蛋白质组学主要研究技术
比较蛋白质组学研究常用方法
比较蛋白质组学研究常用方法蛋白质组学研究是一门关于生物体内所有蛋白质的研究，它在生物科学领域具有重要意义。
蛋白质组学研究的常用方法包括质谱法、二维电泳法和蛋白质芯片技术等。
下面将对这些方法进行详细比较。
质谱法是蛋白质组学研究中最常用的技术之一、它可以对生物样本中的蛋白质进行分离、鉴定和定量。
质谱法有两种主要类型：质谱-质谱联用（MS-MS）和质谱成像（MSI）。
质谱-质谱联用技术结合了质谱和质谱技术，可以对复杂的样本进行更深入的分析，同时还能确定蛋白质的化学结构和功能。
质谱成像技术则可以在样本表面上实时进行蛋白质定量和定位。
与质谱法相比，二维电泳法是另一种经典的蛋白质组学技术。
二维电泳法通过两个连续的电泳步骤将蛋白质在空间和pH梯度上进行分离。
第一次电泳通常使用等电聚焦电泳技术，根据蛋白质的等电点将其分离出来。
然后，使用SDS-电泳技术将蛋白质按照分子量进行分离。
二维电泳法具有高分辨率和高灵敏度的优点，但是它在分析大量样品时存在一定的局限性。
蛋白质芯片技术是一种新兴的蛋白质组学方法。
它通过将蛋白质分子固定在芯片表面上，使用流式细胞仪等设备对蛋白质进行高通量的鉴定和定量。
蛋白质芯片技术具有高灵敏度、高通量和高自动化性的特点，可以同时分析多个样本，因此在蛋白质组学研究中非常受欢迎。
除了上述常用方法外，还有一些其他的蛋白质组学研究方法。
例如，蛋白质亲和纯化技术可以通过结合靶蛋白质与其他蛋白质或配体来寻找特定蛋白质，并从中分离出目标蛋白质。
蛋白质相互作用研究方法，如酵母双杂交技术和亲和纯化-质谱法，可以用于检测和分析蛋白质之间的相互作用和信号传递网络。
综上所述，蛋白质组学研究涉及多种常用方法，每种方法都有其优点和局限性。
研究人员可以根据研究目的、样本特性和实验需求选择合适的方法。
此外，随着技术的不断发展和改进，蛋白质组学研究方法将越来越多样化和多样性，为研究人员提供更好的工具来揭示蛋白质的结构、功能和相互作用。
蛋白质组学三大基本技术
蛋白质组学三大基本技术
1、质谱技术：质谱技术是蛋白质组学中最常用的和最基本的技术，它可以检测和识
别各种生物样品中的蛋白质和其他大分子有机物，从而可以提高研究的准确性，特别是在
研究动态蛋白信号转导及表观遗传因子的时候，质谱技术的应用更加广泛。
质谱技术包括
两种：基于气相法的高级数据库技术，和基于液相法的maldi技术。
质谱技术主要是利用
质谱仪来获取受体上蛋白质结构的数据，然后利用数据库搜索，来识别出蛋白质结构特征
及在受体上的结合状态。
2、SDS-PAGE技术：SDS-PAGE技术是一种蛋白电泳分析技术，它可以分离组成复合蛋
白的每个蛋白质组分，并对蛋白质的组成成分及其特有的分子量进行测定，是一种蛋白质
分类及检测的基础性技术。
SDS-PAGE技术利用聚丙烯酰胺亚胺(SDS)作为为分子内部量均
分剂，可将蛋白链折叠、聚集形成单个分子，然后进行电泳分离操作，在膜隔开一定距离，然后再对所获取到的蛋白分子特征进行识别，以得出它的结构和分子量的信息，进而得出
受体上分子的特征及其功能。
3、免疫淋巴细胞技术：免疫淋巴细胞技术是实验可能性较好、分离效果更好。
它以
电泳分离技术作为分离介质，从新鲜样品中分离出完整的肽盐化药物，可有效地检测及克
隆受体上的蛋白片段及肩膀，进而得出蛋白质组学上受体特征及其功能。
蛋白质组学的研究方法
