高等植物肌动蛋白的主要研究方法

3.1.2 荧光标记法
荧光标记分为免疫荧光标记和非固 定荧光标记,Tang等(1989)研究证明, 非固定荧光探测法比免疫荧光探测法 灵敏度高,能够清晰地指示出肌动蛋 白丝在细胞内的排列。
免疫荧光法的原理
许多研究表明,肌动蛋白在进化中极 为保守,抗其他肌动蛋白的抗体,能有效 地与植物肌动蛋白结合,故用免疫荧光法 可以探 测植物细胞是否存在肌动蛋白。
注：细胞骨架的主要成员是微丝，微丝又称为肌动蛋白纤维，广泛存在于 真核细胞中。
运用此方法,以白花紫露草( T . fminensis) 雄蕊毛细胞作为显微注射材料结合共聚焦激 光扫描 显微镜 ( confo cal laser scanning microscope , CL SM ) 观察微丝结构, 结果显 示单体肌动蛋白荧光类似物注入到白花紫露 草( 开 放花朵的) 雄蕊毛细胞 的细胞质中,荧 光类似物被引入到细胞内几分钟之后便迅速 扩散到整个细胞质并渗入细胞质内的微 丝骨架结构中,形成发绿色荧光的微丝结构。
活体显微注射染色方法荧光类似物细胞化学 法是近几年发展起来的研究活体细胞内骨架系 统动态变化过程的有效方法。它通过标记细胞 骨架蛋白,并进一步将其引入活体细胞,通过细胞 骨架蛋白的 周转过程使骨架系统标记上荧光,从 而实现对活体细胞中细胞骨架动态过程的观察 。 鬼笔环肽可能引起细胞中肌动蛋白的进一步 聚合而造成了人为的假象,而肌动蛋白荧光类似 物的注射则可以较好地反映活体细胞中微丝骨 架的真实情况。但是显微注射法标记活体肌动 蛋白,技术上十分困难,从而成功率较低。
植物肌动蛋白
——方法技术篇
3.1 高等植物肌动蛋白的鉴定
★ 重酶解肌球蛋白标记法 ★ 荧光标记法 ★ 活体显微注射染色方法 ★ 高等植物肌动蛋白研究方法的进步
3.1.1 重酶解肌球蛋白标记法
重酶解肌球蛋白标记法即肌 球蛋白经胰蛋 白酶消化后便分解为大小2个片段,大片段即为 重酶解肌球蛋白,它能特异结合到肌动蛋白丝上 形成箭头状结构。该方法说服力强，被人们广 泛采用，Condeelis( 1974 )就是采用这种方法, 证实高等植物花粉中存在肌动蛋白。
The new Zeiss Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)
3.2 高等植物肌动蛋白的分离 和纯化
在植物组织中，花粉是提取肌动蛋白 的最好材料之一，从植物中提取肌动蛋 白通常采用的方法有： Biblioteka BaiduDNaseⅠ亲和柱层析 ★阴离子交换及分子筛柱层析法
DNaseⅠ亲和层析法是从植物组织中分离纯化肌 动蛋白较合适的方法。花粉内含有丰富的孢粉素和 脂类等物质, 细胞质含水少, 采用将花粉破碎后经提 取和丙酮抽提, 将肌动蛋白溶液做成干粉, 再从干粉 中提取肌动蛋白, 经硫 酸铵分级分离、离子交换柱 层析。聚合解聚和 Sephacry S-200 柱层析，可以纯 化制备毫克以上有活性的肌动蛋白。但此方法花费 时 间长, 且所得到的肌动蛋白含有肌动蛋白结合 蛋 白( profilin)。此外,利用肌动蛋白可以与其单体结合 蛋白特异结合的特性及profilin的多聚脯氨酸亲和柱 层析法, 可以获得较大量高纯度、具有活性的肌动蛋 白。
细胞骨架系统（Cytoskeleton System）
3.1.4高等植物肌动蛋白研究方法的进 步
随着染色方法的改进,检测工具分辨率的提高，对高等植物肌动蛋白的精 细结构及变化动态可以愈来愈清晰地捕捉。原先用先固定再染色,而后发展 为非固定染色，现在已建立活体注射染色方法, 减少了生化处理对材料带来 的损坏, 能够清晰地指示出肌动蛋白丝在细胞内的排列。检测工具由激光共 聚焦激光扫描显微镜代替普通荧光显微镜 。 CLSM 是一种新发展起来的光学显微技术,在生物科学的研究中显示了 重要的作用。常规显微镜都有一个共同的缺陷,就是由于在整个视场内显微 镜都有一个共同的缺陷，就是由于在整个视场内样品各个焦深范围都被照 明,在焦点平面样品成像的同时，还叠加了模糊不清的背 景及前景象, 因此 严重地影响了像的清晰度及其反差。CLSM 则是以激光为光源, 分别在检 测 器前方和激光器前方的焦点平面设置共焦针孔( pinho le ) ，使被照明和被检 测的点位在同一焦点上 即成像镜( imag ing lenses )和聚光镜( condenser ) 是 共焦的。通过亮速点扫描和高效率的计算机图像处理, 便可得到清晰的像。 CL SM 能对完整样品甚至活样品进行直接的非侵入性( non-invasive) 无损断 层扫描成像， 即光学切片( optical sectioning ) 。还可以在不同角度对不同深 度样品成像, 从 而得到所观察目标的定位信息。用CLSM研究高等植物微丝 骨架的分布, 能够越来越清楚地研究肌动蛋白在高等植物细胞生命活动中的 作用。
重酶解肌球蛋白（heavy meromyosin，HMM） 轻酶解肌球蛋白（light meromyosin, LMM）
肌球蛋白可被胰蛋白酶分解成两种片断，分别称为轻酶解肌球蛋白(light meromyosin,LMM)和重酶解肌球蛋白(heavy meromyosin,HMM)。LMM 是一个双 股α螺旋，在电镜下呈棒状，和肌球蛋白一样能形成丝，但是它没有ＡＴＰ酶活性， 也不能与肌球蛋白结合。 HMM则与LMM完全不同,它是由一根较短的棒与一个双球的头部相连接构成的， 它可以被木瓜蛋白酶分裂成两个球形的亚片断（S1）和一个棒状的亚片断（S2）。 每一个S1片断含有一个ATP酶活性中心和一个肌动蛋白结合位点，而且肌球蛋白 轻链是与S1相连接的。
异硫氰酸四甲基罗丹明标记的鬼笔环 肽（Fi- Phalloidin ）能渗入植物细胞内 特异结合肌动蛋白丝放出荧光。鬼笔环 肽只与肌动蛋白丝结合，不与单体的肌 动蛋白结合。 Tang等研究表明，非固定荧光探测法 比免疫荧光法灵敏度高，能够清晰地指 示出肌动蛋白丝在细胞内的排列。
鬼笔环肽的分子结构
3.1.3 活体显微注射染色方法
方法篇（完）
——朱圣淋