蛋白质定量研究技术方法及差异表达蛋白质作用通路分析 -96页文档
蛋白质的定性定量分析课件(共54张PPT)
芳香族氨基酸的紫外吸收
优 点 • 快速
• 对蛋白质无破坏性
缺 点 • 不是严格的定量，适用于测定蛋
白质粗提液
• 核酸可引起强干扰作用 •芳香族氨基酸含量差异可以起误 差
计算方法 • 标准曲线法
• 蛋白质浓度 (mg/ml)
=1.45×A280-0.74×A260
注意事项
• 石英比色杯 • 调零所用溶液 • 配制标准蛋白所用溶液
PVDF膜 尼龙膜
0.22 um 0.45 um
80-100 ug/cm2
170-200 ug/cm2
< 20kD不易丢失 容量大、强度高
480 ug/cm2
用于核酸
电转移装置
电转移示意图
电转移装置
4. 靶蛋白的免疫学检测
➢ 封闭
— 对转移膜上的潜在结合位点进行封闭 ，防止抗体非特异性结合在膜上，降低背 景颜色
液280 nm的光吸收值是分析 蛋白质的分子量范围 15～200 KD之间
SDS-PAGE凝胶的制备 二、凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子量
溶液中蛋白质含量的快速简 这一方法可用来快速检测溶液中是否含有
注意：在叠放硝酸纤维素膜、聚丙烯酰胺凝胶时，膜与胶之间要紧密贴在一起，中间不能有任何气泡 ！
便的方法
一、免疫印迹分析的应用
➢ 对蛋白质进行定性分析
➢ 对蛋白质进行半定量分析 ➢ 信号转导分析
➢生物大分子相互作用分析
二、免疫印迹分析的基本流程
制备蛋白样品 电泳分离蛋白
转移至固相膜
蛋白质转移
封闭非特异结合位点
与第一抗体温育反应
抗体检测
与第迹操作流程图
1. 样品的制备
优 点 • 终产物稳定
蛋白质研究方法PPT课件
抗体
Western Blotting 实验技术
免疫印迹法
之 封闭
目的：防止抗体与膜的非特异性结合。
脱脂奶粉（5％） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）
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免疫印迹法
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SDS-PAGE 注意事项
免疫印迹法
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W品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳
免疫印迹法
之 流程详解
（3） 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
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硝酸纤 维素膜
价格便宜
Western Blotting 实验技术 之 转膜
个人简介
血统：正宗重庆人 ——直爽、耿直
普通话：渝普话
——多多包涵
爱好：篮球
——切磋投篮
邮箱：
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酶解
蛋白质 PMF
肽的混合物
蛋白质组研究路线
搜索引擎 Search engine
验证
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数据库 搜索结果
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RNAi实验流程
授课内容
一
候选蛋白质的验证
1
下一讲
凯氏定氮法：蛋白质中氮在浓硫酸作用下生成铵盐，与浓NaOH 作用，产生氨气，吸收于标准硼酸溶液中，用标准酸直接滴 定，测出含氮量，按蛋白质恒定的含氮量（16%），换算出 蛋白的含量。 福林-酚法（Lowry法）：蛋白质中的酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸残 基与Cu2+结合，生成复合物，进而还原酚试剂的磷钼酸， 生成蓝色化合物，用比色法测定。
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免疫印迹法
SDS-PAGE 电压设置 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电 压恒压电泳。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分 子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
蛋白质的定量分析方法
蛋白质的定量分析方法1．蛋白质的常规检测方法1.1 凯氏定氮法一种最经典的蛋白质检测方法。
