大鼠卵巢颗粒细胞的原代培养与鉴定

ＸＵ Ｃｈｕａｎ。，ＳＨＵ Ｗｅｉ－ｑｕｎｌ’，ＺＨＡＮＧ Ｌｉａｎ９１， ＣＡＯ Ｊｉａ２，ＺＨＯＵ Ｘｉｎ３
ｆ Ｊ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｙｇｉｅｎｅ， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，硒涮施ｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｍｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０００３８；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０００３８；
大鼠卵巢颗粒细胞 的原代培养与鉴定
Ｖ０１．２１
Ｎｏ．３
Ｏ心ＭＢｙ
Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ０ｆ
Ｇｒａｎｕｌｏｓａ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｒａｔ Ｏｖａｒｙ
许 川１／舒为群ｋ。／张 亮１／ 曹 佳２／周 新３ （１．第三军医大学军事预防医学院环境卫生学 教研室，重庆４０００３８；２．第三军医大学军事 预防医学院军事毒理学教研室，重庆４０００３８； ３．第三军医大学西南医院烧伤科，重庆４０００３８）
尽管国内外有关哺乳动物卵巢颗粒细胞的体外培 养已有文献报道Ｂ－５１，但迄今为止，尚无明确标准、高 效、稳定的的培养方法，本研究旨在通过改进和完善颗 粒细胞的体外培养和鉴定方法，为进一步开展颗粒细胞 体外生殖毒理学研究奠定基础。
１ 材料与方法 １．１ 主要试剂和仪器 ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基购自美国ＨｙＣｌｏｎｅ公司，无支原 体胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。 孕马血清促性腺激素（ＰＭＳＧ）购自杭州动物药品厂，四 甲基偶氮唑盐（ＭＴｒ）、胰蛋白酶、二甲基亚砜（ＯｂｌＳＯ）购 自美国Ｓｉｇｍａ公司，ＤＡＢ显色试剂盒、卵泡刺激素受体 （ＦＳＨＲ）兔多克隆抗体购自武汉博士德公司，伊红、苏木 素购自北京中杉金桥生物工程有限公司。雌二醇（Ｅ：）、 孕酮（Ｐ）放射免疫测定试剂盒购自北京原子高科股份有 限公司。 主要仪器包括组织培养显微镜，光学显微镜 （Ｏｌｙｍｐｕｓ），Ｃ０２培养箱（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ），全自动酶标仪 （Ｔｈｅｒｍｏ），离心机（湖南湘仪），ＧＣ．９１ １ ７放射免疫计数 器（中佳光电仪器分公司）等。 １．２实验动物 ２１—２５日龄（５０一６０ ｇ）清洁级健康ＳＤ大鼠１０只， 雌性，由第三军医大学实验动物中心提供。 １．３ 卵巢颗粒细胞的分离与原代培养 参照Ｌｏｖｅｋａｍｐ等…介绍的方法加以改进，雌性ＳＤ 大鼠，每只皮下注射ＰＭＳＧ ４０ ＩＵ，４８ ｈ后颈椎脱臼法处 死。碘伏、酒精消毒，在无菌条件下迅速剖取卵巢放入预 冷的无菌ＰＢＳ中，去除卵巢周围组织及表面包膜，ＰＢＳ 清洗后置于预冷的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基中。在解剖显微 镜下用２５号针头刺破卵泡，使颗粒细胞释放入 ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，离心管内吹打分散成单个悬浮细 胞。加入０．２５％胰蛋白酶一０．０２％乙二胺四乙酸 （ＥＤＴＡ）１ ｌｌｌｌ，于３７ ｏＣ，５％ＣＯ：培养箱中消化６０ ｍｉｎ， 期间从培养箱取出用吸管反复吹打悬液２—３次（以组 织消化为黏液状、颗粒细胞团块分离为准），加入含有胎 牛血清的培养液终止消化，２００目不锈钢细胞筛过滤。 ８００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｒａｉｎ，洗涤滤液，弃上清收集细胞。向沉 积在离心管底的疏松细胞团中加入ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基 （含１５％胎牛血清、１００ Ｕ／ｍｌ青霉素和１００ Ｕ／ｍＩ链霉
３．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｕｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０００３８，Ｃｈｉｎａ）
