蛋白质定量研究技术方法及差异表达蛋白质作用通路分析 -96页文档
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• 缺陷：必须是能传代的细胞。？
近来在整合素介导的细胞粘着复合物种新发现了三个ILK结合蛋白家 族的蛋白，其突变可导致Kindler综合征（主要症状为水疱、大疱， 伴光敏感，逐渐出现全身皮肤异色），于是将这些蛋白称为Kindlin1~3。
在小鼠模型中，Kindlin-3基因失活可引起重度贫血，其原因猜测是血 小板整合素激活机制的缺陷，导致血小板聚集缺陷以及血栓的生成。
Trx1催化二硫键和S-亚硝 基化的还原。Trx1仅通过 蛋白-蛋白相互作用方式选 择性地还原蛋白。
问题： Trx1的靶标蛋白有哪些？
蛋白鉴定通常由于样品的高复杂度以及动态范围，低丰度的蛋白的 信号常夹在在高丰度蛋白的信号里，被后者掩盖。而有时候恰恰是 那些没能检测到低丰度蛋白具有关键意义。这种现象在临床体液样 品（如血清、脑脊液、羊膜液等）中尤其明显。
FTICR) • Orbitrap
Orbitrap
• 分辨率很高，采集频率适中
质谱的分类
• 常用的质谱均含有多个质量分析器，比如： • TOF/TOF • QQQ • Q-TOF • Q-Trap • LTQ-Orbitrap • 此外还有多种其他组合，各有优缺点，分
别适合不同的定量方法
LTQ-Orbitrap
FTICR) • Orbitrap
ESI
ESI
ESI
• 直接从溶液中将生成离子化喷雾 • 同一肽段可以产生带有不同电荷的一系列离子 （2+~7+）
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
FTICR) • Orbitrap
关键步骤？
open square, galactose; closed square, N-acetylglucosamine; open triangle, fucose; closed triangle, N-acetyl-neuraminic acid; closed circle, mannose.
糖链组成有着复杂的多样性，使得不同糖基化蛋白的分离非常困 难。 应对方法： 用糖苷内切酶（endoglycosidase）将糖链和蛋白部分分开。
作者发展出一套方法，用糖苷内切酶Endo F3催化部分的去糖基 化，在质谱中触发海藻糖（fucose）的中性丢失（即离子丢失一 个不带电荷的片段），并用三级质谱（MS/MS/MS）检测。
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
FTICR) • Orbitrap
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
FTICR) • Orbitrap
• Orbitrap：分辨率很高 • LTQ：灵敏度和采集频率高
小结
定量方法
常用质量 分析器
分辨率 采集频率 灵敏度
iTRAQ TOF/TOF 中
高
中
SILAC SRM 无标记
LTQOrbitrap
QQQ
LTQOrbitrap
低-高 低
低-高
高-低 高
高-低
高-中 中
高-中
目前常用定量蛋白组学技术
问题： 小鼠血红细胞中Kindlin-3敲除，在蛋白表达方面，能引起什么样的下 游变化？
基于质谱的定量蛋白组学技术
iTRAQ标记试剂的结构
iTRAQ 8-plex
二级质谱谱图示意
二级质谱谱图实例
Molecular & Cellular Proteomics 8:1674–1687, 2009.