蛋白质组学的研究方法蛋白质组学是运用先进的分析技术，通过对细胞内的蛋白质分子进行检测、分离、同位素标记与定量等方法，研究不同细胞型、组织型、发育阶段以及病变状态等生物样本中蛋白质组成及其功能性调控的科学。
它是一门综合性学科，既涉及生物化学、蛋白质工程、分子生物学等学科，也涉及信息学及计算机科学等学科，运用了各种生物学技术和数学模型，将复杂的生物体蛋白质组织成一个有机的整体，从而更好地了解蛋白质的结构与功能关系。
蛋白质组学的研究方法主要包括：一、蛋白质分离与鉴定：蛋白质分离是蛋白质组学的基础步骤，其目的是从生物样本中提取蛋白质。
常用的技术包括凝胶电泳、膜分离、微萃取、液相色谱法以及离心分离等。
蛋白质分离之后，还需要进行鉴定，以获得蛋白质的名称及其细胞定位等信息，以便进行后续研究。
常用的方法包括凝集试验、蛋白质印迹、Western blotting、质谱分析以及二级结构分析等。
二、定量蛋白质组学：定量蛋白质组学是指利用有效的检测技术，对生物样本中的蛋白质进行定量分析，以便获得蛋白质组成及其功能性调控情况的精确信息。
定量蛋白质组学技术主要包括酶标记蛋白质定量、质谱定量以及流式细胞蛋白质定量等。
三、蛋白质组学的应用：蛋白质组学的研究结果可以用来研究基因调控、细胞信号转导、疾病机理等方面的问题。
它可以帮助研究人员更好地理解生物的复杂性，并为有效的治疗策略的制定提供重要的参考和指导。
它还可以用于研究新型药物的研究和开发，为疾病的治疗提供新的思路。
蛋白质组学的发展前景广阔，它不仅可以用于解决当前生物学上的实际问题，还可以为未来的研究提供重要的科学研究基础。
随着技术的进步和数据量的增加，蛋白质组学技术将会为生物学研究带来更多的惊喜和发现。
蛋白质组学及技术介绍PPT通用课件.ppt
3.二相SDS-PAGE
丙烯酰胺/甲叉双丙烯 酰胺溶液
分离胶缓冲液
10%（w/v）过硫酸铵 溶液
（30.8%T，2.6%C）：30%（W/V）丙烯酰胺和 0.8%甲叉双丙烯酰胺的水溶 液。将 300g 丙烯酰胺和 8g 甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离
研究 内容
蛋白质的研究内容主要有两方面：
1、结构蛋白质组学：主要是蛋白质表达模型的研究，包括蛋白质氨基酸序列 分析及空间结构的解析种类分析及数量确定; 2、功能蛋白质组学：主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质功能及蛋白 质间的相互作用。
研究 内容
蛋白质组学可分为三个主要领域： 1、蛋白质的微特性以供蛋白质的规模化鉴定和他们的后翻译饰； 2、“差异显示”蛋白质组学供蛋白质水平与疾病在广泛范围的有力应用比 较； 3、应用特定的分析技术如质谱法（包括串联质谱法、生物质谱法）或酵母 双杂交系统以及其他蛋白质组学研究新技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该方法所研究的蛋白均是在体内经过翻译后修饰的，并且是可 分离的天然状态的相互作用蛋白复合物，能够反映正常生理条件下的 蛋白质间相互作用
蛋白质相互作用
2、酵母双杂交系统：
该系统利用真核细胞调控转录起始过程中，DN A结合结构域(binding domain,BD)识别DNA上的特异序列并使转录激活结构域(activation domain, AD)启动所调节的基因的转录这一原理，将己知蛋白X和待研究蛋白Y的基 因分别与编码AD和BD的序列结合，通过载体质粒转入同一酵母细胞中表 达，生成两个融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用，则AD和BD在空间上 接近就能形成完整的有活性的转录因子，进而启动转录，表达相应的报告 基因;反之，如果X和Y之间不存在相互作用，报告基因就不会表达。这样， 通过报告基因的表达与否，便可确定是否发生了蛋白质的相互作用。