原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与硫酸作用变成硫酸铵。
然后加碱蒸馏放出氨，氨用过量的硼酸吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。
优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好。
缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大。
1.2 双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。
原理：双缩脲是三分子的脲经180℃左右加热，放出一份子氨后得到的产物，在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽链中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅和蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。
优点：较快速、干扰物质少、不同蛋白质产生的颜色深浅相近。
缺点：灵敏度差、三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。
1.3 Folin酚试剂法原理：与双缩法大体相同，利用蛋白质中的肽键和铜离子结合产生双缩脲反应。
同时也由于Folin酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。
在一定条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比，由此可测定蛋白质的含量。
优点：灵敏度高、对水溶性的蛋白质含量的测定很有效。
缺点：费时，要精确控制操作时间；Folin酚试剂的配制比较繁琐，且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂（二硫代苏糖醇、巯基乙醇）、EDTA和尿素均会干扰反应。
1.4 紫外吸收法原理：蛋白质中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在280nm处具有紫外吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在280nm处的吸光值与肽键含量成正比。
利用一定波长下蛋白质溶液的吸光值与蛋白质含量的正比关系可以测定蛋白质含量。
优点：简便、灵敏、快速、不消耗样品，测定后能回收。
缺点：测定蛋白质含量的精确度差、专一性差；干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶等能吸收紫外光的物质会出现较大的干扰。
蛋白质定量的五种方法
蛋白质定量的五种方法方法一双缩脲法测定蛋白质浓度[目的]掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。
[原理]双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。
在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。
因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。
双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。
操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。
除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。
[操作]取中试管7支，按下表操作。
各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。
用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。
[计算](一)在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。
(二)从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(g／L)，并求出人血清样本的蛋白质浓度。
(三)再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本的蛋白质浓度(g／L)。
[器材]中试管7支，l毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计、坐标纸。