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
SILAC SRM 无标记
小结
通量
实际样品中线性 动态范围
常用质谱
低
~10倍 TOF/TOF
高
~30倍 TOF/TOF
高
~30倍
LTQOrbitrap
中
~30倍
QQQ
高
~60倍
LTQOrbitrap
内容纲要
• 质谱（Mass spectrometer）工作原理及蛋 白质组学中常用质谱类型
• 目前常用定量蛋白组学研究手段 • 差异表达蛋白的生物信息学分析
更进一步？
中性丢失+定量——SRM 得出：core fucosylated肽段的位点特异的定量信息
基于质谱的定量蛋白组学技术
无标记和稳定同位素标记定量的区别
• 成本低，对一 次比较的样品 的数目没有限 制 • 对测量体系稳 定性要求很高， 计算机处理复 杂耗时
定量方法 差异凝胶 双向电泳
iTRAQ
质谱基本构造
质谱基本构造
最早的质谱（复制品）
质荷比的测定原理
小结
• 质谱仪的功能是测定离子的质荷比。
• 质谱仪一般包括三个主要部分：离子源、 质量分析器和检测器。
• 下一部分：质谱的类型
质谱的分类
• 质谱可以根据其离子源和质量分析器的类 型进行分类
• 根据离子源：电喷雾质谱，MALDI质谱等
差异表达蛋白的生物信息学分析
• 定位 • 结构 • 所处的生物学过程 • 所处的具体代谢/信号通路 • 相互作用
差异表达蛋白的生物信息学分析
• 定位
GO (geneontology.org) cellular component Uniprot (uniprot.org) 亚细胞结构专门的蛋白数据库
蛋白质定量研究技术方法及 差异表达蛋白质作用通路分析
10/24/2019
内容纲要
• 质谱（Mass spectrometer）工作原理及蛋 白质组学中常用质谱类型
• 目前常用定量蛋白组学研究手段 • 差异表达蛋白的生物信息学分析
质谱工作原理
• 质谱的工作原理 • 质谱的分类 • 蛋白质组学中常用质谱类型及各自特点
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
FTICR) • Orbitrap
FTICR
• 根据磁场中的离子回旋频率来测量离子质荷比 • 分辨率很高，采集频率低
蛋白鉴定通常由于样品的高复杂度以及动态范围，低丰度的蛋白的 信号常夹在在高丰度蛋白的信号里，被后者掩盖。而有时候恰恰是 那些没能检测到低丰度蛋白具有关键意义。这种现象在临床体液样 品（如血清、脑脊液、羊膜液等）中尤其明显。
问题： 怎样让那些低丰度蛋白得到检测？ 困难： 如果加大上样量，则高丰度蛋白含量同比例增加，信号掩盖效应 依然存在。
更进一步？
SRM
糖链组成有着复杂的多样性，使得不同糖基化蛋白的分离非常困 难。 应对方法： 用糖苷内切酶（endoglycosidase）将糖链和蛋白部分分开。
作者发展出一套方法，用糖苷内切酶Endo F3催化部分的去糖基 化，在质谱中触发海藻糖（fucose）的中性丢失（即离子丢失一 个不带电荷的片段），并用三级质谱（MS/MS/MS）检测。
MALDI
MALDI
• 需要经过铺基质、点靶板等步骤，通量较低 • 一般只产生+1价离子
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
应对策略： 选择性去除高丰度蛋白，即富集低丰度蛋白。
SRM (selected reaction monitoring), IUPAC name MRM (multiple reaction monitoring)
SRM
SRM: MS Western
母离子/碎片离子对的验证
SRM: MS Western
• 常用定量蛋白组学技术概述 • 荧光差异电泳技术及应用案例 • SILAC技术及应用案例 • 等质量标签技术及应用案例 • SRM技术及应用案例 • Label-free技术及应用案例
常用定量蛋白组学技术概述
• 基于凝胶电泳
• 基于质谱
荧光差异电泳技术及应用案例
荧光差异电泳技术及应用案例
荧光差异电泳技术及应用案例
• 定位富集分析：计算一组结果里某一类蛋白富 集程度的显著性
基于质谱的定量蛋白组学技术
多级质谱
• 一级质谱中，我们假定每个峰代表完整的肽段
SILAC
(stable isotope labeling with amino acids in cell culture)
• 质量控制：必须达到一定的掺入率(95%)。？
Promote Flag-H3.1 expression
