PCR相关知识

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PCR技术基本原理及相关知识资料讲解

P C R技术基本原理及相关知识PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。

反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。

Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。

平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。

反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。

大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

PCR反应体系的基本成分：模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNTP、 Mg2+的缓冲液。

PCR反应体系与反应条件--------------------------------------------------------------------------------标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA 0.1～2ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

高三生物一轮复习PCR知识总结

高考生物PCR的过程及应用考点归纳总结一、基础考点1.名称：多聚酶链式反应2.原理：DNA双链复制（DNA的半保留复制）、DNA的热变性原理3.前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列4.过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：会解释三个步骤①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸再耐高温的DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配原则合成新的DNA链④重复：第一轮循环的产物作为第二轮的模板：重复循环变性—复性--延伸三过程。

5.PCR反应体系的成分及作用DNA模板：从样本或细胞中提取的微量总DNA原料∶dNTP（dATP、dGTP、dCTP、TTP），提供原料和能量酶∶Taq聚合酶（热稳定DNA聚合酶，从嗜热菌中分离得到）引物∶一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸（注意：引物与目的DNA片段两条母链各自的3’端序列互补）Mg2+：维持酶活性所必需PCR缓冲液∶维持pH，保护Taq酶6.DNA在体内复制的条件模板∶DNA分子的每条链酶∶解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶原料、能量∶dATP、dGTP、dCTP、dTTP引物∶RNA引物，温和的反应条件7.总结：PCR与体内DNA分子复制的不同点：PCR DNA复制复制起点无有复制叉无有场所及条件体外；控制3个不同温度体内细胞核、线粒体、叶绿体；温和条件步骤变性、退火、延伸起始、延伸、终止酶Taq酶解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶引物2种，一小段与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链DNA；人工合成多种RNA做引物；自行合成引物是否去除否是变性的条件90℃以上的高温解旋酶结果短时间内快速扩增目的基因片段复制完整的DNA分子特点半保留复制两条链连续合成半保留复制半不连续复制8.PCR技术在基因工程中的应用：（1）特异性、快速扩增目的基因获取目的基因（2）目的基因的检测与鉴定9.用PCR技术可以扩增mRNA吗？不可以；在逆转录酶的作用下，需以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则合成cDNA再进行扩增10.提取mRNA扩增目的基因的过程：第一步：逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子第二步：核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；第三步：以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子第四步：以双链DNA分子为模板，经过③变性、④复性、⑤延伸，循环扩增形成目的基因产物11.cDNA中缺少真核生物基因的哪些结构：启动子、内含子、终止子12.目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是：Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活13.PCR产物的影响因素：模板DNA的量、脱氧核苷酸的量、引物的量、酶的数量和活性、循环次数、Mg2+的浓度14.PCR后期，反应速率下降的原因：酶的活性降低、引物和dNTP浓度降低、反应产物增多15.变性温度过低会导致双链不能充分解开；16：PCR扩增中预变性的目的：预变性破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。

pcr知识点总结归纳

pcr知识点总结归纳PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链反应，是一种用于抑制、合成、扩增DNA的技术。

PCR技术广泛应用于科学研究、临床诊断、法医鉴定和生物工程等领域。

PCR技术的出现不仅提高了DNA的扩增速度，而且在很大程度上解决了DNA分析的难题和可行性问题。

PCR技术的关键在于DNA的扩增，通过特定的引物（primer）和热稳定的DNA聚合酶在不同温度下进行多次循环反应，使目标DNA片段扩增成百上千倍。

PCR技术的应用可以在较短时间内获得充足的DNA，为后续的实验提供了可行性基础。

PCR技术是分子生物学研究的重要工具，掌握PCR技术的原理和操作方法对于分子生物学研究者来说至关重要。

下面将对PCR技术的知识点进行总结和归纳，包括PCR的基本原理、PCR反应体系、PCR引物设计、PCR技术的优缺点以及PCR技术在生物学研究中的应用等方面。

一、PCR的基本原理PCR技术是通过DNA的酶解、DNA的引物延伸、DNA的片段合成来实现DNA扩增。

PCR主要由以下三个步骤组成：变性、退火和延伸。

1. 变性步骤：将DNA的双链解链成两条单链，即使DNA解链。

2. 退火步骤：将引物与DNA模板结合成双链，即使DNA复性。

3. 延伸步骤：在退火变性条件下将引物作为起始核酸，然后DNA聚合酶将其扩增成DNA。

通过以上三个步骤的循环反应即可实现DNA的多次扩增。

二、PCR反应体系PCR反应体系主要包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、四种dNTPs、缓冲液和辅助剂等。