[试剂](—)6N NaOH：称取240g氢氧化钠溶于1000ml水中。
(二)双缩脲试剂：称取CuS04·5H2O 3.0克，酒石酸钾9.0 克和碘化钾5.0克，分别溶解后混匀，加6N NaOH l00ml，最后加水至1000ml，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。
如有暗红色沉淀出现，即不能使用。
(三)0.9％NaCl。
(四)蛋白质标准液(10mg／m1)，称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0ml容量瓶中，淋洗称量瓶数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线，或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量，然后稀释成l0mg ／m1作为蛋白质标准液。
蛋白质的定量测定方法PPT课件
2.测定未知样品
取样品溶液4毫升,加蒸馏水4mL混匀，在280nm下 测定其光密度值。
【实验结果】
根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中 查出样品溶液的蛋白质含量。
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【实验目的】
三、微量凯氏定氮法
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
蛋白质染料复合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白质测定 的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质结合迅速，大约为2 分钟，结合物的颜色在1小时内稳定。所以本法操作简便，快速，灵敏 度 高 ， 稳 定 性 好 ， 是 一 种 测 定 蛋第白20质页/含共量24页的 常 用 方 法 。
【实验材料】
2. 测定未知样品：取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加
5毫升Fo1in酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫升 Fo1in酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在500nm处测定光密度值 。
【实验结果】
根据未知样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品
溶液中的蛋白质含量。
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Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白
质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最
பைடு நூலகம்
广泛的方法之一。
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【实验材料】
1.实验器材
100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。
2.实验试剂
(1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于／L氢氧化钠溶液中，再把 硫酸铜(CuSO4∙5H2O)溶于100mL1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液，然后 将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。
蛋白质组学定量研究常见方法-PPT课件
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1：双向电泳
基于2D-PAGE 的经典定量分 析方法。 1、样品准备 和定量：抽提 对照组和各种 不同实验组的 蛋白质。 2、蛋白质分 离：蛋白质经 过2D-PAGE分离 后染色（银染、 考染等）。 3、蛋白质的 定性与定量分 析：通过与对 照组相Image Master 7.0分 析出实验组中 差异点，质谱 鉴定差异点蛋 白质,同时应用 软件分析出其 表达量的变化。
4：化学标记法—ICAT
ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子 的空间位阻 （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每 个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特 异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化， （4） ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修饰 物，会增加数据库搜索的复杂性 （5）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会造 成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。 （6）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生β -消除反应 使部分标签断裂。
蛋白质组学定量研究常见方法
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蛋白质组学定量研究常见方法
1：常规双向电泳 2：DIGE 3：15N等同位素标记 4：ICAT 5：iTRAQ 6：SILAC
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蛋白质的研究方法与原理
蛋白质的免疫检测
总结词
免疫检测是利用抗体与抗原的特异性结合来检测蛋白质的技术。它具有高灵敏度、高特 异性和操作简便等优点。
详细描述
免疫检测的基本原理是利用抗体与抗原的特异性结合，通过检测抗体与抗原的结合情况 来判断蛋白质的存在。常用的免疫检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印 迹等。这些方法能够检测出低浓度的蛋白质，并且可以对蛋白质进行定量和定性分析，
因此在生物医学研究中广泛应用。
04
蛋白质的表达与调控
基因工程技术表达蛋白质
基因工程技术是研究蛋白质表达的重要手段，通过基 因工程技术可以高效地在大肠杆菌、酵母、哺乳动物
细胞等宿主细胞中表达蛋白质。
基因工程技术表达蛋白质的原理是将目的基因插入到 宿主细胞的基因组中，通过转录和翻译过程合成蛋白
质。
基因工程技术表达蛋白质的优点是可以在短时间内大 量生产蛋白质，并且可以方便地改变蛋白质的序列和
05
蛋白质的结构与功能研 究
X-射线晶体学研究蛋白质结构
总结词
X-射线晶体学是一种通过X-射线分析晶体结构的方法，广泛应用于蛋白质结构 的研究。
详细描述
X-射线晶体学通过分析X-射线在晶体中的衍射，可以确定蛋白质分子的三维结 构。研究人员将蛋白质结晶后，利用X-射线照射晶体，衍射的X-射线通过分析 波长和强度，可以推断出蛋白质分子的空间排列和构象。
蛋白质的表达水平在不同个体之间存在差异，通过对个体 蛋白质表达谱的分析，可以为个体化治疗提供依据，实现 精准医疗。
蛋白质在生物工程领域的应用
生物制药
酶工程
蛋白质是生物药物的主要成分，通过 基因工程技术生产重组蛋白药物，可 用于治疗多种疾病。
酶是蛋白质的一种，通过酶工程技术 和蛋白质工程手段对酶进行改造和优 化，可以提高酶的催化效率和稳定性。
蛋白质定量研究技术方法及差异表达蛋白质作用通路分析 (2)PPT资料96页
FTICR) • Orbitrap
FTICR
• 根据磁场中的离子回旋频率来测量离子质荷比 • 分辨率很高，采集频率低
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
FTICR) • Orbitrap
TOF
TOF
• 肽段分子量1000 Da，MALDI离子化成+1 价离子，静止时施以15 kV电压，飞行距离 1.5 m，飞行时间是？
• 时间很短，因此测量相对误差容易较大
MALDI-TOF
MALDI-TOF
MALDI-TOF
• 单个样品准备时间短，采集速率较快， 分辨率适中（50 ppm）
蛋白质功能分析的技术与方法
蛋白质功能分析的技术与方法蛋白质是构成组织和细胞最基本的分子单位，同时也承担着包括催化、传递信号、结构支撑等多种功能。
因此，研究蛋白质的功能不仅能够帮助我们更深入地了解细胞和生命活动的本质，同时也对医学、农业等领域产生了广泛的应用。
在本文中，我们将简要介绍现代蛋白质功能分析的技术与方法。
1. 蛋白质结构分析由于蛋白质的功能与其结构密切相关，因此了解蛋白质在三维空间中的结构是功能分析的基础。
X射线晶体学（X-ray crystallography）是目前最常用的蛋白质结构分析技术。
它利用蛋白质结晶后产生的X射线衍射模式来揭示蛋白质的三维结构，从而进一步推断其功能机理。
此外，核磁共振（NMR）技术也常用于蛋白质结构分析，特别是对于较小的蛋白质分子。
2. 功能预测根据蛋白质结构以及该蛋白质所属的家族、结构域等信息，可以尝试对其可能的功能进行预测。
