ!３以ＡｇＮＯ３的形式存在，过滤去除固体ＡｇＣｌ和过量的Ａｇ２Ｏ，剩下ＡｇＮＯ３冻干［８］。
反硝化能力的测定
摘要：为深入研究一农田系统中的反硝化过程，本课题进行了农田土壤样本的反硝化细菌分离和16S rRNA基因鉴定，并分析了它们的反硝化能力与反硝化基因。
通过对土壤样本进行初筛和复筛，以限制氮源的方法分离出8株具有反硝化能力的微生物，对5株微生物的反硝化能力进行测定，硝酸盐降解率最高为100%，最低为66.76%。
对8株分离的反硝化菌株的DNA进行反硝化基因nirS和nosZ 进行PCR扩增，结果发现有三株菌株含有nosZ基因，均未检测到nirS基因。
对分离的反硝化菌株的16S rDNA进行PCR扩增，通过克隆建库和阳性克隆测序的方法对分离菌株进行了分类地位的分子鉴定。
结果表明分离的菌株属嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、中间气单胞菌（Aeromonas media）、居泉沙雷氏菌（Serratia fonticola）。
而居泉沙雷氏菌没有有反硝化能力的报道，对我们增加对反硝化细菌的认识有很大帮助。
关键词：反硝化微生物，菌种鉴定，反硝化菌筛选, 反硝化基因1、绪论：反硝化作用（denitrification）也称脱氮作用。
反硝化细菌在缺氧条件下，还原硝酸盐，释放出分子态氮（N2）或一氧化二氮（N2O）的过程。
大部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为氮源和能源，进行无氧呼吸，其生化过程可用下式表示：C6H12O6+12NO3-→6H2O+6CO2+12NO2-+能量CH3COOH+8NO3-→6H2O+10CO2+4N2+8OH-+能量反硝化作用使硝酸盐还原成氮气，从而降低了土壤中氮素营养的含量，对农业生产不利。
农业上常进行中耕松土，使土壤与氧气充分接触以防止反硝化作用。
反硝化作用是氮素循环中不可缺少的环节，可使土壤中因淋溶而流入河流、海洋中的NO3-减少，消除因硝酸积累对生物的毒害作用。
所以我们应尽量发挥其有利的一面，为人类所利用。
反硝化微生物对于硝酸根离子的还原步骤如右图，若要从微生物代谢角度验证菌株是否为反硝化菌最简单有效的方法便是测定nirS和nosZ基因是否存在。
土壤浸提液中硝酸盐氮氧同位素组成的反硝化细菌法测定
法。尽管国内已经报道了反硝化细菌法测定水体硝酸 盐氮氧同位素方法[22-24]，但是用于土壤浸提液硝酸盐 氮氧同位素分析的相关文献较少。本文在前期研究结 果[23]的基础上进行了一些技术改进，使反硝化细菌法 不但可以用于水体硝酸盐氮氧同位素的同时测定，而 且适于土壤浸提液中硝酸盐氮氧同位素的同时测定。 该方法的完善，有助于促进该方法在国内的推广和应 用，从而加强土壤氮循环和迁移转化过程的研究。
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农业环境科学学报 第 35 卷第 9 期
be finished as soon as possible; on the other hand, the soil extracted solution should be cryopreserved. No significant effect of the heat treat原 ment was observed for 啄15N values of USGS34 and IAEA-NO3. However, the raw 啄18O values showed that there were significant differences in heating, and this caused oxygen isotopic fractionation. But no significant differences were observed for 啄15N and 啄18O in the extracted soil
池塘养殖水体中土著反硝化细菌的分离与初步鉴定
第３９卷第５期２０１８年㊀９月水生态学杂志J o u r n a l o fH y d r o e c o l o g yV o l ．３９,N o ．５S e p．㊀２０１８D O I :１０．１５９２８/j．１６７４３０７５．２０１８．０５．０１６㊀㊀收稿日期:２０１７０３１０基金项目:山西省水利推广项目(２１３０３１７).作者简介:张元,１９８３年生,女,工程师,主要从事水产生态养殖技术研究.E Ｇm a i l :２５２２５９５６５＠q q．c o m 池塘养殖水体中土著反硝化细菌的分离与初步鉴定张㊀元(山西省水产育种养殖科学实验中心,山西太原㊀０３０００２)摘要:池塘养殖水体水质恶化问题日益突出,尽管已有各种商品化微生态制剂,但水质净化修复效果始终未得到有效提高.通过采用定向分离㊁筛选㊁扩繁来自原生境的土著有益菌的方法进行生物修复,从而提高养殖废水的净化修复效果;该方法具有针对性强㊁效果佳㊁安全性高㊁成本低以及持续活性时间长㊁无二次污染等优点.２０１６年９月,从山西省运城黄河滩涂水产养殖主产区养殖中后期的池塘水体中定向分离筛选得到１株土著反硝化细菌,命名为Y J Ｇ１,使用奈氏试剂和格利斯试剂对其反硝化能力进行检测.结果显示,奈氏试剂显示黄色,格利斯试剂显示绛红色,说明在细菌培养２４h 后发酵液中产生了少部分的铵离子和较多的亚硝酸盐,菌落具有反硝化功能.经１６S r D N A 序列扩增与测定,片段长度为１４４１b p.无根系统发育树分析显示,Y J Ｇ１与产酸克雷伯氏杆菌(K l e b s i e l l ao x y t o c a )的同源性最高,Y J Ｇ１的分离打破了现有微生态制剂成分大多数为各种商品菌的局势;在水产微生态制剂制备过程中定向加入土著反硝化细菌,可有效降低养殖水体中氨氮与亚硝酸盐含量㊁减少鱼体发病率;反硝化细菌在水产养殖水质净化㊁城市污水处理中具有较大的应用前景,本研究为其他土著有益菌的分离㊁筛选㊁鉴定及应用提供了可借鉴的思路.关键词:池塘;养殖水体;反硝化菌;分离;鉴定中图分类号:Q ９３９．９㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:１６７４３０７５(２０１８)０５０１１１０５㊀㊀自我国推行以养为主 的渔业发展方针以来,淡水池塘养殖业发展迅猛,养殖模式集约化程度逐步提高.然而,养殖者仅为了追求产量和经济效益,忽略了盲目提高放养密度和增加投饵量后造成的水质快速恶化问题.尤其我国大部分养殖池塘的水质维护管理技术相对滞后,养殖动物的排泄物㊁残骸及残饵大量积累,水体中氮磷含量急剧升高,在养殖中后期均达到了富营养化程度(宋超等,２０１２;邓来福和江兴龙,２０１３).水体中藻类生长的规律符合最小因子定律,磷在水体中为不完全循环状态,使得世界上很多地区的水域都严重缺磷,致使磷成为初级生产力的重要限制因素(S t e v e n s o ne t a l ,２０１２).当大量磷进入水体,往往引起浮游植物的迅猛增长使水体呈现富营养化,水体溶解氧含量下降,氨氮㊁亚硝酸盐㊁硫化氢等有害物质持续积累,原本正常的池塘养殖生态平衡被打破,严重影响养殖水产动物的正常生长发育,病害频发㊁病死率陡增.这不仅给养殖者造成了巨大经济损失,更对水环境和周边生态环境造成恶劣的影响,从而制约着池塘养殖业的发展.养殖密度大㊁投喂过量造成的养殖池塘水质恶化问题,其本质是水体中有益微生物与有害微生物间的动态平衡被打破所致.要从根本上改善这种状况,必须恢复水体中正常的微生物群落状态.因此,以微生物调控㊁原位或异位修复养殖水体的生物水处理方法便应运而生,其具有绿色㊁安全㊁环保,无毒副作用㊁无残留污染㊁不产生抗性㊁对水体不产生二次污染等优点,现已成为该领域的研究热点;且养殖水体中亚硝酸盐浓度超标是近年来鱼病频繁发生不可忽视的原因(吴桂时等,２００５).