1. DNA模板：PCR反应的起始材料，可以是基因组DNA、cDNA或其他DNA模板。

2. 引物：在退火步骤中将与DNA模板特异性结合，为DNA的扩增提供起始核酸。

3. DNA聚合酶：用于合成DNA，PCR反应中通常采用热稳定的DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶。

4. dNTPs：即脱氧核苷酸三磷酸盐，即dATP、dCTP、dGTP和dTTP，是DNA聚合的四种脱氧核苷酸单体。

PCR的种类原理及其应用

PCR的种类原理及其应用1. PCR的简介PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种在体外复制DNA的技术，它通过反复进行DNA的复制，扩增出目标DNA的数目，从而使得原来数量有限的DNA样本变得足够检测。

PCR技术的应用广泛，不仅可以在分子生物学研究中应用，也可以用于医学诊断、法医学鉴定等领域。

2. PCR的原理PCR技术主要依赖于DNA的复制酶(聚合酶)、DNA模板、引物以及dNTPs等原料。

PCR反应一般包括三个步骤：变性、退火和扩增。

2.1 变性在PCR反应开始时，将目标DNA加热到94-96°C，使其双链DNA解旋成两条单链，这个过程称为变性。

此时，DNA模板中的两条链将被分离开来，为下一步的引物结合提供条件。

2.2 退火随后，在PCR反应中，温度会降低到50-60°C，引物可以与模板DNA中的特定区域互补配对，这个过程称为退火。

引物的选择是PCR反应中的关键步骤之一，引物的序列需要与目标DNA序列的两端互补，使得引物在此处能够结合。

2.3 扩增一旦引物与DNA模板结合，聚合酶通过在引物上合成新的DNA链。

这个过程称为扩增。

聚合酶从引物的3’端开始构建新的DNA链，复制DNA模板。

扩增过程通常会进行30-40个周期，每个周期包括变性、退火和扩增三个步骤，使得目标DNA的数量呈指数增长。

3. PCR的种类3.1 普通PCR普通PCR是最基本的PCR类型，采用传统的PCR原理和步骤进行扩增。

普通PCR适用于检测目标DNA序列的存在与否，常用于基因组克隆、突变分析和基因表达分析等研究领域。

3.2 定量PCR定量PCR是基于普通PCR的基础上进行改进和优化的一种技术。

它可以定量测定PCR反应体系中目标DNA模板的初始数量。

定量PCR广泛应用于基因表达分析、病原体定量检测、药物代谢分析等领域。

3.3 反转录PCR反转录PCR是在普通PCR基础上结合了反转录过程的一种PCR技术。

PCR技术基本原理及相关知识

PCR技术基本原理及相关知识PCR（聚合酶链式反应）是一种分子生物学技术，用于扩增DNA分子。

PCR技术革命性地改变了分子生物学的研究和应用领域，并且在医学、农业、环境科学等领域具有广泛的应用。

以下是PCR技术的基本原理及相关知识。

1. 变性（Denaturation）：将目标DNA融合成两条单链，使其成为单股DNA。

在PCR反应开始时，样本中的DNA经过高温处理（通常为95°C），使其双股DNA分离，形成单股DNA。

2. 退火（Annealing）：通过引入两个特异性引物，使其与目标DNA的靶序列互补结合。

延伸引物是由短的DNA或寡核苷酸片段（18-24个核苷酸）组成的特定DNA序列，它与目标序列的两端相互补。

在PCR反应温度较低时（通常为50-65°C），引物结合到目标DNA的两端。

3. 延伸（Extension）：通过DNA聚合酶的催化，将引物与目标DNA形成的复合物延长，生成新的DNA分子。

在PCR反应中，引物延长所需要的二倍体DNA将通过DNA聚合酶的催化作用来实现。

DNA聚合酶能够识别引物与模板DNA之间的同源性，并在引物的3'末端开始合成新的DNA链。

以上三个步骤组成一个PCR循环，每个循环将扩增目标DNA的数量。

通常，在30-40个PCR循环后，目标DNA的量将扩增到百万级。

1.DNA模板：DNA模板是PCR反应的起点，它可以是基因组DNA、cDNA或已知序列的DNA片段。

2.引物设计：引物的选择非常重要，引物应该与目标DNA序列的两端相互补，以确保引物的有效结合和延长。