常用的方法包括模拟和计算化学技术，如分子动力学模拟、同源建模等。
同时，亲和层析、蛋白质-蛋白质相互作用等技术也可以为预测蛋白质功能提供有用的信息。
3. 基于蛋白质互作的功能分析蛋白质与其他蛋白质的相互作用是细胞内多种生物学过程中必不可少的一部分。
因此，基于蛋白质相互作用的功能分析方法也颇为常见。
例如，蛋白质-蛋白质相互作用数据可以用于构建蛋白质互作网络（protein-protein interaction network），从而帮助我们了解细胞内信号传递等过程的调节机理。
此外，基于蛋白质相互作用的分析还可以用于研究复合物（complex）的结构、功能和组成。
4. 基于代谢组学的功能分析代谢组学（metabolomics）是用于研究生物代谢的技术和方法。
在蛋白质功能分析中，代谢组学可以用于鉴定蛋白质与代谢反应之间的相互作用。
例如，可以通过分析代谢产物的质谱图谱和NMR谱图，来确定蛋白质对某些代谢路径的影响，或者通过网络分析等手段，获得蛋白质以及代谢途径之间更系统的互作信息和分析工具。
检测蛋白质表达的方法
检测蛋白质表达的方法随着生物技术的不断发展，蛋白质表达已经成为了生命科学研究中的重要环节。
为了研究蛋白质的结构、功能以及生物学意义，需要对蛋白质的表达进行检测。
本文将从蛋白质表达的基本概念、检测方法、技术优缺点、以及应用前景等方面进行探讨。
一、蛋白质表达的基本概念蛋白质是生命体中最基本的分子，它们担任着许多生物学过程中的重要角色。
蛋白质表达是指在生物体内或外，通过基因转录和翻译过程，将基因信息转化为蛋白质的过程。
蛋白质表达的过程分为三个阶段：转录、翻译和后转录修饰。
在转录过程中，DNA被转录成RNA，然后在翻译过程中，RNA被翻译成蛋白质。
在后转录修饰过程中，蛋白质被修饰成具有特定功能的成品蛋白质。
二、蛋白质表达的检测方法1. SDS-PAGESDS-PAGE是一种常用的蛋白质分离和检测方法。
它利用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行簇合和解离，使蛋白质在电场作用下按照大小分离。
分离后的蛋白质可以通过染色或Western blotting等方法进行检测。
2. Western blottingWestern blotting是一种常用的蛋白质检测方法。
它利用SDS-PAGE将蛋白质分离，然后将蛋白质转移到膜上，再通过特定抗体与蛋白质结合，最后用化学发光或染色等方法进行检测。
3. ELISAELISA是一种高灵敏度、高特异性的蛋白质检测方法。
它利用特定的抗体与蛋白质结合，然后通过化学反应产生颜色或荧光信号进行检测。
ELISA适用于检测血清、尿液、唾液等生物体液中的蛋白质。
4. 质谱质谱是一种高灵敏度、高分辨率的蛋白质检测方法。
它利用质谱仪对蛋白质进行分析，可以得到蛋白质的分子量、氨基酸序列、修饰等信息。
质谱适用于检测复杂样品中的蛋白质。
三、蛋白质表达检测技术的优缺点1. SDS-PAGE优点：简单易行，适用于大多数蛋白质；缺点：不能确定蛋白质的氨基酸序列；2. Western blotting优点：高特异性，适用于低丰度蛋白质的检测；缺点：需要特定抗体，成本较高；3. ELISA优点：高灵敏度、高特异性，适用于生物体液中的蛋白质检测；缺点：需要特定抗体，成本较高；4. 质谱优点：高分辨率、高灵敏度，可以确定蛋白质的氨基酸序列和修饰信息；缺点：需要高分辨率质谱仪，成本较高。
蛋白质和代谢产物表达的分析技术和方法
蛋白质和代谢产物表达的分析技术和方法蛋白质是由氨基酸组成的大分子，是细胞在生物体内发挥生理作用的重要组成成分。
蛋白质的表达和代谢产物的分析是生命科学研究的重要领域。
随着先进的技术和方法的引入，对蛋白质与代谢产物进行深入研究的能力和水平不断提高。
首先，我们来了解蛋白质表达分析的技术和方法。
相对于基因组学而言，蛋白质组学需要处理更加复杂的样品。
蛋白质组学技术包括两个主要的分析方法：电泳和质谱。
其中，电泳是常用的蛋白质分离技术之一，具有分离速度快、检测灵敏度高等优点。
而质谱分析技术则是识别和鉴定蛋白质的重要手段之一。
目前，常见的质谱技术包括MALDI-TOF、ESI-MS、ESI-MS/MS等。
这些方法使研究人员能够获得大规模蛋白质组数据，并对蛋白质表达水平进行分析和比较。
蛋白质组学技术的快速发展，使得研究人员对蛋白质组的研究从定性到定量逐渐实现。
蛋白质组学的定量研究有多种方法，例如同位素标记技术、二维差异凝胶电泳分析、南方杂交等方法。
同位素标记技术是近年来出现的定量方法，它将同位素标记反应原理与质谱进行结合，通过分析相对蛋白质组中同位素比值的变化，比较不同条件下蛋白质组的表达差异。
通过这种技术，可以获得蛋白质组的定量检测，更全面地了解生物体内蛋白质组的动态变化。
其次，代谢产物分析技术是生物化学研究中不可或缺的方法之一。