因此,近年来硝化细菌和反硝化细菌在水产养殖业上的应用越来越引起人们的注意,引发了广泛的研究.迄今为止,在大规模集约化水产养殖生产中,大都使用硝化细菌和反硝化细菌来净化水质(王玉堂,２００９).目前已从自然界中分离出许多反硝化细菌,绝大部分是异养型,包括一些兼性厌氧的芽孢杆菌属㊁假单胞菌属㊁变形杆菌属㊁葡萄球菌㊁黄杆菌属㊁微球菌属㊁产碱杆菌属种类(F r i x i o n e e t a l ,２００３).反硝化细菌因其可将亚硝酸盐转化成无毒的氮气而受到广泛的关注与研究.传统理论认为反硝化细菌是异养㊁兼性厌氧型的,在无氧条件下,该微生物利用硝酸盐或亚硝酸盐作为呼吸链的最终受体并产生A T P ,该能量可用于合成新的细胞物质和维持现有细胞的生命活动;其中,某些反硝化细菌可以将水体中的氮氧化物(N O－３和N O－２)通过气态的中间产物(N O和N２O)转化为氮气(N２),从而减轻水体中的氮污染(H a r r i se ta l,２００６;O a k l e y e ta l,２００７).因此,可利用这部分微生物的反硝化作用来控制水体富营养化以及处理污水和净化水域.微生物的反硝化作用在全球氮循环过程中起着重要作用,特别是在水质净化方面(胡朝松等,２００９).生物净化反应的根本是菌种,因此分离获得高活性的反硝化菌株,不仅有利于揭示生物脱氮机理和优化生物脱氮工艺性能,还可以为生物脱氮㊁抑制有害藻类㊁水质净化等工艺提供生产菌种,促进这些工艺的推广应用.本文从山西运城池塘养殖水体中分离出１株反硝化菌株,拟鉴定其分类地位.１㊀材料与方法１．１㊀材料１．１．１㊀菌株来源㊀从山西省运城黄河滩涂水产养殖主产区养殖中后期的池塘中取水样,用于分离筛选反硝化细菌.１．１．２㊀培养基㊀包括富集培养基和反硝化细菌筛选培养基.配方参考文献(M a r c h e s i n i e t a l,１９９２;F r i x i o n e e t a l,２００３;胡朝松等,２００９)并作改进.(A)富集培养基:蛋白胨５g㊁牛肉膏３g㊁N a N O２０．２g㊁K N O３１．０g㊁去离子水１０００m L㊁p H ７．２~７．６㊁１２１ħ高温灭菌３０m i n.固体培养基中加入２％琼脂.(B)反硝化细菌筛选培养基:N a N O２０．５g㊁N H４N O３０．５g㊁C H３C O O N a３．５g㊁酒石酸钾钠７．５g㊁M g S O４ ７H２O０．２g㊁K２H P O４０．５g㊁去离子水１０００m L㊁p H７．２㊁１２１ħ高温灭菌３０m i n.固体培养基中加入２％琼脂.１．１．３㊀试剂㊀选择奈氏试剂和格利斯试剂.１．２㊀方法１．２．１㊀菌株筛选㊀取２m L水样于１００m L A培养基中振荡培养２４h以上,得到富集菌液,将该菌悬液按照２％~３％的比例加入到B培养基中,３０ħ恒温培养３５d后梯度稀释涂板;或直接将富集菌液梯度稀释涂布于B固体培养基上,３０ħ恒温培养;然后将所长出的菌落进行划线纯化,得到初筛菌,并命名为Y JＧ１.使用奈氏试剂和格利斯试剂对其反硝化能力进行检测(M a r c h e s i n i e t a l,１９９２).１．２．２㊀菌株鉴定㊀对初筛菌落直接进行１６Sr D N A 序列扩增与测定.从平板上挑取单菌落溶于１０μL 去离子水中作为扩增模板,选择正向引物序列为５ᶄＧA G A G T T T G A T C C T G G C T C A GＧ３ᶄ,反向引物序列为５ᶄＧG G T T A C C T T G T T A C G A C T TＧ３ᶄ,引物由上海生工合成.P C R反应体系为２０μL:１０ˑP C R b u f f e r ２μL,１０mM d N T P０．４μL,１０μM的正㊁反向引物各１μL,５U/μLT a q D N A聚合酶０．１μL,D N A模板１μL,加双蒸水至总体积２０μL.P C R反应条件为:９４ħ预变性５m i n,接９４ħ变性４５s,５５ħ复性４５s,７２ħ延伸５０s,３０个循环;最后７２ħ温育１０m i n,４ħ冷却１０m i n.取６μLP C R扩增产物,采用１．２％的琼脂糖凝胶电泳检测,观察克隆片段大小,然后经中科瑞泰(北京)生物科技有限公司的琼脂糖凝胶D N A回收试剂盒回收其片段,再将全部产物加入到大连宝生物工程有限公司的感受态细胞E．c o l i C o m p e t e n t C e l l s D H５α中,培养后取菌液或经T a K a R a M i n i B E S TP l a s m i dP u r i f i c a t i o n试剂盒提取大量质粒,送往大连宝生物工程有限公司测序.将测序结果在N C B I服务器(h t t p://w w w．n cＧb i．n l m．n i h．g o v)上的B l a s t软件里进行同源性比对与分析.从结果中挑选部分相似性较高的菌株和一些常见具有反硝化功能的细菌,如芽孢杆菌㊁乳酸菌和亚硝化单孢菌等作同源性比对,用M E G A５．０５软件中N e i g h b o rＧJ i o n i n g方法构建系统发育树,进行系统发育分析.２㊀结果２．１㊀反硝化细菌初筛所取水样的土著微生物经富集分离后,在反硝化细菌筛选培养基上长出一种圆形㊁乳白色㊁表面光滑㊁边缘整齐的菌落.挑取菌落在试管中液体厌氧培养２４h后,用奈氏试剂和格利斯试剂检测其反硝化效果.结果显示,奈氏试剂显示黄色,格利斯试剂显示绛红色;说明在细菌培养２４h后发酵液中产生了少部分的铵离子和较多的亚硝酸盐,具有反硝化功能.２．２㊀初筛菌１６S r D N A同源性比对与系统发育图１为初筛菌１６Sr D N A的P C R产物的琼脂糖凝胶电泳图,目的片段大小约为１５００b p.经测序得知,片段大小为１４４１b p.图２为１２种从B l a s t检索中挑选的部分相似性高的菌种和一些常见具有反硝化功能的细菌作出的无根系统发育树.图２显示,Y JＧ１与产酸克雷伯氏杆菌(K l e b s i e l l ao x y t o c a)的同源性最高.２１１第３９卷第５期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀水生态学杂志㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０１８年９月图１㊀１６S r D N A 的P C R 扩增F i g ．１㊀A m p l i f i c a t i o no f １６S rD N Ab y PCR 图２㊀基于１６S r D N A 序列同源性构建的无根系统发育树F i g ．２㊀U n r o o t e d p h y l o ge n e t i c t r e e b a s e do n t h e １６S r D N A s e q u e n c e s of s t r a i nY J Ｇ１a n d r e l a t e d s pe c i e s ３㊀讨论３．１㊀土著微生物在水产养殖中的应用近年来,水产品质量安全问题越来越受到重视.在生产分散㊁规范化㊁标准化执行不力的背景下,养殖者盲目使用抗生素㊁促生长激素等药物治疗鱼病㊁争取提早上市或杀灭有害藻类的做法,严重影响着水产品质量安全(张清,２００９).目前,国家规定的违禁渔药种类越来越多,逐步被商品化的微生态制剂所取代.通过施用微生态制剂虽然可以简单㊁方便的改善养殖水质.然而,也存在一定的局限性,如同一种微生态制剂,在某地区某种水质中使用效果很好,但在同一地区不同水质或不同地区不同水质中,即使加大使用量都几乎没有明显效果.能找到一种行之有效㊁投入少㊁见效快㊁效力持续时间长的微生态制剂势在必行.