蛋白质组学基本原理ppt课件
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蛋白质组学基本原理
蛋白质组学基本原理
目录
蛋白质组学概述 蛋白质的组成与结构 蛋白质的分离与鉴定技术 蛋白质组学研究方法 蛋白质组学在生物医学中的应用 蛋白质组学的发展前景与挑战
01
CHAPTER
蛋白质组学概述
定义与特点
定义
蛋白质组学是一门研究细胞、组织或生物体中所有蛋白质及其功能的学科。
特点
具有全局性、动态性和功能性，关注蛋白质的表达、修饰和相互作用，揭示生命活动的奥秘。
蛋白质的结构
蛋白质的结构决定了其稳定性，进而影响其功能。
稳定性
蛋白质的功能位点通常位于其特定的三维空间结构中，如酶的活性位点、抗原决定簇等。
活性位点
蛋白质的结构决定了其与其他分子或细胞器的相互作用方式，从而影响其功能。
相互作用
ห้องสมุดไป่ตู้
蛋白质的结构与功能关系
03
CHAPTER
蛋白质的分离与鉴定技术
利用蛋白质带电性质的不同，通过电泳或离子交换等方法进行分离。
抗体检测
利用特异性抗体对蛋白质进行检测和识别，常用于蛋白质印迹和免疫分析。
序列比对
将鉴定出的蛋白质序列与数据库中的已知序列进行比对，确定蛋白质的种类和名称。
生物信息学分析
结合计算机技术对蛋白质序列、结构和功能进行预测和分析。
根据实验需求和样本性质，选择合适的蛋白质分离和鉴定技术，综合运用多种方法以提高蛋白质鉴定的准确性和可靠性。
液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）
通过液相色谱分离蛋白质，再通过质谱技术鉴定蛋白质，具有高灵敏度和高分辨率的特点。
要点一
要点二
表面增强激光解吸/电离质谱（SELDI-TOF-MS）
通过特定的蛋白质芯片富集蛋白质，再通过激光解吸电离技术检测蛋白质，用于蛋白质表达谱的研究。
目录
蛋白质组学概述 蛋白质的组成与结构 蛋白质的分离与鉴定技术 蛋白质组学研究方法 蛋白质组学在生物医学中的应用 蛋白质组学的发展前景与挑战
01
CHAPTER
蛋白质组学概述
定义与特点
定义
蛋白质组学是一门研究细胞、组织或生物体中所有蛋白质及其功能的学科。
特点
具有全局性、动态性和功能性，关注蛋白质的表达、修饰和相互作用，揭示生命活动的奥秘。
蛋白质的结构
蛋白质的结构决定了其稳定性，进而影响其功能。
稳定性
蛋白质的功能位点通常位于其特定的三维空间结构中，如酶的活性位点、抗原决定簇等。
活性位点
蛋白质的结构决定了其与其他分子或细胞器的相互作用方式，从而影响其功能。
相互作用
ห้องสมุดไป่ตู้
蛋白质的结构与功能关系
03
CHAPTER
蛋白质的分离与鉴定技术
利用蛋白质带电性质的不同，通过电泳或离子交换等方法进行分离。
抗体检测
利用特异性抗体对蛋白质进行检测和识别，常用于蛋白质印迹和免疫分析。
序列比对
将鉴定出的蛋白质序列与数据库中的已知序列进行比对，确定蛋白质的种类和名称。
生物信息学分析
结合计算机技术对蛋白质序列、结构和功能进行预测和分析。
根据实验需求和样本性质，选择合适的蛋白质分离和鉴定技术，综合运用多种方法以提高蛋白质鉴定的准确性和可靠性。
液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）
通过液相色谱分离蛋白质，再通过质谱技术鉴定蛋白质，具有高灵敏度和高分辨率的特点。
要点一
要点二
表面增强激光解吸/电离质谱（SELDI-TOF-MS）
通过特定的蛋白质芯片富集蛋白质，再通过激光解吸电离技术检测蛋白质，用于蛋白质表达谱的研究。
蛋白组学概论ppt课件
52
53
肽质谱指纹图在数据库中匹配 不成功的可能原因
样品量太少，PMF图信噪比太低，输入库中搜寻的数据质 量不好。 2-DE 胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质 ，所获
PMF图实际上是两个以上蛋白质的混合图。
操作中角蛋白或其他蛋白质的污染 蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载
32
33
第二向SDS-PAGE电泳
垂直板电泳
水平超薄胶电泳
34
35
2-DE技术的缺点
极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极 大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质 用此种技术难于有效分离。 胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联 用实现自动化。
36
新型非凝胶技术
液相色谱法 liquid chromatography，LC 毛细管电泳 capillary electrophoresis，CE
40
41
42
（三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定
传统方法：蛋白质微量测序
氨基酸组成分析
43
新型蛋白质鉴定技术 —— 质谱（MS）法
基本原理：蛋白质分子离子化后，根据离 子间质量与电荷比值（ m/z ）的差异来分离 并确定样品的分子量。 一台质谱仪一般有进样装置、离子化源、 质量分析器、离子检测器和数据分析系统组 成。