代谢产物是以生物化学反应为基础的复杂网络的结果，通过对代谢产物进行分析可获得生物体与外界互动的信息，为生命科学的研究提供了全新的思路和手段。
代谢物分析技术主要包括色谱和质谱两大类方法。
色谱技术是将代谢产物分离，并通过用于检测的方法来进行分析。
质谱技术则能够通过检测代谢产物的质量进行准确的检测与鉴定。
同时，代谢产物组学也是近年来备受关注的领域，对代谢产物进行定量分析，利用以往大数据和信息学研究成果，结合机器学习等技术，挖掘出隐藏在大众化分析方法背后的新知识。
以上所述的技术和方法，使得蛋白质组学和代谢产物研究在生命科学领域中的应用更加广泛和深入。
蛋白质功能研究方法及技术
生物技术通报
B IOTE CHNOLOGY BULLE TIN
2009年第 9期
蛋白质功能研究方法及技术
蒋英芝1, 2 贺连华 1 刘建军 1
( 1 深圳市疾病预防控制中心, 深圳 518020; 2 湖南师范大学医学院, 长沙 410006)
摘 要: 随着后基因时代的到 来, 蛋白质功能研究 已经成 为蛋白 质组学 研究的 核心内容 , 是 生物科 学极具 挑战的 领域 之一。近年来虽已有大量文章涉及某些蛋白质功能方面的研究, 但对蛋白质功能 研究方法 方面进行系 统综述的文 章非常少, 因此, 从差异蛋白的筛选鉴定、蛋白质相互作用、蛋白质亚细胞定位、蛋白质表达改变的分 子遗传学手 段 (如 RNA i) 、生物 信息 学等方面对目前蛋白质功能研究方法和技术及其最新研 究进展 进行综 述, 研究者可 根据不 同的蛋 白和实 验需要 选择适 宜的 方法。
40
生物技术通报 B iotechn ology Bulletin
2009年第 9期
疫共沉淀两种生化方法的优点 , [ 10] 通过两步特异性 的亲和纯化可获得与目的蛋白结合的高纯度蛋白质 复合物。该方法首先对目的蛋白进行 TAP 标签标 记, 标签 包括 3 个 部分: 蛋白 A、钙 调素 结合多 肽 ( ca lmodu lin binding peptide, CBP ) 和 中 间 连 接 的 TEV酶识别的酶切位点。在 蛋白复合物的 分离纯 化中, 第一步利用与蛋白标签具有亲和作用的色谱 柱, 采用 TEV 蛋白酶断裂 TEV 蛋白酶切位 点的方 式洗脱; 第二步利用与钙调蛋白结合肽具有亲和作 用的钙调蛋白色谱柱, 将蛋白复合物和 TEV 蛋白酶 分开, 纯化出的蛋白复合物用凝胶电泳、质谱技术或 Edman降解法进行鉴定。TAP 技术的优点是利用酶 切的方法进行洗脱, 条件温和, 不破坏复合 物的结 构, 并且经两步洗脱, 去除了杂蛋白的干扰, 提高了 蛋白质相互作用结果的可靠性、特异性, 远远超越了 酵母双杂交传统技术。 213 荧光共振能量转移技术
蛋白质研究方法
➢ 样品中高浓度的阳离子可能会导致SDS的沉 淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去
第四节 测定蛋白质的等电点
等电点 (isoelectric point, pI) 两性电解质性质 支持介质 (supporting media)
+
pH 3
+
pH 3
pH 7.5 pH 7.5
一、分配定律
➢ 假设有两种互不混溶的溶剂S和M，将A物质溶于一
定量的S溶剂中，再加入一定量的M溶剂
➢ A物质在两相中相互扩散
➢ A物质在两相中达到了平衡(在同一时间内，进出两
相的A物质的分子数完全相等)时，其分配系数为常数
➢ 分配定律表明：
CAS CAM
=
K
❖ 一定的条件下，一定的物质其K值不变
➢ 在分配层析柱中，物质只有横向扩散，没有纵向扩 散，而且在两相间达到分配平衡的速度很快
➢ 体系中其他物质的存在不影响待分离物质的分配。 待分离物质的存在也不影响其他物质的分配
➢ 在分配层析柱上，物质在各个理论塔板中的含量可 通过计算求得
6. 蛋白质的检测和鉴定
光谱学特性 190～200 nm 230～300 nm 电泳检测 SDS-PAGE IEF 分子量测定 凝胶过滤层析 沉降平衡超速离心
➢ Martin和Synge计算了硅胶柱的理论塔板数， 求得一个理论塔板的高度为0.002厘米
➢ Verzele计算为0.02厘米 ➢ 1厘米的层析柱最少有50个理论塔板，那么，
在一根20厘米的层析柱上最少可以进行1000 次分配。
三、塔板理论
塔板理论的要点：
➢ 分配层析柱象分馏柱一样可以分成很多层，每层为 一理论塔板，其高度为理论塔板高度。在一定的 条件下，一根分配层析柱的理论塔板数是一定的
蛋白质定量测定技术
本章内容
• 总蛋白质测定的基本原理与方法 • 白蛋白的测定 • 球蛋白的测定
临床检验中测定蛋白质的几种情 况
• 测定血清总蛋白 • 蛋白质电泳以获取各类蛋白质所占比例 • 测定个别蛋白质
蛋白质测定的基础
• 重复的肽键结构 • 蛋白质中所含的酪氨酸和色氨酸残基对酚 试剂反应或紫外吸收 • 与色素的结合能力 • 沉淀后的浊度或光折射改变 （上述原理不但适合于总蛋白质的测定，也 可用于分离出来的蛋白质组分的测定）
