野菊花天然活性成分蒙花苷的提取

野菊花天然活性成分蒙花苷的提取
摘要:选用基质固相萃取技术,采用正交优化设计试验,研究野菊花中天然活性成分蒙花苷提取的最佳工艺｡在四氟芯层析柱中加入硅胶氧化铝野菊花花序粉,用正己烷-乙酸乙酯-丙酮的溶液组合进行极性洗脱,并采用高效液相色谱法测定蒙花苷的含量｡结果表明,野菊花花序中蒙花苷的最佳工艺条件为萃取时间1.5 h,萃取温度为30℃,洗脱剂体积比为1∶2∶3｡
关键词:野菊花花序;蒙花苷;正交试验;高效液相色谱法
Extracting Linarin, a Natural Active Ingredient from Wild Chrysanthemum Abstract: Orthogonal design was used to optimize the technique of extracting linarin from wild chrysanthemum by matrix solid-phase extraction method. The operation process was adding Silica Gel-Alumina-Pollen into the PTFE core firstly, then polarity eluting with solution combination of hexane-ethyl acetate-acetone, and finally determining the linarin content by High Performance Liquid Chromatography. The results showed that the optimum condition of extracting linarin from chrysanthemum inflorescence was extracting 1.5 h at 30℃with an elution solution ratio of 1∶2∶3.
Key words: inflorescences of chrysanthemum; linarin; orthogonal design; HPLC
野菊花(Flos Chrysanthemi Indici)具有抗病原微生物､治疗心血管系统疾病､降压､降低血小板聚集的影响､抗炎､免疫､抗氧化等作用[1]｡此外还用于治疗肿瘤､高血压和高血脂等症,对感冒､流行性脑膜炎也有一定预防作用[2,3]｡
蒙花苷是众多黄酮类化合物中活性较高的化合物之一,由刺槐素和一个苷元组成,化学结构式见图1｡蒙花苷又称刺槐苷､金合欢因､野菊花黄酮苷､刺槐素-7-O-β-D-芸香糖苷等,以两种异构体形式的化合物α体和β体｡蒙花苷及其衍生物在植物界分布广泛,存在于许多植物的花､叶､果实中,多以苷的形式存在｡其中以野菊花花序中含量最多,是野菊花中重要的药效成分[6,7]｡近年来国内外研究表明,蒙花苷具有非常广泛的生理和药理活性,对预防糖尿病和改善糖尿病有显著的作用,还具有抑制磷酸二酯酶､醛糖还原酶､金黄色葡萄球菌､乙型溶血链球菌､抗菌等作用[4,5],能保护肝脏,并对慢性气管炎有一定疗效[8]｡
1材料与方法
1.1材料
1.1.1野菊花试验用野菊花干燥花序购于浙江中医院中药房｡将其放入研钵中研磨成粉状,装入烧杯并用保鲜膜封好,备用｡
1.1.2试剂蒙花苷､正己烷､乙酸乙酯､丙酮､甲醇､冰醋酸､氧化铝､硅胶等｡
1.1.3仪器YP202N电子天平,上海精密科学仪器有限公司;四氟芯层析柱,上海立亚太玻璃仪器制造有限公司杭州分公司;Waters AcQuity高效液相色谱仪,美国Waters公司;UV 2501 PC紫外-可见分光光度计,日本导津;烧杯,研钵,漏斗,玻璃棒,移液管,容量瓶,干燥器等｡
1.2方法
1.2.1蒙花苷的提取精密称取1.2 g野菊花花序粉､2.4 g硅胶和2.4 g氧化铝,加入20 mL去离子水,搅拌均匀后装入已固定在铁架台上的四氟芯层析柱中｡每间隔15 min分别加入正己烷､乙酸乙酯､丙酮进行从小到大的极性洗脱｡将洗脱液进行抽滤得到黄色滤液,用滤纸再次过滤,得到澄清的黄色滤液即为蒙花苷提取液,放置阴暗处备用｡
1.2.2单因素试验精密称取1.2 g野菊花花序粉,在不同的萃取时间､萃取温度､洗脱剂体积比(V正己烷∶V乙酸乙酯∶V丙酮)下进行单因素试验｡结束后将洗脱液进行抽滤得到黄色滤液｡将黄色滤液用滤纸再次过滤,得到蒙花苷提取液,去离子水定容至50 mL｡测定蒙花苷在326 nm的吸光度,并计算出相应的蒙花苷的含量｡