土著微生物因长期生活于其原有生境,比外来菌更能适应当地环境,在繁殖存活率㊁生物活性等方面均有着得天独厚的优势;此外,利用土著菌调控水质,还能最大限度地避免外来物种入侵等生态问题.肖国华等(２０１１)为了修复因网箱养殖而遭到污染的白洋淀水环境,采集试验区泥样,经富集培养,并通过其对鱼饵料C O D 去除率的测定,筛选出１０株有机污染降解土著菌,选择其中４种制备微生态制剂,实际应用表明,能有效降解水中有机物,改善养殖环境;邵朝臣等(２０１２)通过投加土著微生物菌剂降解黑臭河水中的污染物质,同时采用其他措施,使温州屿田㊁上庄河全河段主要水质指标维持在地表水近Ⅴ类水平,黑臭现象完全消除,且使水体具有一定的自净能力.土著微生物以其针对性强㊁效果佳㊁安全性高㊁成本低以及作用持续时间长而成为目前水产养殖水质净化方法研究的重点.３．２㊀反硝化细菌K l e b s i e l l ao x yt o c a 的功能与G e n B a n k 数据库比对和基于１６Sr D N A 序列同源性构建的无根系统发育树分析结果显示,初步分离筛选得到的菌株Y J Ｇ１与反硝化细菌产酸克雷伯氏菌(K l e b s i e l l ao x y t o c a )的同源性最高.克雷伯氏菌属(K l e b s i e l l a )细菌是无动力㊁有荚膜的革兰氏阴性杆菌,可迅速发酵葡萄糖产酸或产酸产气,具有不产生硫化氢的特性(刘红英等,２００６).２０世纪９０年代,李树品等(１９９１)分离筛选到高固氮酶活性菌株产酸克雷伯氏菌,可用于提高小麦单位面积产量;F r a n c oB a l d i 等(２００１)分离到的克雷伯氏菌B A S Ｇ１０具有较强的耐受重金属的能力;R yo s u k e S u g i h a r a 等(２０００)将克雷伯氏菌T MN ３菌发酵后获得胞外多糖A Z Ｇ９,并研究了该糖对胶原质诱发的小鼠关节炎的抑制作用,实验表明抑制效果良好.该反硝化细菌功能较多,应用领域广泛.３．３㊀反硝化细菌在水产养殖业的应用前景在水产养殖中,最初所使用的微生态制剂成分大多数仅为光合细菌㊁乳酸菌和芽孢杆菌中的一种或几种,品种较为单一.随着池塘集约化养殖程度的加大,水体富营养化程度的加剧,微生态制剂的研发热潮也随之兴起.目前,微生态制剂中菌类的品种逐渐增多,尤其是硝化细菌和反硝化细菌成为了不可或缺的种类.针对在水产养殖周期内的中后期,池塘水体实际鱼载力往往达到甚至超过理论值,残饵㊁粪便㊁养殖生物残骸等有机物质不断积累,氨氮㊁亚硝酸盐含量持续升高,水体溶解氧含量下降,鱼体发病率上升等问题.众多学者研究发现,将具有反硝化功能的不同菌种按照合理的比例配比复合后使用,可大大减轻氨氮㊁亚硝酸盐含量持高不下的问题.张峰峰等(２０１２)将反硝化细菌㊁芽孢杆菌和乳酸菌三者降解N O －２的能力作了比较,结果显示降解速度不同,反硝化细菌＞乳酸菌＞芽孢杆菌,将３１１２０１８第５期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀张㊀元,池塘养殖水体中土著反硝化细菌的分离与初步鉴定这３种菌以１ʒ２ʒ１混合,效果最佳,降解率大于９９ ９９％.反硝化细菌除了有此特效外,还可大量消耗藻类过度繁殖水体中的氮元素,切断藻类氮营养素,维护良好水色.菌株在溶氧充足及厌氧条件下均可生存并进行反硝化反应,优化底质的理化环境.作为土著反硝化细菌被分离出来的克雷伯氏菌,其同样具有降低养殖水体中亚硝酸盐含量㊁减小鱼体发病率的功能,但对该土著菌降解亚硝酸盐的速率㊁与其他具有反硝化功能的细菌降解速率比较以及与光合细菌㊁芽孢杆菌㊁乳酸菌等不同种类细菌按照什么比例配比的工艺等等问题有待进一步探究.此项工艺的确定,可作为制备土著微生态制剂的模型来借鉴.目前多数研究仅停留在微生物的分离筛选和功能鉴定上,很少将特定区域内分离筛选得到的菌种进行配伍,再返投回污染区进行生物治理.本文旨在将养殖池塘水体中的土著微生物分离筛选后进行科学配伍生产土著微生态制剂,从而对养殖废水进行生物修复,提高水产养殖的经济效益㊁生态效益和社会效益.这样的生物治理针对性强㊁成本低㊁效果显著,主要应用于污水处理,如景观水处理㊁城市内河治理㊁水产养殖水处理等,尤其在水产养殖废水处理中的应用前景最大.参考文献邓来福,江兴龙,２０１３．池塘养殖生物修复技术研究进展[J]．海洋与湖沼,４４(５):１２７０１２７５．胡朝松,李春强,刘志昕,等,２００９．海洋沉积物中反硝化细菌的分离鉴定及消化性能研究[J]．环境科学研究,２２(１):１１４１１８．李树品,蒋千里,楚杰,等,１９９１．产酸克雷伯氏杆菌(K l e bＧs i e l l ao x y t o c a)的分离及其特性研究[J]．山东科学,４(３):１９２５．刘红英,薛长湖,张辉,等,２００６．产酸克雷伯式菌(K l e b s i e l l a O x y t o c a X C 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n I a n dc o p p e rn i t r i t e r e d u c t a s e i nA lＧc a l i g e n e sx y l o s o x i i d a n sd u r i n g d e n i t r i f i c a t i o n[J]．A r c hM i c r o b i o l,１８６(３):２４１２４９．M a r c h e s i n iG,W e b b e r BR,A b b i e n d i G,e t a l,１９９２．H E RＧW I G５．１Ｇa M o n t eC a r l oe v e n t g e n e r a t o r f o rs i m u l a t i n g h a d r o ne m i s s i o nr e a c t i o n s w i t hi n t e r f e r i n gg l u o n s[J]．C o m p u tP h y sC o mm u n,６７:４６５５０８．O a k l e y BB,F r a n c i sCA,R o b e r t sKJ,e t a l,２００７．A n a l y s i s o f n i t r i t e r e d u c t a s e(n i r Ka n dn i r S)g e n e s a n d c u l t i v a t i o n r e v e a l d e p a u p e r a t e c o mm u n i t y o f d e n i t r i f y i n g b a c t e r i a i n t h eB l a n kS e as u b o x i cz o n e[J]．E n v i r o n M i c r o b i o l,９(１):１１８１３０．R y o s u k eS u g i h a r a,M a s a y a s u Y o s h i m u r a,M a s a h a r u M o r i, e t a l,２０００．P r e v e n t i o no fc o l l a g e nＧi n d u c e da r t h r i t i s i n D B AＧ１m i c eb y o r a l a d m i n i s t r a t i o no fA ZＧ９,ab a c t e r i a l p o l y s a c c h a r i d e f r o m K l e b s i e l l ao x y t o c a[J]．