《蛋白质组研究技术》课件
酵母双杂交技术
利用酵母细胞表达的蛋白与待测蛋白 进行相互作用，筛选出与待测蛋白相 互作用的蛋白。
串联亲和纯化技术
将待测蛋白与其相互作用蛋白一起纯 化下来，再通过分离纯化得到相互作 用蛋白。
03 蛋白质组学在生物医学中 的应用
疾病标志物发现
疾病诊断
通过蛋白质组学技术，发现与疾病相关的特异性蛋白质标志物，有助于疾病的早 期诊断和预后评估。
电泳技术
利用蛋白质在电场中的迁移率不同，将蛋白质分 离成不同的条带。
蛋白质芯片技术
将蛋白质固定在芯片上，通过与待测蛋白质的相 互作用，实现对蛋白质的筛选和检测。
蛋白质鉴定技术
蛋白质鉴定技术
利用各种技术手段对分离得到的蛋白 质进行鉴定，确定其氨基酸序列和分 子量等信息。
氨基酸序列分析
通过测定蛋白质中氨基酸的排列顺序 ，确定蛋白质的种类和来源。
未来发展趋势与展望
技术创新
未来蛋白质组学技术将继续创新 ，如高通量、高灵敏度、高分辨 率的蛋白质检测技术。
跨学科融合
蛋白质组学将与生物信息学、计 算生物学等学科进一步融合，实 现多维度、多层次的数据分析。
临床应用拓展
随着技术的进步和应用研究的深 入，蛋白质组学将在临床诊断、 治疗和药物研发等方面发挥更大 的作用。
分子量测定
利用质谱等技术手段测定蛋白质的分 子量，以验证蛋白质鉴定的准确性。
免疫学检测
利用特异性抗体对蛋白质进行检测和 识别，具有高灵敏度和特异性。
蛋白质功能研究技术
蛋白质功能研究技术
通过各种手段研究蛋白质在生物体内的功能 和作用机制。
细胞生物学技术
通过观察蛋白质在细胞内的定位、分布和动 态变化，研究其功能和作用机制。
蛋白质组学的研究技术
蛋白质组学的研究技术
1. 蛋白质组分离技术
在蛋白质组学研究中，最先要做的就是将蛋白质分离出来，从而得到纯度较高的蛋白质。
目前常用的蛋白质分离技术包括凝胶电泳、液相色谱和质谱等方法。
其中，凝胶电泳是最常用的蛋白质组分离技术之一，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和二维凝胶电泳（2-DE）等。
蛋白质组学的目的在于研究蛋白质的种类和结构，因此鉴定蛋白质是非常重要的一个环节。
目前比较流行的蛋白质组鉴定技术主要包括质谱和基因组学方法。
其中，基因组学方法包括通过对已知的基因组序列进行比对，来鉴定和预测蛋白质序列。
而质谱则主要是通过对蛋白质的分子量和氨基酸序列等特征进行分析和鉴定。
蛋白质的表达和生物学功能密不可分，因此研究蛋白质的表达非常重要。
目前可供选择的蛋白质组表达技术包括基因工程技术和化学合成技术等。
其中，基因工程技术是最常用的表达技术之一，可以通过将外源DNA序列转化到宿主细胞或者器官中来表达蛋白质。
蛋白质组学研究产生的数据量非常大，因此需要利用计算机和大数据分析技术来对数据进行处理和分析。
这其中涵盖了数据清洗、数据预处理、特征提取和建模等多个方面。
此外，还需要采取一些数据可视化的方法，以让研究人员更直观的观察和理解数据。
蛋白质组学的应用范围非常广泛，包括药物研发、疾病诊断和治疗等领域。
例如，蛋白质组学在癌症诊断、药物靶点鉴定和药物作用机制等方面都有着重要的应用，这些应用也推动了蛋白质组学的迅速发展。