38
39
多维液相色谱技术
（LC/LC-MS/MS）
最常用的是离子交换色谱-反相液相色谱联用
多维蛋白质鉴定技术(multidimensional protein identification technology, MudPIT)
把不同分离模式的色谱柱串联在一根色谱柱中， 对蛋白质进行分离的定性定量技术。
53
肽质谱指纹图在数据库中匹配 不成功的可能原因
样品量太少，PMF图信噪比太低，输入库中搜寻的数据质 量不好。 2-DE 胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质 ，所获
PMF图实际上是两个以上蛋白质的混合图。
操作中角蛋白或其他蛋白质的污染 蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载
32
33
第二向SDS-PAGE电泳
垂直板电泳
水平超薄胶电泳
34
35
2-DE技术的缺点
极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极 大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质 用此种技术难于有效分离。 胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联 用实现自动化。
36
新型非凝胶技术
液相色谱法 liquid chromatography，LC 毛细管电泳 capillary electrophoresis，CE
40
41
42
（三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定
传统方法：蛋白质微量测序
氨基酸组成分析
43
新型蛋白质鉴定技术 —— 质谱（MS）法
基本原理：蛋白质分子离子化后，根据离 子间质量与电荷比值（ m/z ）的差异来分离 并确定样品的分子量。 一台质谱仪一般有进样装置、离子化源、 质量分析器、离子检测器和数据分析系统组 成。
38
39
多维液相色谱技术
（LC/LC-MS/MS）
最常用的是离子交换色谱-反相液相色谱联用
多维蛋白质鉴定技术(multidimensional protein identification technology, MudPIT)
把不同分离模式的色谱柱串联在一根色谱柱中， 对蛋白质进行分离的定性定量技术。
蛋白质组学及技术介绍PPT通用课件.ppt
拖尾"point streaking") 。
3.二相SDS-PAGE
丙烯酰胺/甲叉双丙烯 酰胺溶液
分离胶缓冲液
10%（w/v）过硫酸铵 溶液
（30.8%T，2.6%C）：30%（W/V）丙烯酰胺和 0.8%甲叉双丙烯酰胺的水溶 液。将 300g 丙烯酰胺和 8g 甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离
研究 内容
蛋白质的研究内容主要有两方面：
1、结构蛋白质组学：主要是蛋白质表达模型的研究，包括蛋白质氨基酸序列 分析及空间结构的解析种类分析及数量确定; 2、功能蛋白质组学：主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质功能及蛋白 质间的相互作用。
研究 内容
蛋白质组学可分为三个主要领域： 1、蛋白质的微特性以供蛋白质的规模化鉴定和他们的后翻译饰； 2、“差异显示”蛋白质组学供蛋白质水平与疾病在广泛范围的有力应用比 较； 3、应用特定的分析技术如质谱法（包括串联质谱法、生物质谱法）或酵母 双杂交系统以及其他蛋白质组学研究新技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该方法所研究的蛋白均是在体内经过翻译后修饰的，并且是可 分离的天然状态的相互作用蛋白复合物，能够反映正常生理条件下的 蛋白质间相互作用
蛋白质相互作用
2、酵母双杂交系统：
该系统利用真核细胞调控转录起始过程中，DN A结合结构域(binding domain,BD)识别DNA上的特异序列并使转录激活结构域(activation domain, AD)启动所调节的基因的转录这一原理，将己知蛋白X和待研究蛋白Y的基 因分别与编码AD和BD的序列结合，通过载体质粒转入同一酵母细胞中表 达，生成两个融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用，则AD和BD在空间上 接近就能形成完整的有活性的转录因子，进而启动转录，表达相应的报告 基因;反之，如果X和Y之间不存在相互作用，报告基因就不会表达。这样， 通过报告基因的表达与否，便可确定是否发生了蛋白质的相互作用。
3.二相SDS-PAGE
丙烯酰胺/甲叉双丙烯 酰胺溶液
分离胶缓冲液
10%（w/v）过硫酸铵 溶液
（30.8%T，2.6%C）：30%（W/V）丙烯酰胺和 0.8%甲叉双丙烯酰胺的水溶 液。将 300g 丙烯酰胺和 8g 甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离
研究 内容
蛋白质的研究内容主要有两方面：