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
• 根据质量分析器：飞行时间质谱、离子阱 质谱等
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
FTICR) • Orbitrap
Quadropule
Fra Baidu bibliotek
Quadropule
Quadropule
• 三重四级杆，用于SRM定量
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
TOF
TOF
• 肽段分子量1000 Da，MALDI离子化成+1 价离子，静止时施以15 kV电压，飞行距离 1.5 m，飞行时间是？
• 时间很短，因此测量相对误差容易较大
MALDI-TOF
MALDI-TOF
MALDI-TOF
• 单个样品准备时间短，采集速率较快， 分辨率适中（50 ppm）
Ion trap
• 灵敏度高，采集频率高， • 缺陷：1/3 rule
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
MALDI)
• 根据质量分析器：
近来在整合素介导的细胞粘着复合物种新发现了三个ILK结合蛋白家 族的蛋白，其突变可导致Kindler综合征（主要症状为水疱、大疱， 伴光敏感，逐渐出现全身皮肤异色），于是将这些蛋白称为Kindlin1~3。
在小鼠模型中，Kindlin-3基因失活可引起重度贫血，其原因猜测是血 小板整合素激活机制的缺陷，导致血小板聚集缺陷以及血栓的生成。
Trx1催化二硫键和S-亚硝 基化的还原。Trx1仅通过 蛋白-蛋白相互作用方式选 择性地还原蛋白。
问题： Trx1的靶标蛋白有哪些？
蛋白鉴定通常由于样品的高复杂度以及动态范围，低丰度的蛋白的 信号常夹在在高丰度蛋白的信号里，被后者掩盖。而有时候恰恰是 那些没能检测到低丰度蛋白具有关键意义。这种现象在临床体液样 品（如血清、脑脊液、羊膜液等）中尤其明显。
FTICR) • Orbitrap
Orbitrap
• 分辨率很高，采集频率适中
质谱的分类
• 常用的质谱均含有多个质量分析器，比如： • TOF/TOF • QQQ • Q-TOF • Q-Trap • LTQ-Orbitrap • 此外还有多种其他组合，各有优缺点，分
别适合不同的定量方法
LTQ-Orbitrap
FTICR) • Orbitrap
ESI
ESI
ESI
• 直接从溶液中将生成离子化喷雾 • 同一肽段可以产生带有不同电荷的一系列离子 （2+~7+）
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
FTICR) • Orbitrap
关键步骤？
open square, galactose; closed square, N-acetylglucosamine; open triangle, fucose; closed triangle, N-acetyl-neuraminic acid; closed circle, mannose.
糖链组成有着复杂的多样性，使得不同糖基化蛋白的分离非常困 难。 应对方法： 用糖苷内切酶（endoglycosidase）将糖链和蛋白部分分开。
作者发展出一套方法，用糖苷内切酶Endo F3催化部分的去糖基 化，在质谱中触发海藻糖（fucose）的中性丢失（即离子丢失一 个不带电荷的片段），并用三级质谱（MS/MS/MS）检测。
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
FTICR) • Orbitrap
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
FTICR) • Orbitrap
• Orbitrap：分辨率很高 • LTQ：灵敏度和采集频率高
小结
定量方法
常用质量 分析器
分辨率 采集频率 灵敏度
iTRAQ TOF/TOF 中
高
中
SILAC SRM 无标记
LTQOrbitrap
QQQ
LTQOrbitrap
低-高 低
低-高
高-低 高
高-低
高-中 中
高-中
目前常用定量蛋白组学技术
问题： 小鼠血红细胞中Kindlin-3敲除，在蛋白表达方面，能引起什么样的下 游变化？
基于质谱的定量蛋白组学技术
iTRAQ标记试剂的结构
iTRAQ 8-plex
二级质谱谱图示意
二级质谱谱图实例
Molecular & Cellular Proteomics 8:1674–1687, 2009.