总之，蛋白质组学技术不断创新和发展，可以解决大量生物学和生物医学领域中的重要问题，对于深入探究蛋白质生物学领域的各种问题具有不可替代的作用。
蛋白质组学技术
蛋白质组学技术
蛋白质组学技术指在蛋白质组学研究中所用到的各种技术。
质谱技术是蛋白质组学技术中可实现高通量分析的技术之一，可用于蛋白质组的定性和定量分析。
百泰派克生物科技提供基于质谱的蛋白质组学分析服务。
蛋白质组学技术
蛋白质组学技术指在蛋白质组学研究中所用到的各种技术，包括蛋白质分离纯化技术、鉴定和测序技术、定量技术以及生物信息学分析技术等等。
纯化蛋白质的常规技术一般基于色谱，如离子交换色谱（IEC）、尺寸排阻色谱（SEC）和亲和色谱。
分析选择性蛋白质则可以使用ELISA和western blot技术，但是这些技术一般仅限于分析少数单个蛋白质，且无法确定蛋白质的表达水平。
质谱技术可用于确定蛋白质的氨基酸序列。
利用ICAT、iTRAQ等标记技术可对蛋白质组进行定量分析。
X 光散射技术和核磁共振（NMR）则可提供蛋白质的三维结构信息，这可能有助于理解蛋白质的生物学功能。
蛋白质组学技术。
蛋白质组学技术应用
蛋白质组学研究通过利用不同的技术来鉴定和量化细胞、组织或生物体中存在的总蛋白质，通过使用一种或多种蛋白质组学技术可完整描述细胞的结构和功能信息，以及细胞对各种类型的压力和药物的响应机制。
蛋白质组学技术可被用于多种不同
的研究环境，如用于检测各种诊断标志物、疫苗生产候选物，开发新药物，了解致病机制、应对不同信号改变的表达模式，以及解释不同疾病中的功能蛋白途径等。
蛋白质组学实验技术
蛋白质组学实验技术蛋白质组学实验技术是一种从全局视角研究蛋白质组成、结构和功能的技术。
随着基因组学技术的发展，蛋白质组学已成为研究细胞示踪、疾病生物标志物、药物靶点等领域的重要手段。
本文将介绍比较典型的蛋白质组学实验技术。
1. 二维凝胶电泳（2-DE）2-DE是目前最常用的分离和检测蛋白质的方法之一。
该方法将蛋白质样品通过等电聚焦和SDS-PAGE两次分离，从而实现高分辨率的蛋白质分离。
根据pI和分子量的差异，蛋白质可以被分离成数百到数千个斑点。
这些斑点可以通过印记染色、银染色及荧光染色等方法检测。
此外，2-DE也可用于检测蛋白质的修饰状态或表达水平的变化。
2. 液相色谱-质谱联用（LC-MS）LC-MS是一种高分辨率分析技术，可以根据分子质量和结构鉴定蛋白质及其修饰。
它通过将分离得到的蛋白质通过高效液相色谱（HPLC）分离，再通过质谱分析确定蛋白质的质量和结构信息。
与其他蛋白质分析方法相比，LC-MS可以分析非常复杂的样品，并且可以分析一些低丰度蛋白质和代谢产物。
3. 蛋白质微阵列蛋白质微阵列是一种高通量检测技术，可以检测上千种蛋白质。
它是将大量的蛋白质在玻璃片或硅片上固定成阵列，从而实现对多个蛋白质的检测。
蛋白质微阵列的制备过程相对简单，可以通过打印技术快速生产。
与其他技术相比，它具有检测速度快、样品体积少、数据可重复性好等优点。
4. 捕获质谱法（CAPTURE）CAPTURE是一种高灵敏度的蛋白质检测技术，它可以在低浓度条件下检测蛋白质。
与传统的质谱法不同，CAPTURE通过大量捕获和富集相同或不同类型的蛋白质，从而提高检测的灵敏度。
CAPTURE技术直接从体液中检测目标蛋白质，能够检测多种临床疾病的生物标志物。
5. 蛋白质定量技术蛋白质定量技术是实验过程中必不可少的一步。