I mm u n o pＧh a r m a c o l o g y,４９:３２５３３３．S t e v e n s o nRJ,B e n n e t t B J,D o n i e l l eNJ,e t a l,２０１２．P h o sＧp h o r u s r e g u l a t e s s t r e a mi n j u r y b y f i l a m e n t o u s g r e e na lＧg a e,D O,a n d p H w i t ht h r e s h o l d si nr e s p o n s e s[J]．H y d r o b i o l o g i a,６９５(１):２５４２．(责任编辑㊀万月华)４１１第３９卷第５期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀水生态学杂志㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０１８年９月I s o l a t i o na n dP r e l i m i n a r y Id e n t i f i c a t i o no fN a t i v eD e n i t r i f i c a t i o n B a c t e r i a f r o ma nA qu a c u l t u r eP o n d Z H A N G Y u a n(S h a n x i P r o v i n c eS c i e n c e a n dE x p e r i m e n tC e n t e r o fA q u a t i cB r e e d i n g ,T a i y u a n ㊀０３０００２,P ．R．C h i n a )A b s t r a c t :W a t e r q u a l i t y d e t e r i o r a t i o n i na q u a c u l t u r e p o n d s i sas e r i o u s p r o b l e m ,a n dv a r i o u sc o mm e r c i a l m i c r o b e p r e p a r a t i o n s h a v e e m e r g e d ,b u t t h e y h a v en o t e f f e c t i v e l y i m p r o v e dw a t e r q u a l i t y ．T h i s s t u d y ad Ｇd re s s e s t h e p r o b l e m ,u s i n g d i r e c t i o n a l s e p a r a t i o n ,s c r e e n i n g ,a n d p r o p a g a t i o nof b e n e f i c i a l i n d i ge n o u s b a c Ｇt e r i a w i t h t h e o b j e c t i v e o fi m p r o v i n g b i o Ｇr e s t o r a t i o n ,p u r if i c a t i o n a n d r e m e d i a t i o n o f a q u a c u l t u r e w a s t e w a t e r ．T h i s a p p r o a c hh a s t h e a d v a n t ag e s o f b e n e f i c i a l e f f e c t ,hi g h s a f e t y ,l o wc o s t ,e x t e n d e d a c t i v i t ya n dn o s e c o n d a r yp o l l u t i o n ．I n t h i s s t u d y ,o n en a t i v ed e n i t r i f y i n g ba c t e r i a ,n a m e dY J Ｇ１,w a s i s o l a t e da n d s c r e e n e d f r o m p o n dw a t e r d u r i n g t h em i d Ｇl a t e s t a g e (S e p t e mb e r )o f t h e ２０１６a q u ac u l t u r e s e a s o n ．T h e p o nd w a s l o c a te d i n t h eY e l l o wR i v e r t i d a lf l a t o fY u n c h e ng C i t y ,th em ai n f i s h p r o d u c t i o n a r e a o f S h a n x i P r o v Ｇi n c e ．D u r i n g d e n i t r i f i c a t i o n c a p a c i t y t e s t i n g ,a mm o n i aw a sd e t e r m i n e dw i t hN e s s l e r r e a g e n t (ye l l o w )a n d n i t r i t ew a s d e t e r m i n e dw i t hG r i e s r e a g e n t (r e d )．Af t e r ２４ho f f e r m e n t a t i o n ,a mm o n i aw a s a t a l o wc o n Ｇc e n t r a t i o na n dn i t r i t ew a s p r o d u c e d ,i n d i c a t i ng d e n i t r i f i c a t i o n ．Th e r e s u l t s o f １６Sr D N Aa m p li f i c a t i o na n d s e q u e n c i n g i n d i c a t e d a f r a g m e n t l e n g t ho f １４４１b p ．U n r o o t e d p h y l o g e n e t i c t r e e a n a l y s i s s h o w e d t h a tY J Ｇ１a n d K l e b s i e l l ao x yt o c a h a d t h eh i g h e s t h o m o l o g y ．S u c c e s s f u l i s o l a t i o no fY J Ｇ１i n t e r r u p t s t h e t r e n do fm i Ｇc r o b e p r e p a r a t i o n s c o m i n g f r o mc o mm e r c i a l s o u r c e s ．I f n a t i v e d e n i t r i f y i n g b a c t e r i aw e r e a d d e d t o p r e pa r a Ｇt i o n s ,a mm o n i a a n dn i t r i t e n i t r o g e n i n a q u a c u l t u r ew a t e r c o u l db e e f f ec t i v e l y r ed u ce d ．