功能蛋白质组学研究方法.ppt

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根据片基材料的不同可以分为: 膜芯片、玻璃芯片和液相芯片等。
目前常用蛋白质芯片有: 1. SELDI-TOF-MS蛋白质芯片 2. 抗体芯片 3. 靶蛋白质芯片 4. 液相蛋白质芯片
SELDI-TOF-MS蛋白质芯片
表面加 强激 光 解 吸电 离- 飞行 时间 质谱(surface
enhanced laser desorption /ionization time of
酵母双杂交系统
• 酵母双杂交技术由Fields等人于1989年提出。 • 该技术利用了酵母转录因子GAL4性质,GAL4包
括两个彼此分离但功能上必需的结构域,一个是 位于N端1-174位氨基酸残基区段的DNA结合 (DNA binding domain,DNA-BD),另一个是位于C 端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域 (Activation domain, AD)。
靶蛋白质芯片
主要用于蛋白质相互作用研究、蛋白表达 研究和小分子蛋白结合研究。
靶蛋白质的获得: 1.化学合成; 2.基因工程表达蛋白质并进行纯化点样制作芯片; 3.将活的生物体(如细菌、酵母等)在芯片上原位表
达蛋白质(living芯片) 。 4.将核酸固定在芯片介质中,然后利用不依赖细胞
的体外蛋白表达系统,在原位合成靶蛋白。
包括筛库过程中自发升高的BD-x融合蛋白自我激 活导致的假阳性,在BD-x融合蛋白不存在的情况 下AD-Y融合蛋白单独激活报告基因,导致的假阳 性,以及酵母中其他蛋白质作用引起的假阳性等。
因此,虽然双杂交系统可筛选出大量蛋白
质相互作用,但其中部分蛋白质在生理状态 下可能不发生相互作用,双杂交只是反映蛋 白质间能发生作用的可能性,这种可能性还 必须经过其他实验验证,尤其要与生理功能 研究相结合,否则可能会误入歧途。
如:抗体库的构建
表达载体噬菌粒pCANTAB 5E
噬菌体展示技术的应用
1. 蛋白质相互作用的研究
有研究利用T7噬菌体展示筛选系统,以丝裂原 活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路中p38作 为靶蛋白,筛选了与其有结合关系的多肽或蛋 白,得到了46个编码蛋白的序列,在这些蛋白 中有激酶、转录因子、细胞骨架相关蛋白和离 子通道相关蛋白等。
液相蛋白质芯片
是一种新型的、高度灵活的多元蛋白质研究平台,可 以适用于蛋白质组研究、临床研究和药物研究中的各 种蛋白质分析。
• 液相芯片体系由许多不同的小球体为主要基质,每种 小球体上固定有不同的探针分子,将这些小球体悬浮 于一个液相体系中,就构成了一个液相蛋白质芯片系 统。在液相系统中,为了区分不同的探针,在பைடு நூலகம்形基 质的制造过程当中,掺入了两种不同的红色分类荧光, 根据这两种红色分类荧光的比例不同(色彩编号),区 分不同的探针。
功能蛋白质组学
功能蛋白质组学是指对蛋白质间、蛋白质 与 DNA/RNA 间的相互作用的研究。以细 胞内与某个功能有关或某种条件下的一群 蛋白质为主要研究内容, 由此建立细胞内 外信号传递的复杂网络。
• 蛋白质芯片技术 • 噬菌体展示技术 • 酵母双杂交系统
蛋白质芯片
蛋白质芯片是将大量蛋白质分子按预先设置的排 列固定于一种载体表面,形成微阵列,根据蛋白 质分子间特异性结合的原理,构建微流体生物化 学分析系统,以实现对生物分子的准确、快速、 大信息量的检测。
• 蛋白质芯片反应结果的检测
荧光标记是芯片息采集中使用最多也是最 成功的报告标志。对杂交反后的芯片上各 个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片 扫描仪和相关软件进行分析,将荧光信号 转成数据,即可获得有关生物信息。
蛋白质芯片分类
根据固定介质的不同,可以分为两大类: 化学型蛋白质芯片(SELDI-TOF-MS蛋白质芯片) 生物型蛋白质芯片(如抗体、受体、配体等);
3 在疾病的治疗和致病机理方面的研究
有研究以HCV非结构蛋白NS4A作为固相靶分子, 用T7噬菌体表面展示的人肝细胞cDNA文库进行5 轮筛选后,确定了与HCV非结构蛋白NS4A结合 的是肝细胞蛋白丝裂原激活蛋白激酶(MAPK) 激活蛋白激酶5(MAPKAPK5),为进一步研究 HCV的致病机制奠定了基础。
• 该系统中转录激活的条件是蛋白质作为一 个整体起作用。
• 分别经分子克隆技术在同一细胞中表达的BD和 AD多肽不会彼此间发生作用,BD和AD分别可以 同其他蛋白质X或Y结合形成融合蛋白,如果X,Y 之间可以形成蛋白-蛋白复合物,使GAL4两个结构 域重新构成AD和BD成为一体,就可以启动特异基 因序列的转录。
将待测样品滴到芯片表面(血清、尿液、分泌液、 细胞裂解液等),通过亲合作用样品中的某些蛋白 质被吸附到芯片的固相基质表面上,用缓冲液洗 去芯片上的杂质蛋白和其他污染物,然后在芯片 上 加 入 能 量 吸 收 分 子 ( energy absorbing molecular,EAM),芯片干燥后,在真空管中用激 光轰击,蛋白质在吸收能量后被解析发生离子化, 在电场力作用下脱离芯片表面, 被离子检测器所 检测。检测结果经过软件分析处理后, 可绘制出 质谱图,显示相关蛋白质的分子量、含量等信息。
抗体芯片
抗体芯片主要研究在不同生理或病理状态下蛋白质 水平的量变。微型化、集成化、高通量化是抗体芯片重 要特点。