折光测定法 （ratio of refraction）
• 溶解在溶液中的固体可以增加溶液的光折 射，通过测定血清的折射指数可以计算出 总固体的含量 • 由于每升正常血清中含有约16g非蛋白固 体，它们对折射指数的影响必须进行校正 • 折射率＝1.3353＋蛋白质浓度（g/dl） × 0.00191 • 此法准确性较差，且白、球蛋白的折射率 不同
BCP法测定白蛋白
• 化学结构与BCG相似 • 在Ph5.2及brij-35存在条件下，可与白 蛋白形成紫色复合物，于603nm处有光 吸收 • BCP与白蛋白的反应是即时完全反应，不 受时间变化的影响，呈色稳定1h以上 • BCP与白蛋白反应特异性高，与血清非蛋 白成分反应微弱，干扰小
球蛋白测定
• 酸性环境中蛋白质分子可解离出带有正电 荷的-NH3+基团，它可与阴离子的染料产 生颜色反应，与同样处理的标准溶液比较 即可求得样品中蛋白质的含量 • 染料有CBBG-250、丽春红S、邻苯三酚 红－钼酸钠、银、胶体金等
染料结合法（II）
• 血清总蛋白测定最常用的染料是考马斯亮蓝G250（CBBG-250），即Bradford法 • 在酸性条件下，CBBG-250与蛋白质结合后由 棕红色变为蓝色，最大光吸收从465nm移至 595nm • 本法简便快速，重复性好，灵敏度高，但特异性 不高，MW大于3000的多肽也参与反应，强碱 和去垢剂会影响呈色，白、球蛋白呈色强度不同
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质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
FTICR) • Orbitrap
• Orbitrap：分辨率很高 • LTQ：灵敏度和采集频率高
小结
定量方法
常用质量 分析器
分辨率 采集频率 灵敏度
iTRAQ TOF/TOF 中
高
中
SILAC SRM 无标记
LTQOrbitrap
QQQ
LTQOrbitrap
低-高 低
低-高
高-低 高
高-低
高-中 中
高-中
目前常用定量蛋白组学技术
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
FTICR) • Orbitrap
更进一步？
SRM
糖链组成有着复杂的多样性，使得不同糖基化蛋白的分离非常困 难。 应对方法： 用糖苷内切酶（endoglycosidase）将糖链和蛋白部分分开。
作者发展出一套方法，用糖苷内切酶Endo F3催化部分的去糖基 化，在质谱中触发海藻糖（fucose）的中性丢失（即离子丢失一 个不带电荷的片段），并用三级质谱（MS/MS/MS）检测。
• 常用定量蛋白组学技术概述 • 荧光差异电泳技术及应用案例 • SILAC技术及应用案例 • 等质量标签技术及应用案例 • SRM技术及应用案例 • Label-free技术及应用案例
常用定量蛋白组学技术概述
• 基于凝胶电泳
• 基于质谱
荧光差异电泳技术及应用案例
荧光差异电泳技术及应用案例
荧光差异电泳技术及应用案例
• 缺陷：必须是能传代的细胞。？
近来在整合素介导的细胞粘着复合物种新发现了三个ILK结合蛋白家 族的蛋白，其突变可导致Kindler综合征（主要症状为水疱、大疱， 伴光敏感，逐渐出现全身皮肤异色），于是将这些蛋白称为Kindlin1~3。
在小鼠模型中，Kindlin-3基因失活可引起重度贫血，其原因猜测是血 小板整合素激活机制的缺陷，导致血小板聚集缺陷以及血栓的生成。
蛋白鉴定通常由于样品的高复杂度以及动态范围，低丰度的蛋白的 信号常夹在在高丰度蛋白的信号里，被后者掩盖。而有时候恰恰是 那些没能检测到低丰度蛋白具有关键意义。这种现象在临床体液样 品（如血清、脑脊液、羊膜液等）中尤其明显。
问题： 怎样让那些低丰度蛋白得到检测？ 困难： 如果加大上样量，则高丰度蛋白含量同比例增加，信号掩盖效应 依然存在。
Trx1催化二硫键和S-亚硝 基化的还原。Trx1仅通过 蛋白-蛋白相互作用方式选 择性地还原蛋白。
问题： Trx1的靶标蛋白有哪些？
蛋白鉴定通常由于样品的高复杂度以及动态范围，低丰度的蛋白的 信号常夹在在高丰度蛋白的信号里，被后者掩盖。而有时候恰恰是 那些没能检测到低丰度蛋白具有关键意义。这种现象在临床体液样 品（如血清、脑脊液、羊膜液等）中尤其明显。
• 定位富集分析：计算一组结果里某一类蛋白富 集程度的显著性
问题： 小鼠血红细胞中Kindlin-3敲除，在蛋白表达方面，能引起什么样的下 游变化？
基于质谱的定量蛋白组学技术
iTRAQ标记试剂的结构
iTRAQ 8-plex
二级质谱谱图示意
二级质谱谱图实例
Molecular & Cellular Proteomics 8:1674–1687, 2009.