3. DNA聚合酶：DNA聚合酶是PCR反应的催化剂，通常使用热稳定聚合酶（如Taq聚合酶）。

热稳定聚合酶能够在高温下保持稳定，并且具有较高的DNA聚合活性。

4.PCR缓冲液：PCR反应需要在特定的pH和离子浓度条件下进行，PCR缓冲液可以提供适宜的反应环境。

5.循环条件：PCR反应需要在特定的温度条件下进行循环反应。

PCR技术的应用专题知识讲座

➢ PCR：使用一对寡核苷酸引物，以目旳序列为模板，利用DNA合成酶和四种脱氧核糖核酸进行DNA旳体外合成反应。
➢ PCR技术具有敏捷度高，特异性高、操作以便和反复性好等特点，能够在几种小时内取得多达几百万拷贝旳目旳基因。
➢ 该技术在上个世纪80年代中期由美国K.Mullis发明建立，经过近二十年已发展成涉及多种衍生技术，在诸多领域中广泛使用，K.Mullis也所以取得1993年度旳诺贝尔化学奖。
Frq为邻近6至7 个碱基构成旳亚单位在一种指定数据库文件中旳出现频率。该频率高则可增长错误引起旳可能性。
下可催化核苷酸沿5′→3′方向发生聚合反应。
4、脱氧核糖核酸
➢ 四种脱氧核苷三磷酸即dATP、dTTP、dCTP和dGTP，为PCR反应中DNA合成原料。 ➢ 在新旳一种反应体系中，这四种脱氧核糖核酸旳起始浓度应该都相等，假如其中一种
旳浓度明显不同于其他旳就会诱发错配，并降低新链合成速度。
5、缓冲液
五、PCR引物设计
引物设计是PCR 技术中至关主要旳一环。使用不合适旳PCR 引物轻易造成试验失败：体现为扩增出目旳带之外旳多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。目前PCR 引物设计大都经过计算机软件进行。能够直接提交模板序列到特定网页，得到设计好旳引物，也能够在本地计算机上运营引物设计专业软件。
备注：* 比两条引物旳Tm值低5~10℃。
四、影响PCR原因
虽然PCR操作很以便，但影响原因也诸多，从而影响PCR旳特异性和高效性。 1. 引物 2. 变性温度和时间 3. 退火温度和时间 4. 延伸温度和时间 5. 循环次数
1、引物
➢ 引物决定了PCR产物旳长度和特异性。 ➢ 引物旳设计要求请看本试验讲义“引物设计”部分。

PCR基本知识

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。

它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。

过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。

PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

PCR技术简史PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因“。

PCR的实现1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。

其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

PCR的改进与完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。

②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR 产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。

此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。

这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

198 8年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。

pcr实验知识点总结

pcr实验知识点总结PCR实验（聚合酶链反应）是一种在生物化学中广泛使用的分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。