Ｉ摘要】背景与目的：探讨大鼠卵巢高纯度颗粒细胞培养及鉴定的方法，建立一种简便、稳定的细胞模型。材料与方法：选用ｓＤ 雌性大鼠（２ｌ。２５ ｄ），皮下注射孕马血清促性腺激素（ＰＭＳＧ），４８ ｈ后用颈椎脱臼法处死，剖取双侧卵巢，采用机械分离方法释放卵巢 颗粒细胞，０．２５％胰蛋白酶消化结合低速离心分离细胞，用舍１５％胎牛血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，置于３７℃，５％ＣＯ：培养箱培养。以 ＨＥ染色和卵泡刺激素受体（ＦＳＨＲ）免疫组化染色对所培养的卵巢颗粒细胞进行鉴定，用ＭＴＴ法绘制细胞生长曲线，并检测细胞培养 液雌二醇（Ｅ：）和孕酮（Ｐ）的分泌量。结果：分离培养的卵巢颗粒细胞存活率＞９０％，细胞纯度达到９５％以雌激素功能，在培养２４ ｈ细胞培养液中Ｅｚ和Ｐ的分泌量分别为（１０．３６ ４－１５．８９）Ｐｇ／ ｍｌ和（７７．９１ ４－１７．２４）ｐｇ／ｍｌ。 结论：采用机械分离法结合胰蛋白酶消化及低速离心法分离培养的卵巢颗粒细胞纯度高、活性好，用 ＦＳＨＲ表达染色鉴定颗粒细胞是一种简便快速的方法。
ｄｅｃａｐｉｔａｔｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｖａｒｉｅｓ ｗｅｒｅ ａｓｅｐｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｍｏｖｅｄ．ＧｒａｎＭｏ髓ｃｅｉｌｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｂｙ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ，ｔｒｙｐｓｉｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｗ－ｓｐｅｅｄ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｉｌｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．Ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｉｌｕｔｅｄ ａｎｄ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｉｎ‰Ｂｈ ＤＭＥＭ－Ｈａｍ’Ｓ Ｆ－１２ ｍｅｄｉｕｍ（１：Ｉ）ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １５％ｏｆ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ８ｅｍｍ ａｔ ３７℃ｉｎ ｗａｔｅｒ－ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｏｆ ５％Ｃ０２．Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｅｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ＦＳＨＲ ｗｅ托ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｌｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ，ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ＣＵｌ＇Ｖｅｇ ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｉｌｓ ａｎｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｌｅｖｅｌｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ髓ｗｅｌｌ． ＲＦ．ＳＵＬＴ￥：Ｏｖｅｒ ９５％ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ｗｅｍ ｏｖａｒｉａｎ ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ
ｐｈａｓｅ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ＷＡｇ ｂｅｔｗｅｅｎ ４８ ａｎｄ ９６ ｈｏｕｒｓ ｏｆ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：Ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ９５％ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｕ曲ｅｄ ｇｒａｎｕｌｏｓａ
ｃｅｉｌｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒｙｐｓｉｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｗ－ｓｐｅｅｄ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ， ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｉｌｓ ｂｙ ＨＥ ａｎｄ ＦＳＨＲ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗｅｒｅ ｑｕｉｃｋ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．
【关ｔ词】大■；卵巢；颗粒细胞；培养；鉴定
中圈分类号：Ｒ７３０．４５
文献标识码：Ａ
文章编号：１００４—６１６Ｘ（２００９）０３—０２３４—０４
［Ｊｍｓｒ黜ｃｒ］ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ ＡＮＤ Ａｎｌ：Ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｏｖａｒｙ ｏｆ ｍｒｓ ８０鹤ｔｏ
Ｏｏ¨面
素）制成单细胞悬液。台盼蓝染色，计数。将细胞稀释成 浓度为３．０×１０５／ｍｌ的细胞悬液，接种于培养瓶中或培 养板中，在３７℃、５％ＣＯ：培养箱中预培养２４ ｈ后换液 １次，去除未贴壁细胞；此后隔１３换液１次。
１．４颗粒细胞鉴定 １．４．Ｉ ＨＥ染色取生长旺盛的第４ ｄ的细胞， 用０．２５％胰蛋白酶一０．０２％ＥＤＴＡ消化后制成１ Ｘ １０５／ 砌的细胞悬液，种植于已预置好小盖玻片的２４孔培养 板中，放人ＣＯ：培养箱中，在３７℃、５％ＣＯ：及完全饱 和湿度条件下进行培养。当细胞生长至７０％融合时取 出玻片，用ＰＢＳ冲洗盖玻片３次，每次５ ｍｉｎ。４哆ｉｏ多聚甲 醛固定２０ ｒａｉｎ。取出细胞爬片，ＰＢＳ冲洗２次，苏木素染 色２ ｍｉｎ，流水冲去浮色，人盐酸酒精中分色数秒，流水 冲洗３ ｍｉｎ，镜下细胞核染色清晰，胞浆不着色。５％伊红 染色２—３ ｍｉｎ，流水冲去浮色，梯度酒精脱水，二甲苯透 明，封片后光镜下观察细胞形态。 １．４．２ ＦＳＨＲ表达鉴定颗粒细胞 细胞爬片制 作同前，４％多聚甲醛固定。按以下步骤进行细胞免疫化 学染色：固定好的细胞爬片，ＰＢＳ洗涤３ ｍｉｎ Ｘ ３次；３％ Ｈ如：室温孵育５ ｍｉｎ，消除内源性过氧化物酶活性，ＰＢＳ 清洗５ ｍｉｎ Ｘ ３次；加正常山羊血清封闭无关抗原，室温 下孵化２０ ｍｉｎ，倾去不洗。滴加一抗ＦＳＨＲ兔多克隆抗 体（１ ２００），４℃过夜，ＰＢＳ清洗５ ｍｉｎ Ｘ ３次。滴加二 抗Ｉｓ，Ｇ，３７℃孵育６０ ｍｉｎ；ＰＢＳ清洗５ ｍｉｎ×３次。滴加 辣根酶标记链霉素工作液５０弘ｌ，３７℃孵育３０ ｍｉｎ； ＰＢＳ清洗５ ｍｉｎ×３次。ＤＡＢ显色（显微镜下控制显色时 间）；自来水冲洗，苏木素复染１０ ｒａｉｎ；自来水冲洗３次； 常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。 １．５ 细胞生长特性观察 将分离得到的细胞按每孔１ ｘ １０４个接种于９６孔 板，每孔２００ ｐｌ。在培养过程中每２４ ｈ对试验组进行１ 次检测，每次检测６个孔，直至接种培养后的第９ ｄ，取 各时间点平均值。检测时，每孔添加１８０ ｔｔｌ不含血清的 培养液和２０ ｐｌ Ｍ ｒＩ－Ｉ．（５ ｍｇ／ｍ１），３７℃继续孵育４ ｈ，小 心吸弃孔内培养液，每孔加入１５０ ｔｔｌ ＤＭＳＯ，振荡 １０ ｍｉｎ，自动酶联免疫检测仪上测定４９０ ｎｍ处的吸光 度值（Ａ），以吸光度值为纵坐标，时间为横坐标绘制细 胞生长曲线。 １．６ 雌二醇（Ｅ：）和孕酮（Ｐ）含量 将生长旺盛细胞接种到２４孔培养板，用含１５％胎 牛血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基培养细胞，细胞密度为 １．０×１０夕ｍｌ，每孔Ｉ ＩＩＩｌ，３７℃、５％Ｃ０２条件下培养 １２ ｈ、２４ ｈ后分别收集细胞培养液（在终止培养前３ ｈ 加入１００ ｎｇ／ｍＩ ＦＳＨ），用放射免疫法测定雌二醇（Ｅ：）和