D e n i t r if y i ng b a c t e r i a sh o w g o o d p o t e n ti a l f o ra p p l i c a t i o ni na q u a c u l t u r ew a s t e w a t e r p u r i f i c a t i o na n du r b a ns e w a get r e a t m e n t ．T h i s s t u d y a l s o p r o v i d e s a p r o m i s i n g m e t h o d f o r i s o l a t i o n ,s c r e e n i n g ,i d e n t i f i c a t i o n a n d a p pl i c a t i o no f o t h Ｇe r b e n e f i c i a l n a t i v eb a c t e r i a ．K e y wo r d s :a q u a c u l t u r e p o n d ;a q u a c u l t u r ew a s t e w a t e r ;n a t i v ed e n i t r i f y i n g b a c t e r i a ;i s o l a t i o n ;i d e n t i f i c a Ｇt i o n５１１２０１８第５期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀张㊀元,池塘养殖水体中土著反硝化细菌的分离与初步鉴定。
MPN法测反硝化细菌的数量
MPN法测定土样中的反硝化细菌数量实验步骤（假设有8个土样）实验器材：100mL锥形瓶48只，250mL锥形瓶10只（2只用于制取无菌水，8只用于配土壤悬浊液），120根试管，120个试管硅胶塞、滴管、白瓷比色板、移液枪及吸头、洁净工作台、恒温培养箱等。
①配置培养基KNO3 2g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO4 1.0g，KH2PO4 1.0g，柠檬酸钠5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。
②配置无菌水用2只250mL的三角瓶装满蒸馏水，用密封膜封口。
再用8只250mL的三角瓶装100mL的蒸馏水，也用密封膜封口。
③将培养基配制好后装入试管中，用移液枪向每管中装10mL培养基，培养试管中应放入一倒置杜氏发酵管，以检测气体的生成）,塞上硅胶塞，121℃灭菌30min。
每个样品需培养基15管（5个稀释倍数，每个稀释梯度3个平行），共120个培养基。
④称取新鲜土样10g，共8个土样，迅速倒入盛有三四十粒玻璃球的100mL 无菌水的250mL三角瓶中。
置于摇床上振荡30min，制成10倍的样品稀释液。
静止30s后，用1mL灭菌吸管吸1mL10倍稀释液加入9mL无菌水中（注意勿使吸管碰到无菌水），摇匀及制成100倍稀释液，然后将悬浊液稀释成一系列梯度（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）,每个土样需要6个锥形瓶。
⑤取出灭菌分装好的各培养基试管，用无菌吸管接种样品的稀释液1mL，每个稀释度接种3管，另取3管培养基接种1mL无菌水作为对照。
于25~30℃中恒温培养箱中培养，培养周期为14天。
反硝化细菌的测定培养14天后检查是否有菌生长，如果有细菌生长，杜氏发酵管中有气泡出现，培养液变浑浊。
用纳氏试剂检查是否有氨产生，其法是于白瓷比色板上去培养基5滴，加上奈氏试剂2滴，如果有NH3存在，则呈黄色或褐色沉淀。
再用格利斯试剂Ⅰ及Ⅱ检测有无亚硝酸盐生成（方法是取出5滴培养液于白瓷比色板上，加入格利斯试剂第一或者二各两滴，如果有亚硝酸存在则呈红色），如果不呈红色则表明亚硝酸已完全消失。
反硝化细菌的筛选、鉴定及其强化处理硝酸盐废水的研究的开题报告
反硝化细菌的筛选、鉴定及其强化处理硝酸盐废水的研究的开题报告一、研究背景及意义硝酸盐是一种重要的氮源，在农业、化工、制药等领域广泛应用。
然而，硝酸盐的过量排放会引起环境和人体健康问题。
因此，硝酸盐的生物处理已成为一种重要的废水处理方法之一。
反硝化细菌在硝酸盐生物处理中起着重要作用，可以将硝酸盐还原为氮气或氮氧化物。
因此，筛选、鉴定、强化反硝化细菌的能力，对提高硝酸盐废水的处理效率具有重要意义。
二、研究内容和目的研究计划主要针对以下三个方面：1. 筛选反硝化细菌：从不同环境中采集样品，利用硝酸盐为唯一氮源进行培养，筛选出反硝化细菌，并对其形态、生理生化特性进行初步分析。
2. 鉴定反硝化细菌：对从样品中筛选出的反硝化细菌进行进一步鉴定，采用16S rRNA序列比对、生理生化特性等方面的方法加以鉴定。
并进行细菌种类的分类。
3. 强化处理硝酸盐废水：利用筛选出的反硝化细菌，研究其处理硝酸盐废水的能力及其影响因素，并开展相应的实验研究，以达到强化处理的目的。
三、研究方法和技术路线1. 样品采集和处理：从自然环境和工业废水中采集样品，并进行前处理，如筛选、培养和分离等。
2. 反硝化细菌筛选和鉴定：利用筛选出的细菌进行形态学、生理生化特性、16S rRNA序列比对等方面的鉴定，并进行分类。
3. 反硝化细菌处理硝酸盐废水：利用反硝化细菌进行处理实验，观察各因素对处理效果的影响。
四、预期成果1. 筛选出反硝化细菌，并进行形态学、生理生化特性、16S rRNA序列比对等鉴定。
2. 研究反硝化细菌处理硝酸盐废水的能力及其影响因素，并得到相应的实验结果。
3. 完成相关论文和报告。
湿地土壤反硝化作用及测定方法
湿地土壤反硝化作用及测定方法汪旭明;李亚兰;林啸;仝川【期刊名称】《亚热带资源与环境学报》【年(卷),期】2017(012)003【摘要】反硝化作用是湿地生态系统实现脱氮功能的最主要过程,对湿地生态系统氮循环及生态环境可产生重要影响.不同类型湿地土壤反硝化速率存在明显差异,湿地土壤反硝化作用的环境影响因子较多且作用方式复杂.目前,针对湿地土壤反硝化作用的测定手段日益丰富,但由于方法本身的缺陷和测定对象的复杂性,一定程度地影响了测定结果的准确性,因此比较分析不同反硝化速率测定方法的优缺点,有利于更好地把握测定方法的适用性.文章比较了不同类型湿地土壤的反硝化速率,探讨了湿地土壤反硝化速率影响因子的作用途径和效应,并对15N同位素技术、乙炔抑制法、N2产生测定法和硝酸盐剩余法等常用测定方法进行比较和探讨,最后总结当前研究的不足并提出了今后应加强研究的方向.