目前比较常用的蛋白质定量技术包括倍半胱氨酸定量法、Bradford法、BCA法、Lowry法等。
BCA法和Bradford法常用于蛋白质的定量，因为它们具有高灵敏度、广泛适用性和快速的分析速度。
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LexA蛋白 单纯疱疹病毒的VP编码区 大肠杆菌的LexA蛋白 BD AD
选择酵母细胞作为双杂交系统的宿主菌株： 1.酵母细胞具有翻译后加工功能 2. 酵母细胞有很多的营养缺陷型标记，筛选阳性 克隆比较方便、容易。 3. 酵母细胞有性生殖形成二倍体细胞，转化容易， 转化率高
构建两种可在大肠杆菌和酵母细胞中复制的 穿梭质粒载体
3. 单杂交系统
用于研究蛋白质与DNA的相互作用 检测蛋白质能否和DNA结合 筛选能和DNA结合的蛋白质
只用双杂交系统中的DNA-AD质粒，不用DNA-BD质粒， 故称为单杂交系统 待研究的蛋白质可看作双杂交系统中GAL4的BD结构域 将待研究蛋白质基因与DNA-AD质粒重组，以融合形式表达 AD-蛋白质 重组质粒转入酵母细胞
高拷贝，插入的片段小
技术操作 （一）噬菌体载体： 1. 噬菌体载体 由噬菌体基因组改造而成 含有完成噬菌体生命周期全部遗传成分 一种抗生素遗传标记 一对限制酶切点 2.噬菌粒 噬菌体和质粒的杂合体 质粒的复制子和抗性基因 噬菌体的PⅢ基因或PⅧ基因及基因间隔区 间隔区有单链DNA合成和包装信号 感染细菌后需辅助噬菌体协助包装
3. 从大肠杆菌中提取两种重组质粒共转化 酵母细胞 在缺少Trp、Leu和His,含有X-gal的培 养基上筛选 在此培养基上生长的蓝色菌落证明X 蛋白和Y蛋白能互相作用。
酵母的接合型 a接合型 α接合型 单倍体 二倍体 单倍体
DNA-BD载体 转化 a接合型酵母 Trp筛选
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
DNA-AD载体 转化 α接合型酵母
X和Y蛋白间无作用
（三）、酵母双杂交系统的应用
1. 检测两种已知蛋白质之间在体内是否存在 相互作用. 这是酵母双杂交系统最基本用途 将两种已知蛋白质的编码基因分别克 隆到BD载体和AD载体上，共同转染酵母细 胞。若报告基因得到表达，则证明两种蛋 白质之间在细胞内存在相互作用。
2. 筛选与已知蛋白质相互作用的新的蛋白质。 这是酵母双杂交技术最广泛，最有价值 的用途 将已知蛋白质基因克隆在BD载体上， 将要筛选的 cDNA库克隆在AD载体上，据 此可从cDNA库中筛选出能与已知蛋白质 相互作用的新蛋白质。
蛋白质组学研究内容
• 蛋白质鉴定： 双向电泳结果找出差异蛋白质电 对差异点蛋白质： 分子量及等电点分析 western blot或者免疫共沉淀等技术初步鉴 定蛋白质种类 质谱技术分析蛋白质的氨基酸序列 在数据库中比对确定蛋白质的家族归属。
• 蛋白质的修饰： 真核生物蛋白质翻译后会进行修饰： 磷酸化 乙酰化 糖基化 这些修饰是调节蛋白质功能的重要方式
酵母单杂交原理示意图
4. 反向双杂交系统 鉴定导致蛋白质不能相互作用的突变 鉴定能破坏蛋白质相互作用的因子 采用反式选择性报告基因 Ure3基因编码的酶催化嘧啶类似物5-氟 清酸转化成细胞毒性物质，使细胞死亡 两种蛋白质能相互作用，Ure3基因表达， 细胞死亡 两种蛋白质不能相互作用，Ure3基因不 能表达，细胞得以生长
（一）、酵母双杂交技术原理
酵母双杂交系统的建立基于对真核生物转 录激活因子结构与功能的认识