1、结构蛋白质组学：主要是蛋白质表达模型的研究，包括蛋白质氨基酸序列 分析及空间结构的解析种类分析及数量确定; 2、功能蛋白质组学：主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质功能及蛋白 质间的相互作用。
研究 内容
蛋白质组学可分为三个主要领域： 1、蛋白质的微特性以供蛋白质的规模化鉴定和他们的后翻译饰； 2、“差异显示”蛋白质组学供蛋白质水平与疾病在广泛范围的有力应用比 较； 3、应用特定的分析技术如质谱法（包括串联质谱法、生物质谱法）或酵母 双杂交系统以及其他蛋白质组学研究新技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该方法所研究的蛋白均是在体内经过翻译后修饰的，并且是可 分离的天然状态的相互作用蛋白复合物，能够反映正常生理条件下的 蛋白质间相互作用
蛋白质相互作用
2、酵母双杂交系统：
该系统利用真核细胞调控转录起始过程中，DN A结合结构域(binding domain,BD)识别DNA上的特异序列并使转录激活结构域(activation domain, AD)启动所调节的基因的转录这一原理，将己知蛋白X和待研究蛋白Y的基 因分别与编码AD和BD的序列结合，通过载体质粒转入同一酵母细胞中表 达，生成两个融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用，则AD和BD在空间上 接近就能形成完整的有活性的转录因子，进而启动转录，表达相应的报告 基因;反之，如果X和Y之间不存在相互作用，报告基因就不会表达。这样， 通过报告基因的表达与否，便可确定是否发生了蛋白质的相互作用。
蛋白质组学概述及其应用 ppt课件
笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
为什么要研究蛋白质？
DNA
mRNA
蛋白质
转录水平调控
翻译水平调控
翻译后水平调控
蛋白质
机体在特定生理或病理状态下所做出的调控不同，相同基因最终表达出 不同的蛋白质。蛋白质是基因功能的实施者，因此对蛋白质结构，定位 和蛋白质-蛋白质相互作用的研究将作为阐明生命现象的本质提供直接的 基础。
ppt课件
9
ppt课件
10
基于质谱的蛋白质组学方法
ppt课件
11
ppt课件
12
ppt课件
13
ppt课件
14
ppt课件
15Leabharlann pt课件16数据和信息生物学分析
ppt课件
17
ppt课件
18
ppt课件
19
多组学分析
ppt课件
20
究目的，用于建立细胞内信号转导的网络图谱并解释某些特定蛋白的表达对细胞的作用。 3、功能蛋白质组学： 研究在不同生理和病理条件下，细胞中各种蛋白质之间的相互作用
关系及其调控网络，以及蛋白质的转录和修饰
ppt课件
6
ppt课件
7
ppt课件
8
修饰蛋白质组学：可以定位修饰位点﹑定量化学修饰蛋白及检测新型结构
蛋白质组学概述及其应用
ppt课件
2017.05.16 1
为什么要研究蛋白质？ 通过DNA或RNA水平的测量不能可靠地预测蛋白质丰度。
ppt课件
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
为什么要研究蛋白质？
DNA
mRNA
蛋白质
转录水平调控
翻译水平调控
翻译后水平调控
蛋白质
机体在特定生理或病理状态下所做出的调控不同，相同基因最终表达出 不同的蛋白质。蛋白质是基因功能的实施者，因此对蛋白质结构，定位 和蛋白质-蛋白质相互作用的研究将作为阐明生命现象的本质提供直接的 基础。
ppt课件
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ppt课件
10
基于质谱的蛋白质组学方法
ppt课件
11
ppt课件
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ppt课件
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15Leabharlann pt课件16数据和信息生物学分析
ppt课件
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ppt课件
19
多组学分析
ppt课件
20
究目的，用于建立细胞内信号转导的网络图谱并解释某些特定蛋白的表达对细胞的作用。 3、功能蛋白质组学： 研究在不同生理和病理条件下，细胞中各种蛋白质之间的相互作用
关系及其调控网络，以及蛋白质的转录和修饰
ppt课件
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8
修饰蛋白质组学：可以定位修饰位点﹑定量化学修饰蛋白及检测新型结构
蛋白质组学概述及其应用
ppt课件
2017.05.16 1
为什么要研究蛋白质？ 通过DNA或RNA水平的测量不能可靠地预测蛋白质丰度。
ppt课件
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？
蛋白质组学-PPT课件
iTRAQ 结构
iTRAQ包括三部分：报告部分、肽反应部分、平 衡部分。 1、报告部分：有八种，因此iTRAQ可同时标记8 组样品。 2、肽反应部分：能与肽N端及赖氨酸侧链发生共 价连接而标记上肽段，几乎可以标记所有蛋白质。 3、平衡部分：保证iTRAQ标记的同一肽段的质荷 比相同。