%Denitrification,the major nitrogen removal process in wetland ecosystem,could exert a sig-nificant impact on the nitrogen cycles and eco-environment of wetland ecosystems.There are obvious differences of denitrification rates among different wetland ecosystems,and the effects of various envi-ronmental factors affecting denitrification rates in wetland soils are complicated.At present,the meas-urement means of wetland soil denitrification has become increasingly rich,but because of the defects of the method itself and the complexity of the research object,the accuracy of measurement results has been affected inevitably,analyzing the advantages anddisadvantages of different measurement methods of denitrification rate could help for better grasping the applicability of each method.This paper com-pared the denitrification rates in different wetland ecosystems and discussed the pathways and effects of environmental influence factors for denitrification rates in wetland soils.Then the common measurement methods of denitrification rates were compared and discussed, including the 1 5N isotope technique, acetylene inhibition method,directN2measurement method and nitrate residual method.Finally, the shortcomings of current researches were summarized and the future research directions were strength-ened.【总页数】11页(P50-60)【作者】汪旭明;李亚兰;林啸;仝川【作者单位】福建师范大学地理科学学院,福州350007;中国科学院生态环境研究中心城市与区域生态国家重点实验室,北京100085;中国科学院大学,北京100049;福建师范大学地理科学学院,福州350007;福建师范大学地理科学学院,福州350007;福建师范大学亚热带湿地研究中心,福州350007;福建师范大学湿润亚热带生态-地理过程教育部重点实验室,福州350007;福建师范大学地理科学学院,福州350007;福建师范大学亚热带湿地研究中心,福州350007;福建师范大学湿润亚热带生态-地理过程教育部重点实验室,福州350007【正文语种】中文【中图分类】P593【相关文献】1.典型相关分析在湿地土壤特征研究中的应用——以黄河三角洲冲积平原湿地土壤为例 [J], 侯龙鱼;刘艳;马风云;宋玉民;崔晓东;陈怀梁2.新疆艾比湖湿地土壤有机碳含量的光谱测定方法对比 [J], 杨爱霞;丁建丽3.三江平原典型草甸小叶章湿地土壤的反硝化作用 [J], 孙志高;刘景双;于君宝4.湿地土壤铁的分析测定方法比较 [J], 邹元春;姜明5.三江平原典型小叶章湿地土壤硝化-反硝化作用与氧化亚氮排放 [J], 孙志高;刘景双;杨继松;李新华;周旺明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
细菌反硝化法测定10–6 级硝酸盐的氮和三氧同位素
摘 要: 硝酸盐的氮和三氧同位素(δ15N, δ17O 和 δ18O)及氧同位素非质量分馏(△17O)综合研究, 可以更有效 地示踪硝酸盐的来源和形成过程、制约硝酸盐的形成条件。本文详细描述了细菌反硝化法测定 10–6 级硝酸 盐氮和三氧同位素的分析测试方法和实验要点。综合优化改良的细菌反硝化前处理方法、全自动气体预浓 缩富集纯化系统和测试流程, 实现了实验室长期测定数据的稳定性, 以及多批次标准样品测定的良好重现 性。10 nmol NO–3 标准样品的 δ18O 和 δ15N 测试精度分别是 0.25‰(1σ)和 0.40‰(1σ)。80 nmol NO–3 标准样品 的 δ18O、δ17O 和 δ15N 的测试精度分别是 0.5‰(1σ)、0.4‰(1σ)和 0.1‰(1σ), 据此计算出的 Δ17O 精度为 0.46‰(1σ)。 关键词: 反硝化细菌法; 硝酸盐; 氮同位素; 三氧同位素 中图分类号: P597.2 文献标志码: A doi: 10.3975/cagsb.2020.090101
2020 年 9 月 第 41 卷 第 5 期: 591-604
地球学报
Acta Geoscientica Sinica
Sep. 2020 Vol.41 No.5: 591-604
细菌反硝化法测定 10–6 级硝酸盐的氮和三氧同位素
范昌福 1), 曲冬梅 2)*, 秦 燕 1), 胡 斌 1), 高建飞 1), 武晓珮 1), 李延河 1)
two laboratories and good reproducibility of multiple batches of reference samples. The external precision of
反硝化作用潜势测定的方法
反硝化作用潜势测定的方法反硝化作用是氮循环过程中的一个重要环节，它能够将土壤和水体中的硝酸盐还原为氮气，从而减少氮污染。
反硝化作用潜势测定对于环境保护和农业氮管理具有重要意义。
本文将详细介绍反硝化作用潜势的测定方法。
一、实验室测定方法1.间歇式培养法（1）样品准备：从待测土壤或沉积物中取出适量样品，去除杂质，过筛。
（2）培养：将样品放入培养瓶中，加入适量硝酸盐溶液，使硝酸盐浓度为10-20 mg/L。
将培养瓶置于恒温振荡器中，在25°C左右的温度下进行间歇式培养。
（3）测定：在培养过程中，定期取样，测定硝酸盐、亚硝酸盐和氮气的浓度。
2.恒定流速法（1）样品准备：同间歇式培养法。
（2）培养：将样品放入反应器中，加入硝酸盐溶液，使流速恒定。
在25°C左右的温度下进行培养。
（3）测定：定期取样，测定硝酸盐、亚硝酸盐和氮气的浓度。
二、现场测定方法1.土壤孔隙水浓度法（1）样品准备：在待测土壤中安装土壤孔隙水提取器，提取土壤孔隙水。
（2）测定：测定土壤孔隙水中的硝酸盐、亚硝酸盐和氮气浓度。
2.土壤气体采样法（1）样品准备：在待测土壤中安装土壤气体采样装置。
（2）测定：定期采集土壤气体样品，测定其中氮气浓度。
三、计算方法1.反硝化作用潜势计算公式：反硝化作用潜势（DNP）=（硝酸盐消耗速率- 亚硝酸盐产生速率）/ 土壤或沉积物质量2.反硝化作用速率计算公式：反硝化作用速率（DR）=（硝酸盐消耗速率）/ 土壤或沉积物质量四、注意事项1.在测定过程中，要确保实验操作规范，避免样品污染。
2.实验过程中，要严格控制温度、湿度等环境因素，以保证实验结果的准确性。
3.在计算反硝化作用潜势时，要充分考虑其他因素（如硝酸盐的吸附、微生物的硝酸盐还原作用等）对实验结果的影响。
氯化钙浸提法测定土壤中的硝酸盐氮
氯化钙浸提法测定土壤中的硝酸盐氮潘艳;吕保玉;蓝月存;覃华芳【摘要】利用气相分子吸收光谱仪,通过单因素实验法,探讨CaCl2浸提液的浓度、浸提时间对土壤中的硝酸盐氮测定的影响.实验结果表明,浸提液的浓度对土壤中的硝酸盐氮测定有重要影响,浸提时间对测定值影响不显著;当CaCl2浓度为2mol· L-1,浸提时间为40min的条件下,检测方法的精确度和准确度均可达到检测要求.【期刊名称】《化学工程师》【年(卷),期】2019(000)006【总页数】3页(P37-39)【关键词】硝酸盐氮;土壤;浸提法;单因素实验;气相分子吸收光谱仪【作者】潘艳;吕保玉;蓝月存;覃华芳【作者单位】广西壮族自治区环境监测中心站,广西南宁530028;广西壮族自治区环境监测中心站,广西南宁530028;广西壮族自治区环境监测中心站,广西南宁530028;广西壮族自治区环境监测中心站,广西南宁530028【正文语种】中文【中图分类】X833土壤中的硝酸盐氮主要来源于工业废水、农业施肥、污染物填埋和农药泄露等[1]。