真核生物转录激活因子 DNA结合结构域 转录激活结构域 AD BD 组件式：结构可互相分开 功能互相独立 空间较近时表现活性 中间序列对活性无影响
N端 147AA BD
C端
213AA AD
酵母转录因子GAL4
5. 绘制蛋白质相互作用网络或图谱 双杂交系统的BD及AD质粒均接上 cDNA库，让它们随机表达蛋白 通过检测报告基因的表达可以证实一 系列崭新蛋白中两两间的相互作用 如能证实在蛋白质A-B、B-C和C-D 间都存在相互作用，据此可绘制出 A→B→C→D的蛋白间联系图谱
（四）、酵母双杂交系统的局限与发展
• 分子识别 蛋白质之间普遍存在的专一性结合作用 抗体与抗原、酶与底物、配体与受体 结合局部构像相嵌互补，必要时局部构像发生变化 局部有相应的化学基团产生足够结合力 • 分子自我装配 在特定条件下生物大分子自动装配成具有生物活性的细胞器 或病毒 蛋白质、核酸、糖装配成核糖体 • 多酶体 相关的酶彼此有机的结合在一起 丙酮酸脱氢酶：丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酸乙酰转移酶、二 氢硫辛酸脱氢酶
1. Ampr基因-大肠杆菌筛 选标记 2. Trp、Leu-酵母筛选标 记 3. ３ X与BD以融合蛋白形 式表达，Y与AD以融合 蛋白表达 pGBT9质粒 pGAD424质粒
报告基因 在GAL4结合的顺式作用元件下游需 连接报告基因。 目前应用最多的报告基因是LacZ基 因，表达后能在X-Gal培养基上产生蓝色 菌落。 其次是His基因，表达后能使酵母菌 在缺少组氨酸的培养基中生长。 现在多提倡两种报告基因同时应用， 颜色筛选和营养缺陷筛选同时进行，以 降低假阳性的出现
三、噬菌体表面显示技术-筛选结合结构域
技术建立的原理和条件： 1.抗原抗体反应 抗原抗体特异性反应通过抗原决定簇实现 抗原决定簇位于分子表面，5-7氨基酸组成 2.多肽在噬菌体表面有独立活性 3.多肽化学合成技术的日趋成熟
丝状噬菌体特点： 基因组是单链DNA,只能感染F＋细菌 复制形式是双链，可用于基因操作和转化 有5种结构蛋白： PⅢ通过与F菌毛结合感染细菌 PⅧ与噬菌体的成熟和稳定有关
8X4=32密码 终止密码ＴＡＧ 第三个硷基不用A:不出现TAA和TGA 都有简并密码 第三个碱基：Ａ和Ｇ是简分（NNK)6，N:等量4种碱基 K:等量G/T两种碱基 两侧加酶切位点 经PCR扩增 酶切合成的基因片段 （2）载体酶切，与合成基因重组，转化 （3）细菌培养 （4）在培养液中收集噬菌体颗粒
（二）合成编码随机短肽的核苷酸序列： （NNK）x或（NNS）x N=A、T、C、G K=G、T S=G、C x=氨基酸数 NNK或NNS组成32个密码代表20种氨基酸 和一个终止密码TAG 第三个硷基不用A:不出现TAA和TGA 都是简并密码 第三硷基用C或T :互为简并密码
AAG T ATG T AGG T ACG T
黑龙江省重点学科检查汇报 蛋白质组学主要研究技术
刘兴汉
哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室 哈尔滨医科大学 省部共建国家重点实验室培育基地— 生物化学与分子生物学学科 黑龙江省生物医药工程重点实验室