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
SILAC SRM 无标记
小结
通量
实际样品中线性 动态范围
常用质谱
低
~10倍 TOF/TOF
高
~30倍 TOF/TOF
高
~30倍
LTQOrbitrap
中
~30倍
QQQ
高
~60倍
LTQOrbitrap
内容纲要
• 质谱（Mass spectrometer）工作原理及蛋 白质组学中常用质谱类型
• 目前常用定量蛋白组学研究手段 • 差异表达蛋白的生物信息学分析
更进一步？
中性丢失+定量——SRM 得出：core fucosylated肽段的位点特异的定量信息
基于质谱的定量蛋白组学技术
无标记和稳定同位素标记定量的区别
• 成本低，对一 次比较的样品 的数目没有限 制 • 对测量体系稳 定性要求很高， 计算机处理复 杂耗时
定量方法 差异凝胶 双向电泳
iTRAQ
质谱基本构造
质谱基本构造
最早的质谱（复制品）
质荷比的测定原理
小结
• 质谱仪的功能是测定离子的质荷比。
• 质谱仪一般包括三个主要部分：离子源、 质量分析器和检测器。
• 下一部分：质谱的类型
质谱的分类
• 质谱可以根据其离子源和质量分析器的类 型进行分类
• 根据离子源：电喷雾质谱，MALDI质谱等
差异表达蛋白的生物信息学分析
• 定位 • 结构 • 所处的生物学过程 • 所处的具体代谢/信号通路 • 相互作用
差异表达蛋白的生物信息学分析
• 定位
GO (geneontology.org) cellular component Uniprot (uniprot.org) 亚细胞结构专门的蛋白数据库
蛋白质定量研究技术方法及 差异表达蛋白质作用通路分析
10/24/2019
内容纲要
• 质谱（Mass spectrometer）工作原理及蛋 白质组学中常用质谱类型
• 目前常用定量蛋白组学研究手段 • 差异表达蛋白的生物信息学分析
质谱工作原理
• 质谱的工作原理 • 质谱的分类 • 蛋白质组学中常用质谱类型及各自特点
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
FTICR) • Orbitrap
FTICR
• 根据磁场中的离子回旋频率来测量离子质荷比 • 分辨率很高，采集频率低
蛋白鉴定通常由于样品的高复杂度以及动态范围，低丰度的蛋白的 信号常夹在在高丰度蛋白的信号里，被后者掩盖。而有时候恰恰是 那些没能检测到低丰度蛋白具有关键意义。这种现象在临床体液样 品（如血清、脑脊液、羊膜液等）中尤其明显。
问题： 怎样让那些低丰度蛋白得到检测？ 困难： 如果加大上样量，则高丰度蛋白含量同比例增加，信号掩盖效应 依然存在。
更进一步？
SRM
糖链组成有着复杂的多样性，使得不同糖基化蛋白的分离非常困 难。 应对方法： 用糖苷内切酶（endoglycosidase）将糖链和蛋白部分分开。
作者发展出一套方法，用糖苷内切酶Endo F3催化部分的去糖基 化，在质谱中触发海藻糖（fucose）的中性丢失（即离子丢失一 个不带电荷的片段），并用三级质谱（MS/MS/MS）检测。
MALDI
MALDI
• 需要经过铺基质、点靶板等步骤，通量较低 • 一般只产生+1价离子
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
应对策略： 选择性去除高丰度蛋白，即富集低丰度蛋白。
SRM (selected reaction monitoring), IUPAC name MRM (multiple reaction monitoring)
SRM
SRM: MS Western
母离子/碎片离子对的验证
SRM: MS Western
• 常用定量蛋白组学技术概述 • 荧光差异电泳技术及应用案例 • SILAC技术及应用案例 • 等质量标签技术及应用案例 • SRM技术及应用案例 • Label-free技术及应用案例
常用定量蛋白组学技术概述
• 基于凝胶电泳
• 基于质谱
荧光差异电泳技术及应用案例
荧光差异电泳技术及应用案例
荧光差异电泳技术及应用案例
• 定位富集分析：计算一组结果里某一类蛋白富 集程度的显著性
基于质谱的定量蛋白组学技术
多级质谱
• 一级质谱中，我们假定每个峰代表完整的肽段
SILAC
(stable isotope labeling with amino acids in cell culture)
• 质量控制：必须达到一定的掺入率(95%)。？
Promote Flag-H3.1 expression
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
• 根据质量分析器：飞行时间质谱、离子阱 质谱等
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
MALDI)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance,
FTICR) • Orbitrap
Quadropule
Fra Baidu bibliotek
Quadropule
Quadropule
• 三重四级杆，用于SRM定量
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
TOF
TOF
• 肽段分子量1000 Da，MALDI离子化成+1 价离子，静止时施以15 kV电压，飞行距离 1.5 m，飞行时间是？
• 时间很短，因此测量相对误差容易较大
MALDI-TOF
MALDI-TOF
MALDI-TOF
• 单个样品准备时间短，采集速率较快， 分辨率适中（50 ppm）
Ion trap
• 灵敏度高，采集频率高， • 缺陷：1/3 rule
质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization,
MALDI)
• 根据质量分析器：