该技术由Kary Mullis于1983年发明，并于1993年获得了诺贝尔化学奖。

以下是关于PCR实验的知识点总结。

一、PCR原理PCR的基本原理是利用DNA聚合酶对单链DNA进行复制的能力。

这个过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。

1. 变性：在高温（通常为95℃）下，双链DNA被解旋成两条单链模板。

2. 退火：温度降低（一般为50-65℃），引物与模板DNA的互补序列结合。

3. 延伸：在适宜的温度（72℃左右）和DNA聚合酶的作用下，引物沿着模板DNA向两侧延伸，形成新的双链DNA。

这三个步骤循环进行，每次循环都会使目标DNA的数量翻倍，经过几十到几百次循环后，就能得到大量的目标DNA。

二、PCR所需材料1. DNA模板：待扩增的目标DNA。

2. 引物：两段短的寡核苷酸，与目标DNA的两端互补。

3. dNTPs：脱氧核苷三磷酸，作为合成新链的原料。

4. Taq DNA聚合酶：能在高温下保持活性的酶，用于催化DNA的合成。

5. 缓冲液：提供合适的pH和离子环境。

三、PCR操作步骤1. 设计引物：根据目标DNA的序列设计出两条引物，分别与DNA的正反两条链互补。

2. 配制反应体系：将模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶和缓冲液按照一定比例混合。

3. PCR循环：将反应体系放入PCR仪中，设定好变性、退火和延伸的温度和时间，开始循环反应。

4. 产物检测：可以通过凝胶电泳等方法检测PCR产物的大小和数量。

四、PCR的应用1. 分子诊断：如病原体检测、基因突变检测等。

2. 基因克隆：将目的基因扩增后，可以方便地进行后续的克隆和表达。

3. 序列分析：通过扩增特定的基因区域，可以进行基因测序和SNP分析等。

4. 生物考古学：可以从古代样本中提取DNA并进行扩增，研究古生物的遗传信息。

五、PCR实验注意事项1. 引物设计：引物应具有良好的特异性和稳定性，避免产生非特异性扩增和二级结构。

干货分享PCR知识分享

干货分享PCR知识分享01PCR 的基本原理PCR是一种选择性体外快速扩增DNA片段的方法。

在体外以类似于细胞内DNA的半保留复制过程，以拟扩增的模板DNA分子，与模板DNA互补的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4种dNTP及适合的缓冲体系组成的反应体系，经过重复地变性一退火一延伸三步，扩增新的目的DNA链，这个过程通过控制反应体系的温度来实现。

PCR包含下列三步反应：1、变性(denaturation)将反应体系混合物经加热至94℃左右，维持较短的时间，使双链DNA变成单链DNA，便于下一步引物的结合。

2、退火(annealing)将反应体系温度下降到特定温度（一般是引物的Tm值以下)，引物与DNA模板以碱基互补的方式结合，形成模板-引物杂交双链。

退火温度是保证引物与DNA模板互补结合的关键。

由于引物结构简单，加之引物量远远大于模板DNA的数量，所以DNA模板单链之间的互补结合很少。

3、延伸(elongation)将反应体系的温度上升到72℃左右并维持一段时间，在Taq DNA 聚合酶的作用下，以引物为起始点，以4种单核苷酸（dNTP）为底物，从5'→3'方向延伸反应，合成新的DNA双链。

以上三步反应为一个循环，重复进行变性、退火、延伸这三步反应，如此反复循环可以使DNA以指数形式进行扩增。

上述过程1.5小时左右完成，从而使所需的目的DNA片段扩增放大百万倍。

02PCR反应液成分PCR反应体系主要包含以下五种成分1、模板（template)模板即扩增用的DNA，可以是任何来源DNA(如基因组DNA、质粒DNA等)或RNA（如总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA 等），但必须符合两个条件：一是纯度必须较高，二是浓度不能太高以免抑制。

50μl PCR反应体系中模板DNA推荐使用量如下表所示2、引物（primers)人工合成的一对引物可以分别与两条模板DNA互补结合的寡核苷酸序列，其中一条称为上游引物，另一条称为下游引物。

PCR介绍

dNTPs:
0.6μl×6 = 3.6μl
引物 P：
2.4μl ×6 = 14.4μl
Taq 酶 (5U/μl)： 0.2μl × 6 = 1.2μl
水：
21μl × 6 = 126μl
共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时
混匀（管壁上液体沉至管底）。
2. 另取 5 支0.2ml Ep管，分别加入上述液体29μl。 3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支 Ep 管中，混
加热90～95℃，30 ～ 60 s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94 ℃ 30 ″，可使各种复杂的DNA分子完全变性。
温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
⑵ 复性温度和时间：
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。
总原则是提高扩增的效率和特异性
引物设计原则
⑴ 长度15～30 b，过短特异性降低，过长则成本增加，产量也下降。
⑵ 引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G+C 含量宜在45 ～ 55%左右。
⑶ 引物内部不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构，两个引物之间尤其在 3’ 末端不应有互补链存在，不然会形成引物二聚体。
3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。

pcr实验知识点总结

pcr实验知识点总结PCR（聚合酶链反应）是一种体外扩增DNA片段的技术，由Kary Mullis在1983年发明。

自那时以来，这项技术已成为分子生物学、遗传学、医学和法医学等领域的基础工具。

以下是关于PCR实验的知识点总结。

一、PCR原理PCR的原理是利用DNA聚合酶对DNA进行复制的过程。

通过循环加热和冷却的过程，将目标DNA序列扩增到数百万份甚至数十亿份。

每个循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。

二、PCR所需材料与设备1. 材料：模板DNA、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、缓冲液等。

