免疫组化在血液肿瘤病理诊断中地应用及意义(一)

免疫组化在血液肿瘤病理诊断中的应用及意义（一）

IHC方法相对简单，但从取材到发报告之间环节较多，任何环节的疏忽都可能造成检测结果偏差，甚至导致漏诊、误诊。除IHC染色常规注意事项外，血液肿瘤标本的检测还有其特殊性。 1.标本的前期处理

血液系统疾病病理诊断标本，主要是淋巴结、脾脏和骨髓组织。与其它组织相似，造血细胞表面抗原不同其稳定性会有差异，从而对固定剂的耐受性不同。组织固定的原则，是采用10%中性福尔马林作为固定剂，固定时间最好不超过24小时。

(1)淋巴结：取材后迅速固定，待组织表面变硬即可修块。以淋巴结大小为直径，厚度不超过3mm，以使组织得到充分的固定。如淋巴结中有淤血、坏死成分，应尽量除去。组织制片中的每个步骤都应严格掌握，以免破坏组织的抗原活性。(2)脾脏：脾脏组织较大，应注意多点取材；脾脏又是贮血器官，含血量多，取材时应尽量除去积血；取材大小以2×2×7.5px 为宜，取材后尽快固定。在多块标本中，病理医师应根据HE切片，挑出病变明显的1～2 块作IHC 染色。(3)骨髓组织：特点为组织小，主要为骨质，造血细胞充斥于骨小梁之间。在组织制片的每个步骤都应相应缩短时间。骨髓组织制片需要脱钙，酸性脱钙液对抗原活性有影

响，常规采用的2%硝酸，脱钙不应超过3小时。EDTA脱钙液偏碱性，比较温和，效果较好，只是时间长，约需24～48小时。(4)骨髓涂片：某些情况下当骨髓组织取材不好，如太小或组织为骨皮质、血凝块等不能进行石蜡包埋制片时，可用骨髓涂片代替。但注意骨髓涂片不能太厚，最好不混血。涂片稍干后用甲醇：丙酮(1：1)固定90秒后染色。涂片不能在室温下久存。(5)外周血涂片：某些特殊情况不能采用穿刺骨髓取材时，可用外周血涂片代替。前提是外周血有核细胞总数必须较多，结果才相对可靠，固定同骨髓涂片。(6)组织印片：当疾病诊断和分型必需的标记物不能用于石蜡切片时，可用组织印片来补救。将新鲜软组织取材后，按取材大小平放于干净的载玻片上，轻压，然后垂直取下标本，组织表面的细胞即印在玻片上，风干，固定同骨髓涂片。组织印片与冰冻切片相似，由于形态不好，除特殊情况外，临床上尽量不用。 2.IHC所采用的检测系统IHC染色方法很多，如免疫荧光、免疫酶标、免疫金标。免疫酶标是以酶标记的抗体与组织或细胞作用后，加入酶的底物生成有色产物，通过光镜对细胞表面或细胞内抗原进行定位。免疫酶标以其标记酶不同又分为标记过氧化物酶(HRP)法，如ABC、SP及相应二步法；标记碱性磷酸酶(AP)法，如SAP及相应的二步法。葡萄糖氧化酶(GOD)分子量较大，具有较多的氨基酸，在标记时易形成广泛的聚合，影响酶活

性，现已较少使用。目前最常用的是SP、SAP及二步法。脾脏、淋巴结切片IHC染色可采用SP及相应的二步法，DAB 显色。此法敏感性高，阳性定位准，保存时间长。而骨髓中的红细胞、粒细胞、单核组织细胞含有丰富的内源性HRP、H2O2处理效果不理想，可造成非特异着色而影响结果的分析。故在做骨髓切片、骨髓涂片、外周血涂片染色时，我们常选择AP标记的SAP及相应的二步法，核固红或BcLP/NBT 显色。此系统敏感性尚好，但定位不及SP法，保存时间较短。 3.抗体的选择