辉骏生物：fitgene/
辉骏生物：fitgene/
免费服务热线：400-699-1663
2：蛋白质组学研究内容
2.1：蛋白质的表达模式 （1）生理、病理或不同发育状态下蛋白质组表达差异蛋白质信息库。 （2）蛋白质及其组成质点的分离、分析、鉴定。 2.2：蛋白质的功能模式 （1）蛋白质结构分析。 （2）蛋白之间相互作用，翻译后修饰，细胞定位等。
3: 化学标记法—iTRAQ
简介：
iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基及赖氨酸侧链氨基连接的胺标记同重元素。在质谱图 中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在串联质谱 中，信号离子表现为不同质荷比(113-119，121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以 鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。
辉骏生物：fitgene/
免费服务热线：400-699-1663
1：双向电泳
基于2D-PAGE 的经典定量分 析方法。 1、样品准备 和定量：抽提 对照组和各种 不同实验组的 蛋白质。 2、蛋白质分 离：蛋白质经 过2D-PAGE分离 后染色（银染、 考染等）。 3、蛋白质的 定性与定量分 析：通过与对 照组相Image Master 7.0分 析出实验组中 差异点，质谱 鉴定差异点蛋 白质,同时应用 软件分析出其 表达量的变化。
辉骏生物：fitgene/
蛋白质组学ppt
电转印到膜上
图像分析
Western blot检测
选择目标蛋白斑点，胶内酶切
质谱分析（MALDI/TOF或ESI/MS/MS）
获得肽质量指纹谱或肽序列标签
数据库检索鉴定蛋白质
Western blot、 免疫组化验证 蛋白质并确定 其定位
根据氨基酸序 列合成寡核苷 酸探针，克隆 基因
蛋白质功能研究，包 括蛋白质生物活性、 抗体制备、蛋白质相 互作用等方面
7
3.2.3 蛋白质组研究技术
一、双向凝胶电泳技术 二、液相色谱技术 三、生物质谱技术与蛋白质鉴定 四、蛋白质相互作用的研究技术
8
一、双向凝胶电泳技术 （一）2-DE的概念 two dimensional gel electrophoresis
• 2-DE是指第一向的固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）等电聚焦电泳与第二向SDSPAGE组成的分离系统，也称双向聚丙烯酰胺凝 胶电泳，简称2-DE。等电聚焦电泳是基于蛋白质 等电点（pI）的差异进行分离，SDS-PAGE则是 根据蛋白质分子量（Mw）的不同进行分离。
22
（三）双向凝胶电泳图谱的计算机分析 • 细胞或组织样本经2-DE分离后，得到一张含有成
百上千个蛋白质斑点的凝胶电泳图谱。凝胶图谱 分析包括确定蛋白质斑点的位置、大小、染色深 浅、pI和分子量；图谱间的比较、差异蛋白质斑 点的确定；图谱质量的优化、数据的储存管理、 数据库分析等内容。借助先进的计算机技术和生 物信息学工具，能客观、有效地从电泳图谱中提 取到有价值的信息。
记等
19
（一）考马斯亮蓝染色
考马斯亮蓝染色是最常用的蛋白质染色 方法。考马斯亮蓝R-250化学名为三苯基甲 烷，R代表红蓝色。考马斯亮蓝R-250与蛋 白质的碱性基团可逆结合，染色线性范围 可达1～55μg，灵敏度为30～100ng蛋白质 。考马斯亮蓝染色的最大优点是染色重复 性好，操作简便，不影响后续的质谱鉴定 ，灵敏度比常用的氨基黑高100倍，但低于 银染色和荧光染色，不能满足对低丰度蛋 白质的检测要求，样品用量大。
微生物蛋白质组学ppt课件
■ 互补与互助
— 在后基因组时代，蛋白质组研究和基因组研究依然是形影相随的两个重要领 域。基因组与蛋白质组之间既为互相补充又能互相帮助。
— mRNA是介于基因和蛋白质之间的中间产物。因为mRNA既是基因的产物， 又比蛋白质要容易分析，所以，研究mRNA的表达模式也是了解基因组和蛋 白质组的一个重要途径。由此专门形成了一个新的研究领域：转录组。研究 转录组的主要手段是基因芯片技术、SAGE（基因表达序列分析）技术。
羟肉桂酸）中，基质吸收激光提供的能量而蒸发，携带部分样品分子进入 气相，并将一部分能量传递给样品分子使其离子化。
飞行时间质谱（TOFMS）由离子源（S）引出极、漂移区（D）和检测器组成。 当离子在离子源内形成后在离子源内电场E的作用下进入无场漂移区。在理想状 态下，所有进入漂移区的离子具有相同的动能（KE）. 测定离子在漂移区内的飞行时间即可计算出它的质荷比。
蛋白质分离 技术双Fra bibliotek电泳和差异凝胶电泳
■ 双向电泳（Two dimension elctrophresis,2DE）是根据不同蛋白质 等电点和分子量的不同利用第一向等电聚焦和第二向SDS-PAGE电泳 将蛋白质混合物中的各种蛋白分离开。 ■ 差异凝胶电泳（differential gel electrophoresis,DIGE）是在2DE基 础上建立的蛋白质分离技术。该方法将待比较的两个样品蛋白质分别 用不同的荧光染料(Cy2、Cy3、Cy5)进行标记后，等量混合再进行双 向电泳。由于荧光染料的发光波长不同，可以在一块凝胶上检测两个 样品，并通过蛋白点不同荧光信号间的比率确定蛋白量的差异。