2. 设备：PCR仪（热循环器）、离心机、电泳设备、凝胶成像系统等。

三、PCR反应体系的建立一个标准的PCR反应体系通常包含以下成分：- 模板DNA：10-100 ng- 正向引物和反向引物：各0.5-2 μM- dNTPs：每种200 μM- 缓冲液：1X- Taq DNA聚合酶：1.5-2 U- 无菌水：补足至总体积20-50 μL四、PCR反应条件设置1. 变性：94℃，1-3分钟2. 退火：根据引物Tm值设定，一般为55-65℃，持续时间15-30秒3. 延伸：72℃，持续时间1-2分钟4. 循环次数：通常为25-35次五、PCR产物分析1. 凝胶电泳：是最常用的PCR产物分析方法，可以直观地观察PCR产物的大小和数量。

2. 克隆和测序：对于需要进一步研究的PCR产物，可以通过克隆和测序来确定其精确序列。

六、PCR的应用1. 遗传病诊断：如地中海贫血、囊性纤维化等遗传病的基因诊断。

2. 法医鉴定：如亲子鉴定、个体识别等。

3. 病原体检测：如HIV、乙肝病毒、新冠病毒等的检测。

4. 肿瘤基因检测：如BRCA1/2突变的检测。

5. 生物科技研究：如基因克隆、基因表达分析等。

七、PCR实验常见问题及解决办法1. 无扩增产物：可能的原因有模板质量差、引物设计不合理、PCR条件不合适等。

可通过优化模板提取、重新设计引物或调整PCR条件来解决。

pcr技术高考知识点

pcr技术高考知识点PCR(聚合酶链反应)技术是一种在生物学领域广泛应用的技术，其重要性不言而喻。

下面将从基本原理、步骤、应用领域和发展前景等方面总结PCR技术的高考知识点。

一、基本原理PCR技术利用DNA聚合酶酶和少量的DNA模板，在适宜的温度条件下进行连续的DNA链反应，从而在短时间内扩增目标DNA序列。

其基本原理包括三个步骤：变性、退火和延伸。

1. 变性：将待扩增的DNA样本加热至高温，使其双链DNA解链成两条单链，得到模板DNA。

2. 退火：降温使引物与模板DNA序列互补结合，形成引物-模板复合物。

3. 延伸：在适宜的温度下加入DNA聚合酶和四种核苷酸，使DNA聚合酶沿引物分别向3'端延伸，合成新的DNA链。

二、PCR步骤标准PCR反应通常包括三个步骤：预变性、循环反应和最终延伸。

1. 预变性：在PCR反应开始之前，将反应体系加热到95°C，使所有DNA双链变性。

2. 循环反应：PCR反应周期通常为30~40个循环，每个循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。