高浓度的硝酸盐氮对生态环境和人类健康产生严重的影响。
传统的分光光度法测定土壤中的硝酸盐氮存在分析步骤繁琐、检测周期长、试剂消耗量大等缺点。
气相分子吸收光谱法作为一种新型的分析方法已广泛应用地表水、地下水、海水、饮用水、生活污水及工业污水中硝酸盐氮的测定[2]，但用于土壤中硝酸盐氮的测定研究较少。
本文采用气相分子吸收光谱法，以CaCl2作为浸提液测定土壤中硝酸盐氮，具有直接进样，分析速度快，精密度高，受样品色度和浊度的影响较小等优点[3]。
1 实验部分1.1 实验原理以CaCl2作为浸提液提取土壤中的硝酸盐氮，在（70±2）℃的酸性条件下，通过TiCl3溶液，将硝酸盐氮还原为亚硝酸盐氮，用N2载入气相分子吸收光谱仪，在波长214.4nm处吸光度与硝酸盐氮的浓度遵守朗伯-比尔定律。
工作原理见图1。
好氧反硝化细菌处理农田灌溉地下水中硝酸盐污染的研究
好氧反硝化细菌处理农田灌溉地下水中硝酸盐污染的研究吐尔逊阿依·吾甫尔;施宠;布合力且木·吾甫尔;王纯利【期刊名称】《新疆农业科学》【年(卷),期】2011(048)005【摘要】[目的]反硝化细菌是原位生物修复地下水硝酸盐污染过程中起主要脱氮作用的微生物,通过好氧反硝化细菌去除灌溉农田地下水中的硝酸盐.[方法]将菌株NSA4接种于灌溉农田地下水中,检验其在实际地下水中的脱氮效果.总氮测定采用过硫酸钾氧化紫外分光光度法;氨氮测定采用纳氏试剂分光光度法;硝氮采用酚二磺酸紫外分光光度法测定;亚硝氮测定采用N-(1-奈基)-乙二胺分光光度法.[结果]加菌处理地下水中的NO3--N的去除率要比未加菌处理对NO2--N的去除率高10%～40%,加菌处理对地下水中的TN的去除率要比未加菌处理对TN的去除率高10%左右.[结论]好氧反硝化细菌对于农田灌溉地下水脱氮效率具有显著的改善能力,在未来的地下水处理中具有一定的应用价值.【总页数】5页(P918-922)【作者】吐尔逊阿依·吾甫尔;施宠;布合力且木·吾甫尔;王纯利【作者单位】新疆农业大学草业与环境科学学院,乌鲁木齐830052;新疆农业大学草业与环境科学学院,乌鲁木齐830052;喀什教育学院生化教研室,新疆喀什844000;新疆农业大学草业与环境科学学院,乌鲁木齐830052【正文语种】中文【中图分类】S188+.2【相关文献】1.地下水中硝酸盐污染来源与防治研究进展 [J], 王恒2.利用细菌同步去除地下水中硬度和硝酸盐的方法研究 [J], 和宁;史经新3.铁屑修复地浸采铀地下水中硝酸盐污染的研究 [J], 康海彦;金朝晖;修宗明;王丹;李铁龙;叶善东4.好氧反硝化细菌的筛选鉴定及处理硝酸盐废水的研究 [J], 苏俊峰;王继华;马放;高珊珊;魏利;王晨5.好氧反硝化细菌处理硝酸盐废水的研究及微生物群落结构分析 [J], 苏俊峰;马放;高珊珊;王弘宇;李维国;魏利因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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nitrate samples. Therefore, we suggested that the soil nitrate extracts can directly react with denitrifier in order to avoid the oxygen isotopic fractionation and save the test time. Based on these, 15N and 18O isotope abundance in the extractable soil nitrate under the different fertilizer fields were investigated by using this method. Keywords：denitrifier method; soil extract; nitrate; 15N and 18O isotope abundance
土壤浸提液中硝酸盐氮氧同位素组成的 反硝化细菌法测定
徐春英，李玉中 *，李巧珍，毛丽丽，林 伟，强晓晶，郑 欠
（中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所/农业部旱作节水农业重点开放实验室，北京 100081）
摘 要：本研究优化了采用反硝化细菌法同时测定土壤浸提液中硝酸盐氮氧同位素组成的方法。在已有研究结果的基础上，通过 采用 5000~8000 r·min-1 的转速离心、高纯氮气吹扫 1 h、减少加样量及改造仪器自动进样器等措施对已发表方法进行了优化。对国 际标准样品 USGS34 的分析表明，0.1~0.8 滋g NO3--N 样品量即可以得到较稳定、准确的测定值和校正值；同一时间内制备的硝酸盐 啄15N 的 SD 介于 0.05译~0.09译之间，啄18O 的 SD 介于 0.28译~0.48译之间；在三个月之内 啄15N 和 啄18O 的测定值基本一致，表明该方法 具有较好的准确度、精密度和稳定性。通过研究浸提剂、保存条件以及加热对测定土壤浸提液中硝酸盐氮氧同位素组成的影响，结 果表明：常用的去离子水、KCl、CaCl2 可能都含有微量的硝酸盐，随着加样量增大，浸提剂中含有的硝酸盐可能就会影响 啄15N 和 啄18O 的测定；对于土壤硝酸盐的浸提液，冷冻保存效果较好，保证了土壤硝酸盐氮氧同位素的准确性和稳定性；尽管加热对硝酸盐标准 样品 USGS34 和 IAEA-NO3 的 啄15N 没有显著影响，但 啄18O 显著升高，说明加热易引起氧同位素分馏；而土壤硝酸盐浸提液样品加热 前后的 啄15N 和 啄18O 的测定值没有显著变化，因此为避免产生氧同位素分馏和节省测试时间，建议同时测定土壤浸提液硝酸盐 啄15N 和 啄18O 时直接和反硝化细菌反应。应用本方法对不同肥料处理田间土壤浸提液硝酸盐的氮氧同位素组成进行了测定。 关键词：反硝化细菌法；土壤浸提液；硝酸盐；氮氧同位素组成 中图分类号：S151.9 文献标志码：A 文章编号：1672-2043（2016）09-1829-08 doi:10.11654/jaes.2016-0551
国外研究者已经应用反硝化细菌法对土壤浸提 液的硝酸盐氮氧同位素进行测定[19-21]，并用于土壤硝 酸盐溯源与氮转化过程研究[21]；相比而言，国内土壤 中硝态氮氮氧同位素自然丰度运用较少，尤其是氧同 位素应用更少，其主要原因是缺乏合适有ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的分析方
法。尽管国内已经报道了反硝化细菌法测定水体硝酸 盐氮氧同位素方法[22-24]，但是用于土壤浸提液硝酸盐 氮氧同位素分析的相关文献较少。本文在前期研究结 果[23]的基础上进行了一些技术改进，使反硝化细菌法 不但可以用于水体硝酸盐氮氧同位素的同时测定，而 且适于土壤浸提液中硝酸盐氮氧同位素的同时测定。 该方法的完善，有助于促进该方法在国内的推广和应 用，从而加强土壤氮循环和迁移转化过程的研究。