离子源
引出极 漂移管D
压加 速 电
＋ ＋
＋
S
D
蛋白质和蛋白质组学PPT
❖生物信息学
12
蛋白组研究的三个主要步骤：
Separation of individual proteins by 2-D polyacrylamide gel electrophoresis (2-D PAGE)
Identification by mass spectrometry or Nterminal sequencing of individual proteins recovered from the gel
Storage, manipulation, and comparison of the data using bioinformatics
13
蛋白组学研究过程
成像 Imaging
Sample
样品
Sample Prep
2-D GELS
SSWWIISSS-PPRROOTT/ / TTrrEMMBBLL
基因组
转录组
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
蛋白组
The study of proteins expressed by genomes Completion of the sequencing of the 1st draft of human genome
indicates there are approximately 250,000 proteins in the human genome Only 2-5% of proteins in human genome have been identified
MR et al 1997)
❖ 1994年Williams提出测定有机体的基因组所表达的全部蛋白 ❖ 1995年Wilkins正式提出Proteome一词由一个细胞或一个组织的基因
12
蛋白组研究的三个主要步骤：
Separation of individual proteins by 2-D polyacrylamide gel electrophoresis (2-D PAGE)
Identification by mass spectrometry or Nterminal sequencing of individual proteins recovered from the gel
Storage, manipulation, and comparison of the data using bioinformatics
13
蛋白组学研究过程
成像 Imaging
Sample
样品
Sample Prep
2-D GELS
SSWWIISSS-PPRROOTT/ / TTrrEMMBBLL
基因组
转录组
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
蛋白组
The study of proteins expressed by genomes Completion of the sequencing of the 1st draft of human genome
indicates there are approximately 250,000 proteins in the human genome Only 2-5% of proteins in human genome have been identified
MR et al 1997)
❖ 1994年Williams提出测定有机体的基因组所表达的全部蛋白 ❖ 1995年Wilkins正式提出Proteome一词由一个细胞或一个组织的基因
蛋白质组学PPT课件
功能蛋白质组学 结构蛋白质组学
.
11
人类蛋白质组学研究进展
2001年成立国际人类蛋白质组组织（HUPO）， 2003.12.15启动两个首批行动计划 1.人类肝脏蛋白质组计划（HLPP）由中国军事医学科学
院副院长贺福初院士领导，16国80多个实验室参加。 中国第一次领导重大国际协作计划。 2. 人类血浆蛋白质组计划（HPPP）由美国科学家牵头， 13国47个实验室参加。
双向电泳后的凝胶
经染色后蛋白呈现二维
分布图： 水平方向反映出蛋
白在pI上的差异， 垂直方向反映出它
聚焦后凝 胶放置在 SDS凝胶 上，进行 第二向电 泳
们在分子量上的差别。
第二向电泳： SDS-PAGE
pH9
.
pH9
pH3
分子量大 分子 量小
pH3
18
(1)等电聚焦 凝胶电泳 （ IFE）
利用载体两 性电解质在电场 作用下沿电场方 向在凝胶内形成 一个连续而稳定 的pH梯度。
根据一定的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混 合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共 价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方 式生成的IPG不会发生电渗作用，因而可以进行特别稳 定的IEF分离达到真正的平衡状态。
.