这些循环依次进行，逐渐扩增目标DNA 序列。

3. 最终延伸：在最后一个循环的最后，将反应体系保持在延伸温度下一段时间，以确保所有未完成的DNA链都得到完全延伸。

三、PCR应用领域PCR技术在生物学和医学研究中有着广泛的应用。

以下是几个常见的应用领域：1. 基因检测：PCR技术可用于检测特定基因的突变、拷贝数变异和染色体重排等。

例如，PCR可以用于检测遗传病、癌症和传染病等。

2. DNA克隆：PCR技术可用于快速扩增DNA片段，为DNA克隆提供模板。

通过PCR技术，科学家可以扩增特定的基因片段，从而进行进一步的研究。

3. DNA测序：PCR技术可用于扩增需要测序的DNA片段，从而提供足够的DNA模板。

这样，科学家可以对该DNA片段进行测序，以研究其碱基序列。

4. DNA指纹：PCR技术可用于DNA指纹分析，用于刑事侦查、亲子鉴定和个体识别等。

pcr考试知识点总结

pcr考试知识点总结PCR技术的应用非常广泛，它可以用于DNA克隆、基因突变检测、病毒检测、DNA指纹分析、基因组学研究等领域。

由于PCR技术的灵敏度高、特异度强、操作简单易行，因此在科学研究、医学诊断和法医领域有着广泛的应用。

下面我们来总结一下PCR技术的知识点，包括PCR的基本原理、PCR反应体系、PCR试剂与仪器、PCR扩增条件优化、PCR产品分析与检测等方面。

一、PCR技术的基本原理PCR技术是通过不断重复进行核酸的复制，从而实现对特定DNA序列的扩增。

具体的步骤如下：1. 双链DNA的变性（Denaturation）：将双链DNA在高温条件下变性为两条单链DNA。

2. 引物结合（Annealing）：将引物与单链DNA互相结合形成引物-DNA复合物。

3. DNA合成（Extension）：在酶的作用下，引物向DNA模板进行延伸合成新的DNA链。

通过以上三个步骤的重复，就可以逐步合成出大量的特定DNA序列。

PCR技术的基本原理就是依靠这种不断重复的核酸合成，来扩增特定的DNA片段。

二、PCR反应体系PCR反应的体系是非常重要的，它直接影响到PCR反应的效果。

PCR反应体系一般包括以下几个关键组成部分：DNA模板、引物、dNTPs、聚合酶、缓冲液和辅助剂等。

1. DNA模板：PCR反应最基本的前提条件是要有一段目标DNA序列的模板。

DNA模板可以来源于各种不同的样品，包括基因组DNA、cDNA、质粒DNA等。

2. 引物：引物是PCR反应中非常重要的组成部分，它决定了PCR反应扩增的目标序列。

引物通常由20-30个核苷酸组成，要求引物的序列与目标DNA的两个末端相互互补。

3. dNTPs：dNTPs是DNA聚合酶在反应中合成DNA所必需的四种核苷酸单元，即脱氧核苷三磷酸腺苷（dATP）、脱氧核苷三磷酸鸟苷（dGTP）、脱氧核苷三磷酸胸苷（dCTP）和脱氧核苷三磷酸胸苷（dTTP）。

4. 聚合酶：PCR反应中所需的聚合酶主要是DNA聚合酶，它是一个酶的混合物，可以在一定温度下将dNTPs与引物结合，从而合成新的DNA链。

PCR具体操作时用

PCR具体操作时用引言PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链反应，是一种在生物学和分子生物学研究中常用的实验技术，用于扩增特定DNA片段。

PCR具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用领域，因此在基因工程、医学诊断、生物学研究等领域发挥着重要作用。