芯片上排列了许多已知蛋白质的单克隆抗体,这些 单克隆抗体对应的蛋白质(抗原)都是细胞结构和功能 上十分重要的蛋白,涉及信号传导、肿瘤、细胞周期调 控、细胞结构、细胞凋亡等广泛的领域。
抗体芯片检测的结果不是蛋白质的绝对含量而是目 的蛋白质在两个样品之间的相对峰度。
GAL4重建后激活转录模式图
AD
BD UAS X
报告基因(LacZ)
Y
• 一般地,将BD-X的融合蛋白称作诱饵(bait), X往往是已知蛋白,AD-Y称作猎物(prey),能 显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基 因,通过对报告基因的检测,反过来可判断诱 饵和猎物之间是否存在相互作用。
作为一种分析蛋白质与蛋白质之间相互作
用的简便而有效的研究体系,酵母双杂交的 最大的优点是不需要分离、纯化蛋白质,整 个过程只是对核酸进行操作。
酵母双杂交系统应用
它主要应用在以下几个方面: 1.用于验证通过其他方法发现的蛋白质之间 是否有相互作用; 2.确定已知有生理作用的蛋白间的作用位点 或结构域; 3.筛选文库以得到与已知蛋白质存在特异相 互作用的候选蛋白质。
• T7噬菌体展示文库可以展示相当部分表达的蛋白 质,甚至可以保持蛋白的一定构象。因此,该系 统最大程度地再现了细胞内的真实情况,所筛选 出的结合蛋白与自然状态较为接近。目前已被成 功应用于蛋白质-蛋白质、抗原-抗体以及DNA-蛋 白质之间作用的研究,为功能基因组学的研究提 供了一种新的方法。
• cDNA库是在噬菌体衣壳蛋白的基因中插入 从某些组织或细胞中抽提出来的mRNA的互 补DNA片段,从而表达该组织或细胞的各 种蛋白于噬菌体的表面。
• DNA-BD能够识别GAL4效应基因的上游激 活序列 (Up stream activating sequence, UAS),并与之结合,而AD则通过与转录机 制中的其他成分之间的作用,启动UAS下游 的基因进行转录。DNA-BD和AD单独作用 均不能激活转录反应,只有当二者在空间上 充分接近并呈现完整的GAL4转录因子活性 时,方可激活UAS下游启动。
酵母双杂交体系的新发展
• 传统酵母双杂交体系的改建
根据酵母的营养缺陷,发展了多重筛选机制 表达载体构建的改进 将蛋白的相互作用场所从核内移至细胞膜
• 哺乳动物细胞双杂交系统 • 三杂交系统的产生:用于研究蛋白和RNA
间的相互作用。
• 可同时固定各种蛋白质、多肽、核酸等生物分子,可 以对同一个样品中的多个不同的分子同时进行检测。
噬菌体展示技术
自1985年Smith G P等创建噬菌体展示技术,其 原理是:以经过改建的噬菌体为载体,把外源基 因插入噬菌体外壳蛋白基因PⅢ区或PⅧ区,从而 使表达的外源肽或蛋白质展示在噬菌体的表面, 并使表达产物保持良好的空间构象。进而通过亲 和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体, 最终获得具有特异结合性质的多肽/蛋白质。
flight-mass spectrometry,SELDI-TOF-MS )蛋白质 芯片由3部分组成:蛋白质芯片、阅读器和分析 软件。 蛋白质芯片是核心部分,芯片上固定的介质可以 是阴离子、阳离子、疏水性、亲水性、金属等, 根据蛋白质的化学特性而有选择性地捕获特异的 蛋白质。
SELDI技术的基本原理:
假阳性分为两类:
一类是生物学上的假阳性
即蛋白质与蛋白质的相互作用在酵母细胞 中发生,但是在其生物体细胞内并不发生相 互作用,这主要是因为两种蛋白不同时表 达或者二者根本不在同一组织中,这种假 阳性,我们如果对所研究的蛋白质的生物学 特性没有深入了解的话,是很难排除的。
另一类是技术上的假阳性
即由于双杂交技术上的局限而鉴定出的蛋 白质与蛋白质间的相互作用。
酵母双杂交系统的局限性
1.并非对所有蛋白质都适用
双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于核内,而 许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工,如糖基 化,二硫键形成等,这些反应在核内无法进行。另外, 有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其它非酵母蛋 白的辅助,这限制了某些细胞核外蛋白和细胞膜受 体蛋白等的研究。
2.易发生假阳性
这一技术有效地实现了基因型和表型的体外转
换,即在二者之间架起了桥梁,使得研究者完 全可以在分子克隆的基础上,有效地实现蛋白 质构象的体外控制,从而可以在体外获得具有 良好生物学活性的表达产物。
• Navagen公司用T7噬菌体构建的各种cDNA表达 文库,将外源基因序列插入到编码T7噬菌体外壳 蛋白基因中,插入片段基因长度可在300 bp ~3 000 bp之间,所表达的多肽或蛋白质以与噬菌体 外壳蛋白融合的形式展示在噬菌体表面。
2. 在筛选和制备多肽药物方面的研究及应用
随机噬菌体展示多肽文库:一组随机编码序列或基 因群插入噬菌体载体进行表达及展示时,就形成噬 菌体展示文库,在文库中,每个噬菌体粒子只展示 一种序列的外源肽链,不同噬菌体粒子展示不同序 列的外源肽链。用一定功能的靶分子筛选,可以简 便快速地获得与靶分子具有强亲和力和特异性的小 肽或新型蛋白,这些肽段可以作为侯选药物进行开 发。
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