5
第一节 蛋白质组及蛋白质组学基本概念
.
6
什么是蛋白质组？
蛋白质组(proteome)：
PROTEOME = PROTE in +genOME Proteins expressed by a genome.
是指“特定细胞、组织乃至机体作为一个 生命单元中所有蛋白质的集合，即生命体中携 带的基因信息在某一时段所表达的全部蛋白质。
蛋白组学PPT课件
为主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学
作为研究生命现象的手段和方法。（差异表达
的蛋白质组）
.
7
蛋白质组学研究的范围
蛋白质的表达模式 蛋白质翻译后修饰研究 蛋白质-蛋白质相互作用的研究
.
8
二、蛋白质组学的研究方法
差异蛋白组学
.
9
生物学问题 的提出
实验模型 的设计
实验组和对照组 样品的制备
优点: 易获得 缺点: 这些细胞系从组织中分离出来并经体 外培养后蛋白质会发生许多变化
.
13
（2） 外科手术切除的肿瘤组织
优点: 来源较为方便 缺点: 整个组织包括基质，纤维原细胞，免疫 细胞等，组织匀浆困难，不易分离总蛋白而蛋 白质组研究需要的通常是单一的细胞类型。
.
14
（3）以激光捕获显微切割（ LCM）肿瘤 细胞
感兴趣 蛋白点 的切取
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 图像扫描和初步分析
胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析
蛋白信息的 初步获得
质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现
.
其它实验
的进一步
验证
10
第一步 、蛋白质分离 蛋白质组分析的首要要求
将来自于全细胞、组织或生物体中所包含 的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测 和分析 。
LCM是直接从冰冻或石蜡包埋肿瘤组织切片中 获取细胞。它是用乙烯醋酸盐聚合体膜覆盖在被 选择的细胞上，然后用红外激光熔化膜，这时膜 与组织在目标位置牢固结合，当膜被提起时，仅 目的细胞留在膜上。
优点：能准确切取肿瘤细胞
缺点：需昂贵的仪器
.
15
第二步、蛋白质的分离
二维色谱 毛细管电泳 双向电泳(2DE)
蛋白质组学PPT课件
蛋白质组定义
1，基因组表达的全部蛋白质。 2，在一种细胞/组织内存在的全部蛋白 质。
Proteome
• 1994 M.Wilkins and K.W.Williams
•
Macquarie University in Sydney
• Total Proteins Complement of a Genome
环境
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
REAL COMPLEXITY…
IS IN CELLULAR ROTEOMES • BEYOND THE GENOME… • Tissue Specific Expression • Alternate Splicing, (1/3 of all genes) • Post-Translational Modifications
Functional
Proteomics
• During human development, cell express different proteins
• Normal and cancer cells express different proteins
• Cell treated with and without drug express different proteins
– Types and Level:
– Signal Sequence cleavage – Glycosylation
– Phosphorylation – Farnylation – Isoprenylation – Acetylation
• All combine > 100-1000 fold increase in complexity
蛋白质组学总结ppt课件
如有可能，可加入强变性剂：
8 mol/L 尿素、 10% TCA 或 2% SDS。
但在上述条件时，仍有些蛋白酶保持一定活性，所以 需要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。
13
四、通过沉淀分离蛋白 分离策略： 沉淀蛋白质，使之与其它成份分开，再重悬溶解蛋白 质。 附带作用： 浓缩较稀的样品（如植物、尿液等）。 注意： 某些蛋白会由于重悬造成一定的丢失。
11