人类基因组计划结束给科学工作者极大鼓舞，同时也引 出了更多的问题： 大量涌现出的新基因，它们有什么功能？编码什么蛋白？ 在生命过程中发挥什么样的作用？ 这些问题靠传统的研究方法不可能解决。蛋白质组 （proteome）和蛋白质组学（proteomics）的概念就是在这 个基础上提出的。 1994年9月在意大利Marc Wilkins正式提出了蛋白质组 （proteome）的概念。用于指代特定时间一个基因组或者一 种组织产生并利用的所有蛋白质。
Ｌｅｕ筛选
Trp、Leu、His 蓝色菌落 X和Y蛋白相互作用
X基因与DNA-BD质粒重组
Y基因与DNA-AD质粒重组 分别转化大肠杆菌
Amp培养基 X-BD重组质粒 Y-AD重组质粒
共转化酵母细胞
Trp和Leu营养缺陷培养基 Trp、Leu、His营养缺陷培养基
X-gal
蓝色菌落
无菌落生长
X和Y蛋白相互作用
分析结构和功能
四、酵母双杂交技术-蛋白质相互作用
一、酵母双杂交系统的原理 二、酵母双杂交系统的操作程序 三、酵母双杂交系统的应用 四、酵母双杂交系统的局限与发展
酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system） 也叫相互作用陷阱 （Interaction trap） 由Fields和Song于1989年建立 用于研究细胞内蛋白质与蛋白质间的 相互作用。
• 蛋白质功能确定： 研究蛋白质的功能，蛋白质相互作用 酵母杂交技术 噬菌体展示技术 RNA干扰技术
• 蛋白质功能研究： 噬菌体表面展示技术(phage surface display) 酵母杂交技术（yeast hybridization） RNA干扰技术 • 蛋白质鉴定 双向电泳技术 质谱分析技术
酵母双杂交系统的发展
1. 哺乳动物细胞双杂交系统 主要增强蛋白质翻译后的修饰作用， 用于检测在酵母细胞中修饰不完全的蛋 白之间的相互作用 单纯疱疹病毒BP16编码区取代GAL4 的AD结构域 氯霉素乙酰转移酶或荧光素酶为报 告基因
2. 细菌双杂交系统 直接在细胞质内研究蛋白之间相互作 用，适用于不能进入细胞核的蛋白质。 百日咳博代杆菌中腺苷酸环化酶催化结 构域可分为T18和T25两个相对独立的功能 单位
蛋白质相互作用的研究技术
• 蛋白质：结构蛋白 功能蛋白 • 生命基本过程是功能蛋白质在时空上 有序和协调作用的结果 • 从研究单一蛋白质的结构与功能关系 发展为研究蛋白质间的相互作用
一、蛋白质相互作用的种类
• 分子或亚基的聚合 四级结构蛋白质亚基间的互相聚合 聚合的亚基是固定不变的 聚合靠氢键、疏水作用力等次级键 • 分子杂交 同工酶亚基间的聚合 聚合的亚基是可变的 聚合靠次级键
多肽种类=206,肽库必须足够大
肽库的筛选
受体蛋白
生物素标记
生物素—受体蛋白 噬菌体肽库 滴定板微量 生物素—受体蛋白—多肽噬菌体 链亲和素
生物素—受体蛋白—多肽噬菌体
链亲和素 滴定板 洗去未结合噬菌体
酸洗脱
插入特定多肽的噬菌体
•
鉴
定
插入特定多肽噬菌体 提DNA 测序 由DNA序列推测多肽氨基酸序列 合成多肽
3. 确定蛋白质之间相互作用的结构域或活 性区 将一个蛋白质突变或缺失掉不同的片 段，再检测两种蛋白质在双杂交系统中 还能否保持转录激活作用，从而确定蛋 白之间相互作用的结构域或活性区。 4. 筛选多肽类新药 将药物作用的靶蛋白基因克隆在BD载 体上，待筛选的多肽药物基因克隆在AD载 体上，从中筛选作用于靶蛋白的多肽类新药
二、蛋白质间作用力
• 氢键 主链氢键：二级结构 侧链氢键：三、四级结构 表面氢键: 蛋白质间作用 • 离子键 正电荷与负电荷间的静电引力 酸性氨基酸和碱性氨基酸多在球形蛋白质的表面， 解离的带电基团互相吸引 和溶液的盐浓度有关