1.2.3正交优化试验准确称取1.2 g野菊花花序干粉末以不同的萃取时间､萃取温度､洗脱剂体积比为考察因素,根据单因素试验的结果,再选用
L9(33)正交表进行正交试验,因素与水平设计见表1,测定蒙花苷含量｡
1.2.4高效液相色谱仪的检测[9]色谱柱:Symmetry-C18柱(3.9 mm×150.0 mm,5 μm),流动相∶甲醇-水-冰醋酸(52∶46∶2);流速:1.0 mL/min,检测波长:326 nm;柱温:30℃,进样方式:手动进样;进样量:5 μL｡
取蒙花苷标准品1.2 mg溶于甲醇,于50 mL容量瓶中定容,得蒙花苷标准品液｡从中取2 mL移至液相用小烧杯中,为标1｡再从中分别取2 mL于4只试管中,分别稀释成2､3､4､5倍,并移至小烧杯中,为标2､3､4､5｡取定容的提取液各2 mL于50 mL容量瓶中,用30%乙醇稀释至刻度,15 min后以空白标准液作对照,于326 nm处测定吸光度,计算提取液的蒙花苷含量｡
2结果与分析
2.1高效液相色谱仪的检测
2.1.1检测波长的选择取蒙花苷标准品,用甲醇配成溶液进行200~400 nm的光谱扫描｡光谱图显示,其在207､267､326 nm附近均有较大吸收峰｡在326 nm峰面积最大,为减少其他成分对蒙花苷测定的干扰,特选择326 nm作为检测波长｡
2.1.2线性关系的考察将标1､标2､标3分别取样5 μL,按1.2.4所述条件进行测定,结果表明,蒙花苷在进样量为0.048~2.130 μL的范围内与峰面积具有良好的线性关系｡以峰面积(y)为纵坐标,蒙花苷浓度(x)为横坐标,绘制标准曲线,得曲线的回归方程=1 980x-7.560,r=0.999 9｡
2.1.3精密度试验精密吸取对照品溶液5 μL连续进样6次,蒙花苷峰面积CV为0.78%｡
2.1.4重复性测定取样品粉末约2.4 mg,按上述供试品溶液的制备方法和测定条件,制备6份供试液,蒙花苷含量测定结果的CV为1.30%｡
2.1.5稳定性试验分别制备对照品溶液和供试品溶液,室温下放置,分别于0､2､4､6､8､12 h进样测定,记录蒙花苷色谱峰峰面积,计算变异系数,结果表明,对照品溶液中蒙花苷色谱峰峰面积CV为0.48%,供试品溶液中蒙花苷色谱峰峰面积CV为0.81%,表明对照品和供试品溶液在12 h内稳定｡
2.1.6回收率试验采用加样回收试验,取已知含量的野菊花粉末0.12 g,共6份,精密称定,按对照品加入量与所取供试品含量之比为1∶1的比例加入蒙花苷对照品,制备供试品溶液,分别测定,计算回收率｡结果表明,蒙花苷的平均回收率为97.4%,CV为2.42%｡
2.1.7色谱分析通过对图2和图3的比较,以及对照品的光谱,可以看出保留时间约在1.89 min左右,可以断定这就是蒙花苷,即第3个吸收峰为蒙花苷的吸收峰｡
2.2单因素试验
2.2.1萃取时间对蒙花苷提取量的影响在常温下,在不同的萃取时间下提取蒙花苷,测定提取液中蒙花苷含量,结果见图4｡由图4可知,野菊花中蒙花苷提取量随萃取时间的延长而增大,但萃取1.5 h后,蒙花苷的含量开始降低,故萃取时间为1.5 h 时提取效果最好｡
2.2.2萃取温度对蒙花苷提取量的影响在不同温度下,用洗脱试剂体积比1∶1∶1的洗脱试剂提取1.5 h后,测定提取液中蒙花苷含量,结果见图5｡由图5可知,野菊花中蒙花苷含量在提取温度为25 ℃时最高,故提取温度以25 ℃为宜｡2.2.3洗脱剂体积比对蒙花苷提取量的影响以不同洗脱剂体积比,在25 ℃下,提取1.5 h,测定提取液中蒙花苷含量,结果见图6｡由图6可知,在其他条件相同情况
下,从经济角度考虑,以洗脱剂体积比1∶2∶3提取为宜｡
2.3正交优化试验
由表2可以看出,最佳提取工艺为A2B3C3,即萃取时间为1.5 h,萃取温度为30 ℃,洗脱剂体积比为1∶2∶3｡
3结论
利用新型的基质固相分散萃取技术提取野菊花干燥花序中天然活性成分蒙花苷,通过对样品提取条件进行不同因素及水平比较,以及运用正交试验设计进行多因素综合分析,优选出了萃取时间､萃取温度､洗脱剂体积比3个因素的最优试验方案,建立了实用､简单､方便､易行的基质固相分散萃取蒙花苷的流程｡野菊花花序中蒙花苷的最佳提取工艺条件为:萃取时间 1.5 h,萃取温度为30 ℃,溶液比1∶2∶3｡
参考文献:
[1] 王丹.药用植物野菊花的研究现状及发展前景[J].现代中药研究与实践,2007,21(4):59-62.
[2] 刘国应.野菊花的药理研究及临床应用进展[J].山东中医杂志,1990,9(6):37-39.
[3] 华海清.野菊花临床应用研究概况[J].湖南中医药导报,1994,1(10):36-37.。