二、剧烈的裂解方法 用于难以破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有 坚硬细胞壁的细胞，比如酵母。 1）超声裂解法。 2）弗氏压碎法。 3）研磨法。 4）机械匀浆法。 5）玻璃珠匀浆法。
12
三、用蛋白酶抑制Байду номын сангаас防止蛋白裂解 细胞裂解，蛋白酶释放出来，必须加以抑制。
蛋白酶在低温下无活性，所以尽量在低温制备。
一个细胞内的全套蛋白质，反映特殊阶段、环境、状
态下细胞或组织在翻译水平的蛋白表达谱。
2
2、技术路线与相关技术
技术路线
蛋白提取 样品 酶切消化 蛋白混合物
双向电泳 蛋白图谱 肽段 数据库 酶切消化
肽段混合物 双向电泳
质谱分析 数据库检索 质谱数据
3
第二章 蛋白质组研究方法
蛋白质组的技术基础 （三大支撑技术）： 双向电泳（2-DE），可以分离数千种蛋白质。 生物质谱技术，精确测定多肽质量及序列。 计算机为基础的图像分析及相应数据库构建。
2 ）冻融裂解：用液氮迅速冷冻细胞 (1-2 min) ，随后在
37℃ 融化(1-2 min) ，反复几次。
10
3 ）去污剂裂解：主要用于组织细胞。含有去污剂的缓冲 液重悬细胞。 4 ）酶裂解法：裂解植物、真菌和细菌等有细胞壁的细胞。 等渗缓冲液含有某种酶：
8 mol/L 尿素、 10% TCA 或 2% SDS。
但在上述条件时，仍有些蛋白酶保持一定活性，所以 需要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。
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四、通过沉淀分离蛋白 分离策略： 沉淀蛋白质，使之与其它成份分开，再重悬溶解蛋白 质。 附带作用： 浓缩较稀的样品（如植物、尿液等）。 注意： 某些蛋白会由于重悬造成一定的丢失。
11
二、剧烈的裂解方法 用于难以破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有 坚硬细胞壁的细胞，比如酵母。 1）超声裂解法。 2）弗氏压碎法。 3）研磨法。 4）机械匀浆法。 5）玻璃珠匀浆法。
12
三、用蛋白酶抑制Байду номын сангаас防止蛋白裂解 细胞裂解，蛋白酶释放出来，必须加以抑制。
蛋白酶在低温下无活性，所以尽量在低温制备。
一个细胞内的全套蛋白质，反映特殊阶段、环境、状
态下细胞或组织在翻译水平的蛋白表达谱。
2
2、技术路线与相关技术
技术路线
蛋白提取 样品 酶切消化 蛋白混合物
双向电泳 蛋白图谱 肽段 数据库 酶切消化
肽段混合物 双向电泳
质谱分析 数据库检索 质谱数据
3
第二章 蛋白质组研究方法
蛋白质组的技术基础 （三大支撑技术）： 双向电泳（2-DE），可以分离数千种蛋白质。 生物质谱技术，精确测定多肽质量及序列。 计算机为基础的图像分析及相应数据库构建。
2 ）冻融裂解：用液氮迅速冷冻细胞 (1-2 min) ，随后在
37℃ 融化(1-2 min) ，反复几次。
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3 ）去污剂裂解：主要用于组织细胞。含有去污剂的缓冲 液重悬细胞。 4 ）酶裂解法：裂解植物、真菌和细菌等有细胞壁的细胞。 等渗缓冲液含有某种酶：
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2）蛋白质修饰谱：蛋白质修饰谱是鉴定蛋白质在何
处、怎样被修饰的。许多蛋白质翻译后的修饰控制 着蛋白质的靶向、结构、功能和转换。此外，许多 环境化学因素、药物、和内源化学因素可产生修饰 蛋白质的活性亲电体。 3）蛋白质网络谱： 蛋白质网络谱是在生物系统中测
定蛋白质之间相互作用的蛋白质组学方法。这些相
表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNAycg， 将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学
功能的充分发挥提供广阔的空间。
The identification of ESTs has proceeded rapidly, with approximately 52 million ESTs now available
应该有3000~15000种蛋白质具有成为药靶的可能性。 因此，可能有几千或上万种新的药物靶标将被发现，将是 功能基因组学有可能带来一笔巨大的科学和经济财富。
是没有类似的工具用于蛋白质分析。
1）没有PCR等价物。目前不可能有多肽分子以类 似于核苷酸通过PCR复制的方式复制。
第二，蛋白质不能专一地与互补氨基酸序列杂交。
第三，细胞中每一个蛋白质产物并不一定只有一种 分子实体。
因此，蛋白质组的分析需要一套不同于基因表达分析
的工具，能够对修饰和非修饰的蛋白质进行检测和 定量分析。