本文将介绍PCR具体操作时常用的试剂和设备，以及操作步骤和注意事项。

试剂和设备试剂•DNA模板：需要扩增的DNA片段的起始材料。

•增值引物（Primers）：针对待扩增片段的两个段位特异性引物。

•dNTPs：脱氧核苷三磷酸，为PCR过程提供扩增所需的四种脱氧核苷酸。

•缓冲液：提供适宜的酶活性环境，保持pH的稳定和缓冲能力。

•DNA聚合酶（Taq酶）：常用的DNA聚合酶，能耐高温。

设备•PCR仪：用于控制反应液的温度和时间。

•离心机：用于离心反应液和分离沉淀物。

•电泳仪：用于电泳分离扩增产物。

操作步骤1.准备反应液根据PCR所需物质的浓度和体积计算，将DNA模板、引物、dNTPs、缓冲液和聚合酶按比例加入一条无菌试管中，形成PCR反应液。

2.加热将PCR反应液放入PCR仪中，按照设定的程序进行加热。

一般来说，PCR反应需要经历以下几个温度环节：变性、退火和延伸。

3.循环根据所需扩增序列的长度和反应条件，将PCR循环进行多次。

每一次循环包括温度的升高和降低。

4.检测扩增产物取出PCR反应液，通过电泳将反应液中的扩增产物进行分离。

利用染料染色或其他检测方法，观察分离出的扩增产物，并进行分析和测定。

注意事项1.实验条件和参数要准确，包括反应体系的组成、引物浓度、温度和时间的控制等。

2.手术无菌操作，防止污染物污染反应液。

3.DNA模板应纯净，避免引入其他杂质。

4.引物的设计要合理，能够选择性扩增所需片段。

5.扩增产物要进行正确的电泳和检测，确保准确性和可靠性。

结论PCR是一项广泛应用于生物学研究的重要技术。

它在医学、遗传学、生物工程等领域发挥着重要作用。

PCR技术基础知识

反应体系-主要成分
TAQ DNA聚合酶：一种热稳定的DNA聚合酶，耐高温，94℃保持1H，仍有50%以上活性
5’ → 3’聚合酶活性 5’ → 3’核酸外切酶活性酶浓度高，易产生非特异性扩增；酶浓度低，导致扩增效率低，产物量少
反应体系-主要成分
引物：人工合成的寡核苷酸序列，通常有两条功能：作为核苷酸聚合过程的起始点，TaqDNA聚合酶可由其3’端开始合成新的核酸链探针：人工合成的一段寡核苷酸序列，与目的基因两条链中的其中一条链的部分序列互补，qPCR中，探针序列两端标记有荧光染料引物探针序列决定反应的特异性，浓度影响反应特异性，引物长度、碱基组成决定反应的退火温度
半保留复制
DNA在进行复制的时候链间氢键断裂，双链解旋分开 •每条链作为模板在其上合成互补链，经过一系列酶（DNA聚合酶、解旋酶、链接酶等）的作用生成两个新的DNA双螺旋结构 •子代DNA双螺旋结构中的一条链来自亲代DNA，另一条链是：
•DNA保存于pH8.0的TE溶液中
•变性：模板DNA或经PCR扩增形成的DNA经加热至94℃左右一定时间后，双链之间氢键断裂，双股螺旋解链，变成两条单链 •退火（复性）：DNA加热变性成单链后，当温度降至一定程度（55℃左右）时，引物即与模板DNA单链的互补序列配对结合 •延伸：在TaqDNA聚合酶的作用下，DNA模板上的引物以dNTP为原料，按A-T、C-G碱基配对与半保留复制原则，合成一条新的与模板DNA链互补的链
核酸的化学组成与结构
•核苷酸的碱基有5种：A，G，C，T，U •DNA：由A，G，C，T构成，呈规则的双螺旋结构 •RNA：由A，G，C，U构成，呈单链结构
核苷酸的碱基互补配对原则
DNA双链的碱基之间通过氢键形成一一对应关系 •A==T(U)互补配对，G===C互补配对 •温度升高，可以使碱基之间的氢键断裂，DNA双链分离成单链 •温度降低，碱基之间可重新配对相连，形成DNA双链；

PCR技术知识点概括1

PCR（聚合酶链式反应）DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适的PH缓冲液存在条件下延申引物模板dna ——94℃变性五分钟——55℃退火70℃引物延申——模板变性退火——延申一．PCR重要特征：扩增产物片段大小由两个引物与模板的结合位点决定；经过PCR扩增后，产物以指数级增加，可达到目的片段扩增的目的二．PCR反应五要素：核酸模板，引物，DNA聚合酶，ｄNTP，Mｇ２＋，缓冲液三．核酸模板1.可以是DNA或RNA为模板对靶向序列进行PCR扩增【RNA：在PCR之前先性逆转录为ｃDNA】2.PCR对制品的要求不高，可以是粗制品，但是核酸制品中不含任何蛋白酶，核酸酶，DNA 聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白3.PCR一般加入１０２－１０５拷贝的靶序列4.扩增不同拷贝数的序列时，加入的含靶序列的DNA量不同5.对于大分子量的模板DNA，在扩增前最好先机械剪切或限制性酶消化6.闭合环状质粒做模板时，最好先线性化处理，以提高扩增效率四，引物１.引物是PCR特异性的关键，PCR产物的特异性取决于引物和模板DNA的互补程度。