TOF
TOF
• 肽段分子量1000 Da，MALDI离子化成+1 价离子，静止时施以15 kV电压，飞行距离 1.5 m，飞行时间是？
• 时间很短，因此测量相对误差容易较大
MALDI-TOF
MALDI-TOF
MALDI-TOF
• 单个样品准备时间短，采集速率较快， 分辨率适中（50 ppm）
MALDI
MALDI
• 需要经过铺基质、点靶板等步骤，通量较低 • 一般只产生+1价离子
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
FTICR) • Orbitrap
Orbitrap
• 分辨率很高，采集频率适中
质谱的分类
• 常用的质谱均含有多个质量分析器，比如： • TOF/TOF • QQQ • Q-TOF • Q-Trap • LTQ-Orbitrap • 此外还有多种其他组合，各有优缺点，分
别适合不同的定量方法
LTQ-Orbitrap
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
关键步骤？
open square, galactose; closed square, N-acetylglucosamine; open triangle, fucose; closed triangle, N-acetyl-neuraminic acid; closed circle, mannose.
SILAC SRM 无标记
小结
通量
实际样品中线性 动态范围
常用质谱
低
~10倍 TOF/TOF
高
~30倍 TOF/TOF
高
~30倍
LTQOrbitrap
中
LTQOrbitrap
内容纲要
• 质谱（Mass spectrometer）工作原理及蛋 白质组学中常用质谱类型
• 目前常用定量蛋白组学研究手段 • 差异表达蛋白的生物信息学分析
更进一步？
中性丢失+定量——SRM 得出：core fucosylated肽段的位点特异的定量信息
基于质谱的定量蛋白组学技术
无标记和稳定同位素标记定量的区别
• 成本低，对一 次比较的样品 的数目没有限 制 • 对测量体系稳 定性要求很高， 计算机处理复 杂耗时
定量方法 差异凝胶 双向电泳
iTRAQ
• 根据质量分析器：飞行时间质谱、离子阱 质谱等
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
质谱基本构造
质谱基本构造
最早的质谱（复制品）
质荷比的测定原理
小结
• 质谱仪的功能是测定离子的质荷比。
• 质谱仪一般包括三个主要部分：离子源、 质量分析器和检测器。
• 下一部分：质谱的类型
质谱的分类
• 质谱可以根据其离子源和质量分析器的类 型进行分类
• 根据离子源：电喷雾质谱，MALDI质谱等
糖链组成有着复杂的多样性，使得不同糖基化蛋白的分离非常困 难。 应对方法： 用糖苷内切酶（endoglycosidase）将糖链和蛋白部分分开。
作者发展出一套方法，用糖苷内切酶Endo F3催化部分的去糖基 化，在质谱中触发海藻糖（fucose）的中性丢失（即离子丢失一 个不带电荷的片段），并用三级质谱（MS/MS/MS）检测。
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
FTICR) • Orbitrap
FTICR
• 根据磁场中的离子回旋频率来测量离子质荷比 • 分辨率很高，采集频率低
FTICR) • Orbitrap
Quadropule
Quadropule
Quadropule
• 三重四级杆，用于SRM定量
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,