五、蛋白质组学的工具
四种重要工具的发展和结合使用给我们提供了灵
敏性和专一性较高的识别和鉴定蛋白质的方法。 1）数据库：蛋白质、EST（expressed sequence tags)、和基因组序列数据库共同提供了 生物表达全部蛋白质的完整数据库目录。 2）质谱（MS）：目前认为MS是肽序列分析中的
互作用决定蛋白质功能网络。
获 得：
阐释重要生命活动的分子机制，包括细胞周期、细胞
分化与发育、细胞凋亡、肿瘤发生与发展、环境反应与
调节，物种进化等。 医药靶分子寻找与分析，包括新型药物靶分子、 肿瘤恶性标志、人体病理介导分子、病原菌毒性成分 等。每种疾病与~10个基因相关；每个基因又与
3~10个蛋白质相关；人类主要的100~150种疾病，则
6. 以往的蛋白质研究只是针对生命活动中某一种或某几种
蛋白质，难以系统透彻地阐释生命活动的基本机制；
因此， 无论是从基因组计划的局限、还是蛋白质研究的 自身发展而言，大规模、全方位的蛋白质研究均是 势在必行。
蛋白质组及蛋白质组学的含义
Proteome : Protein +Genome （蛋白质组）
Genome:
一个细胞或一个生物体包含的所有遗传信息；
所有蛋白质的存在形式及其活动方式。
Proteome：一种细胞/组织/生物体某个时间段所包含的
Proteomics（蛋白质组学）：
研究蛋白质组的科学，
阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模 其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞 内定位、相互作用研究等,最终揭示蛋白质功能 网络。
第一讲：蛋白质组学基本原理
第一章
绪论
15 February 2001
一、蛋白质组研究的开端及蛋白质组含义
--2001年，人类基因组序列草图的完成，宣告了 “后基因组时代”的到来，其主体是功能基因组学
（functional genomics),而蛋白质是基因功能的执行体；
2. 人类基因组计划的完成并不表明人类基因组的所有基因
in public databases (e.g. GenBank 5/2008, all species)
六、蛋白质组学的应用范围
根据目前的实践，蛋白质组学包括三项主要应用： 1）蛋白质表达谱： 蛋白质表达谱是鉴定生物或细胞
特定状态下蛋白质的表达或药物、化学或物理刺激
下蛋白质的表达，获得蛋白质组图、蛋白质组成成 分鉴定、新型蛋白质发掘、蛋白质差异显示。
最新技术。MS数据为蛋白质鉴定提供了最有力和最
精确的方法。
3）对数据库中特定蛋白质序列与MS数据进行比对
的各种软件。 4）蛋白质的分析分离技术，2D-SDS-PAGE是最广 泛用于蛋白质组学的技术，蛋白质分辨率达到成千 上万种，完全可以用于组织与细胞中的大规模蛋白 质分离。
EST (Expressed Sequence Tag)表达序列标签
许多参与信号转导、转录因子调节和细胞周期控制
的蛋白质迅速转换，这是其活性调节的一种方式； 3. mRNA水平没有告诉我们相应蛋白质的调节状态， 蛋白质的活性和功能常有一些内源翻译后的改变，
也会因环境因素而改变。
三、蛋白质组学研究的内容
① 结构蛋白质组学： 主要研究蛋白质的氨基酸序列、三维结构的解析、 种类分析、数量确定等；蛋白质结构测定主要是 应用X-光衍射技术，蛋白质种类和数量测定主要是 应用双向电泳，蛋白质鉴定的手段是质谱法；
② 功能蛋白质组学： 研究蛋白质的功能， 确定蛋白质在亚细胞结构中的定位， 蛋白质-蛋白质的相互作用等。 蛋白质组学比较注重研究蛋白质类型与数量在
不同种类、不同时间和条件下的动态本质。
四、蛋白质组学对分析的挑战
用DNA微阵列和相关方
二、研究mRNA作为基因产物
基因微阵列（microarray)提供了细胞中大量 或全部基因表达的快速检测手段，然而从mRNA 水平不一定能预测细胞中相应蛋白质的水平。 因为： 1. 各种mRNA不同的稳定性和不同的翻译效率 能够影响新蛋白质的产生；
2. 蛋白质形成后在稳定性和转换速度上有很大不同，
EST(expressedsequencetags)是cDNA克隆的末端序列,平均长
度为300～500bp,称为表达序列标签,通常是从已有的cDNA文 库中随机取出几百到几千个克隆一次测序产生,一般使用载体 多克隆位点互补序列作为通用引物。一个EST代表生物体某种 组织在某一时期的一个表达基因
。采用生物信息学方法延伸
及间隔序列已完全确定； 3. 基因组计划即使已确定某生物基因组内的全部基因， 也不能确定哪些基因在何时、何地、以何种程度表达； 4. 生物的基因组只表达部分基因(30~80%)，表达的基因 类型及其表达程度随生物生存环境及内在状态的变化 而表现极大的差别；
5. 基因虽是遗传信息的源头,而蛋白质是基因功能的执行体