抗体的正确选择是IHC染色的关键。血液系统肿瘤免疫分型主要用CD系列的白血病分化抗原。考虑到患者对检测费用的承受能力，在病理诊断中，主要采用认真而全面的HE形态学观察提出初步诊断与鉴别诊断意见，再据此选择适应的抗体。这就需要病理医师准确掌握各种抗体的作用，适应范围和可能发生的交叉反应。选择抗体的原则是：

(1)当造血系统肿瘤(主要是淋巴瘤)与其它非造血系统未分化小细胞肿瘤难以区分时，首先选用LCA、NSE、CK等抗体组合，以确定肿瘤的组织来源。(2)病理诊断需作IHC来辅助诊断与鉴别诊断时，要根据组织形态学，考虑首选的抗体与鉴别诊断的抗体，首选抗体中至少应用两个以上的抗体联合检测。鉴别诊断的抗体应选敏感性强及广谱的抗体。(3)抗体的敏感性、特异性有很大差别，在选择抗体

时，要兼顾到这两个方面。如T细胞淋巴瘤，选择敏感性好的CD45R0与特异性强的CD3组合。同时，由于现有检测抗体并非白血病细胞特异性试剂，而是针对不同人血细胞分化抗原的单抗，因此进行分型时，需要配套抗体联合使用、综合分析、统一判断。 4.检测结果的分析

IHC 染色理想的结果是：阳性反应部位明确、色泽鲜艳、背景清晰、对比度好。但由于诸如石蜡制片质量、不同组织内源性因素、不同厂家、不同批号抗体质量的差异、抗原修复方式等因素的影响，染色结果并不一定理想。所以病理医师在分析结果时，首先要分清阳性细胞是反应性细胞，残留细胞还是肿瘤性细胞，在确定阳性肿瘤细胞后，一般根据以下几方面综合分析，得出正确的诊断。

(1)阳性定位：

阳性细胞的定位是IHC诊断的重要依据。不同抗原阳性表达可分别定位于细胞膜、细胞质、细胞核或膜/质、核/质等不同部位，不在特定部位表达应视为阴性。(2)阳性强度和阳性率：

依据欧洲EGIL免疫分型建议，如果正常细胞成分在骨髓和外周血中只占极少部分时，具有某些分化相关抗原的髓系细胞＞20% 、淋系细胞＞30% 则考虑白血病细胞。但也不能仅依靠阳性率的高低作为分型的唯一依据。某一种标记只要是瘤细胞，即使数量不多亦可作为分型依据。阳性强度

取决于细胞中抗原含量的多少，也与肿瘤细胞分化的不一致性有关，致使阳性表达有强弱之分。(3)阳性细胞的分布：骨髓及外周血涂片、骨髓组织切片，在多数情况下，阳性标记瘤细胞呈弥漫性或散在性均匀分布，偶见小灶性分布，如转移癌、淋巴瘤累及骨髓的部分类型。故阳性结果常以计数阳性率来表示。如阳性标记细胞有形态上的异常再加以注明。而脾脏、淋巴结细胞密度大，正常情况下T、B淋巴细胞有一定的分布区域，一般B淋巴细胞占整个淋巴细胞群体的25～50%，T淋巴细胞约占50～75%。不同类型淋巴瘤细胞分布也不同，所以计数百分率不完全准确。

确定单克隆性增生：大多数情况下，T或B阳性瘤细胞占绝对优势，在正常应该分布较少的区域也广泛增生；有时T、B两系均有不同程度表达，可能是由于交叉反应或双标记所致，应选择更特异的抗体检测；个别情况下T、B标记均不满意，则以HE瘤细胞形态特点来确定类型。阳性细胞数量只是诸多判定因素之一，阳性瘤细胞的分布和形态是淋巴瘤分型的重要依据，如滤泡性淋巴瘤生发中心BcL-2阳性；弥漫大B细胞淋巴瘤肿瘤性大细胞CD20阳性及生发中心BcL-6阳性；霍奇金淋巴瘤H/RS细胞CD30阳性均具有诊断意义。(4)如何区别特异性与非特异性反应：

IHC染色结果有时并不理想。如何区别特异性与非特异性结果，得出科学的结论呢？一般来说，特异性反应产物常