理论上，只要知道任意DNA模板序列，就能设计互补的寡核苷酸链做引物。

２.利用PCR可将模板DNA在体外进行大量扩增，PCR的特异性由一堆上下游引物所决定３.PCR引物设计的基本原则：最大限度提高扩增效率和特异性；尽可能抑制非特异性扩增４.设计引物应当遵循的原则：【１】引物长度（１５－３０ｂｐ），不宜过长或过短，常用２０ｂｐ左右【２】引物扩增跨度：以２００－５００ｂｐ为宜，特定条件下可扩增长至１０ｋｂ的片段【３】引物碱基G+C的含量：以４０－６０％为宜，G+C含量太少扩增效果不佳，G+C含量过多易出现非特异性条带【４】碱基分布：ATGC最好随机分布，避免嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列【５】引物自身及引物之间不应存在互补序列（避免引物内部出现二级结构，避免３‘端互补形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带）【６】引物３’端的碱基，末端碱基应该严格配对，以避免末端碱基不配对而PCR失败【７】引物５‘端不严格，可以修饰【９】引物的特异性【１０】引物量。

PCR基本知识

PCR一.PCR1.原理技术原理DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

工作原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50~60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70~75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

2.反应五要素参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+（1）引物设计A.引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

B.引物应遵守以下原则①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

（引物长度一般在15~30碱基之间）②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。

ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列（G+C 含量在40%~60%之间，碱基要随机分布）.④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

生物高考知识点pcr

生物高考知识点pcrPCR（聚合酶链反应）是一种重要的生物技术手段，广泛应用于生物学、医学等领域。

本文将从PCR的原理、步骤、应用以及未来发展等方面进行论述。

一、PCR的原理PCR是一种体外的DNA扩增技术，通过合成DNA引物和DNA聚合酶的作用，使得目标DNA在体外进行连续的复制，从而快速产生大量目标DNA。

二、PCR的步骤1. 反应体系的配制：PCR反应需要DNA模板、引物、核苷酸、缓冲液和DNA聚合酶等组成的反应体系。

2. Denaturation（变性）：将反应体系加热至90-95摄氏度，使DNA双链解开成为两条单链。

3. Annealing（退火）：将反应体系温度降低至50-65摄氏度，使引物与目标DNA序列互相结合。

4. Extension（延伸）：将反应体系温度回升至72摄氏度，DNA聚合酶沿着引物开始复制目标DNA序列。

5. 循环反应：通过循环反复进行变性、退火和延伸，每一轮循环都会产生两倍数量的目标DNA。

三、PCR的应用1. 分子诊断：PCR可以检测病原体的存在，如检测病毒、细菌等致病微生物，对疾病的早期诊断具有重要意义。

2. DNA指纹鉴定：PCR可以扩增DNA片段，通过比较不同个体的DNA带型，进行个体识别、亲子鉴定等方面的应用。

3. 基因工程：PCR可以扩增目标基因，从而进行基因克隆、基因表达、基因敲除等研究。

4. 古生物学研究：PCR可以从古生物化石中提取DNA，对古代生物进行鉴定和研究，揭示生物进化和地球历史。

四、PCR的发展趋势1. 实时定量PCR：利用荧光标记的探针实时监测PCR反应过程，可以实现定量检测和动态分析。

2. 微流控PCR：利用微流控芯片技术，将PCR反应在微型通道中进行，实现PCR的自动化、高通量和快速检测。

3. 数字PCR：通过稀释DNA模板，使每个液滴只包含一个DNA 分子，实现PCR反应的数目计数和精确定量。

4. 多重PCR：同时扩增多个目标序列，提高实验效率和节省样本。

PCR有关知识

[1] PCR引物设计的原则引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。

必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。

根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：1.引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。

2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。

引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。

3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。

不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。

另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。

5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。

4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。

PCR程序设计相关知识.doc

基本PCR引物设计参数引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。

特异性是指发生错误引发的频率。

特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。

①引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度控制。

如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。

引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。

为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。

总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。

每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。

引物设计时使合成的寡核苷酸链（18～24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。

②引物的二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。

这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。

对于引物的3’末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于- 5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5’端的要求可适当放宽。

引物自身形成的发卡结构，也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。

应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。

③引物GC含量和Tm值PCR引物应该保持合理的GC含量。

含有50％的G+C的20个碱基的寡核苷酸链的Tm值大概在56～62℃范围内，这可为有效退火提供足够热度。

一对引物的GC含量和Tm值应该协调。

协调性差的引物对的效率和特异性都较差，因为降低了Tm值导致特异性的丧失。

这种情况下引物Tm值越高，其错误引发的机率也越大。

若采用太高的退火温度，Tm值低的引物对可能完全不发挥作用。