国内硝酸盐氮氧同位素组成的同时分析主要前 处理方法为离子交换树脂法和反硝化细菌法。尽管离 子交换树脂法是收集和富集 NO3-的一个重要发展[12]， 但是运用该方法分析硝酸盐氮氧同位素组成需要将 样品富集、洗脱、中和过量的 Cl-、冷冻干燥等，操作步 骤繁琐，费时费力；另外，需要用到离子交换树脂、滤 膜、Ag2O 等耗材和试剂，前处理的费用很高，这也成 为该方法使用的一个限制因子[13]。反硝化细菌法是近 几年硝酸盐氮氧同位素测试技术的重要进展，最早由 美国普林斯顿大学的 Sigman 等[14]提出用于海水和淡 水的硝酸盐氮同位素自然丰度测定。该方法由自然存 在的缺乏 N圆O 还原酶的反硝化细菌将水中 NO3-转化 为 N2O，再由质谱仪测定 N2O 气体的氮氧同位素组 成，从而得到硝酸盐的氮氧同位素组成[14-15]。与离子交 换树脂法相比，反硝化细菌法具有许多优点：（1）所 需样品量低，该方法可同时分析浓度低至滋早·蕴-1 的 硝酸盐氮氧同位素组成，同时也由于降低了样品量而 降低了样品的空白，测试结果准确；（2）可在常温常压 下进行，不受有机氮及其他离子的影响；（3）样品预处 理简单，并且氮氧同位素可同时分析，分析时间明显 缩短，测试成本也极大降低。反硝化细菌法的诸多优 点，已成为目前国际上先进的硝酸盐氮氧同位素组成 测试技术[16-18]。
我国农业生产中存在氮肥过量施用现象，这不仅 造成氮肥利用率低，经济效益下降，而且长期过量施 用氮肥会造成土壤氮素严重冗余[1-3]。土壤氮素形成的 硝态氮极易通过淋溶作用进入水体，造成地表水富营 养化、地下水的硝酸盐含量超标[4-8]及温室气体 N2O 排 放[9]等问题。硝态氮是土壤氮循环及迁移转化过程的 中心形态，已有研究表明硝态氮中的氮、氧同位素组 成是识别其来源和主要氮循环过程的有用工具[10-11]。
圆园16，35（9）:1829-1836
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2016 年 9 月
徐春英，李玉中，李巧珍，等. 土壤浸提液中硝酸盐氮氧同位素组成的反硝化细菌法测定[J]. 农业环境科学学报, 2016, 35（9）：1829-1836. XU Chun-ying, LI Yu-zhong, LI Qiao-zhen, et al. Determination of 15N and 18O isotope abundance in the extractable soil nitrate by the denitrifier method[J]. 允燥怎则灶葬造 燥枣 粤早则燥-耘灶增蚤则燥灶皂藻灶贼 杂糟蚤藻灶糟藻, 2016, 35（9）:1829-1836.
收稿日期：圆园16原04原19 基金项目：国家自然科学基金（41301553，41473004）；中央级公益性科研院所基本业务费专项资金；中国农科院科技创新工程资助项目（农业水生
产力与水环境创新团队） 作者简介：徐春英（1978—），女，副研究员，博士，主要研究方向为农业水环境。E-mail：xuchuny@ * 通信作者：李玉中 E-mail：liyuzhong@
1830
农业环境科学学报 第 35 卷第 9 期
be finished as soon as possible; on the other hand, the soil extracted solution should be cryopreserved. No significant effect of the heat treat原 ment was observed for 啄15N values of USGS34 and IAEA-NO3. However, the raw 啄18O values showed that there were significant differences in heating, and this caused oxygen isotopic fractionation. But no significant differences were observed for 啄15N and 啄18O in the extracted soil
Determination of 15N and 18O isotope abundance in the extractable soil nitrate by the denitrifier method
XU Chun-ying, LI Yu-zhong*, LI Qiao-zhen, MAO Li-li, LIN Wei, QIANG Xiao-jing, ZHENG Qian （Key Laboratory of Dryland Agriculture，Ministry of Agriculture in China, Institute of Environment and Sustainable Development in Agricul原 ture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China） Abstract：A method has been established for determing simultaneously 15N and 18O isotope abundance in the extractable soil nitrate using denitrifier bacteria. The method was optimized by using 5000~8000 r·min-1 centrifugal rotational speed, purging 1 h with high pure N2, re原 ducing the amounts of samples and improving the autosampler based on the preliminary findings. Analysis of international standard of US原 GS34 showed that the method presented better accuracy, precision, and stability. The standard deviations（SD）of 啄15N and 啄18O were 0.05译 ~0.09译 and 0.28译 ~0.48译 respectively in the same sample at the same time within 3 months. Additionally, the effects of some factors such as the extracting agents, storage condition and heating on 啄15N and 啄18O of soil nitrate were analyzed. The results showed that the ex原 tracted solution such as KCl or CaCl2 had no effect on the determination of 啄15N and 啄18O if sampling amount was small. Nevertheless, the significant difference would be found under bigger sampling amount with impure extracting agents. Moreover, the results also indicated that the cryopreservation method was better than the cold preservation for the 啄15N and 啄18O in the soil nitrate. Analysis of 啄15N and 啄18O should