【Y2H操作方法-HXY整理】

实验步骤说明**：

1. 诱饵质粒pGBKT7-bait的构建

2.诱饵融合蛋白BD-bait对AH109酵母的自激活作用及毒性的检测【重要的前期准备】

3. 人胰腺cDNA文库的滴定和扩增【不用做了，直接用质粒】

4. 转化AH109酵母后转化子（阳性克隆）的筛选【顺序转化或共转化】

5. 蛋白质相互作用的验证【一对一验证】

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2.诱饵融合蛋白BD-bait对AH109酵母的自激活作用及毒性的检测

2.1 LacZ自激活的检测.

2.2 HIS3自激活的检测

2.3 融合蛋白对酵母菌的毒性检测

4. 文库转化AH109酵母后转化子的筛选

4.1 文库质粒转化pGBKT7-bait/AH109酵母

使用标准的PEG/LiAc转化法将文库质粒转化入已含有pGBKT7-bait质粒的AH109酵母，涂布在SD-Ade-His-Leu-Trp平板上进行重组子筛选

4.2 报告基因ADE2、HIS3和lacZ激活的验证

ADE2、HIS3的激活：酵母能够在SD-Ade-His-Leu-Trp平板生长

LacZ的激活：β-半乳糖苷酶显色反应呈蓝色

4.3 pACT2-cDNA质粒的获取：

①从酵母中抽提质粒，得到pGBKT7-bait和pACT2-cDNA的混合物

②转化E. coli，涂布在含Amp的LB平板上，由于质粒不相容性，转化子中便只含有pACT2-cDNA质粒

③从转化成功的E. coli中抽提出pACT2-cDNA质粒

5. 蛋白质相互作用的验证【一对一验证】

5.1 由于酵母双杂交的假阳性很普遍，所以筛选得到相互作用蛋白的cDNA序列之后，还应将分离出

的各种pACT2-cDNA再次单独转化pGBKT7-bait/AH109酵母，即一对一验证，再次检测它们对报告基因的激活情况，排除假阳性

5.2 将pACT2-cDNA质粒送测序，得到cDNA片段的序列，在NCBI数据库Blast查出其对应的蛋白

质

5.3 另外，还必须分析这些pACT2-cDNA质粒的构建情况。由于商品文库构建的特殊性，要特别关注

这些插入的cDNA片段是否发生了frameshift

5.4 在上述验证都通过的情况下，仍然需要用诸如免疫共沉淀、GST-pull down、细胞共定位等实验来

对这些相互作用来进行验证

公司的这三个操作手册：

相关质粒载体【更多详细信息见质粒图谱】

酵母双杂交系统3的质粒信息

Fusion 表位酵母筛选标记细菌筛选标记

pGBKT7 DNA/bait c-Myc TRP1 kanamycin Control vectors

pCL1 GAL4 LEU2 ampicillin

图2.3 pGBKT7的限制性酶切图谱

pGBKT7的多克隆位点图谱

pCL1质粒图谱

另外附上：文库质粒的载体pACT2 和AD-prey构建的载体pGADT7的信息：

实验所用菌株基因型及其用途

菌株 基因型

用途

E coli DH5α

F-ф80dlacZ △M15 recAl endAl gurA96 thi-1

hsdR17(rk-mk+) supE44 relA1 deoR

△（lacZYA-argF ）U169

用于质粒的扩增与转化

AH109

MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4, gal80

LYS2 : : GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3 : : MEL1UAS-MEL1 TATA-lacZ

用于酵母双杂交中的诱饵融合蛋白的宿主菌及酵母双杂交筛选

AH109酵母菌的报告基因：

AH109酵母菌的表型：

培养液和固体培养基

●大肠杆菌培养基及相关试剂 LB 培养基：

蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠

10g

加蒸馏水至1000mL ，调整pH 到7.0，高温高压灭菌。

固体LB 培养基：在液体LB 培养基中加入琼脂粉至终浓度1.5-2.0％。

配制抗生素培养基时，氨苄青霉素的最终浓度为60μg/mL ，卡那霉素的最终浓度为50μg/mL 。 ●酵母培养基及相关试剂【注意：含有葡萄糖，灭菌时间不要超过20min ，一般15min ，过长时间导致碳

化变黑】

无氨基酸酵母氮源（YNB）为Difco产品；L-Arginine HCl、L-Histidine HCl monohydrate、L-Lysine HCl、L-Uracill购自Sigma；腺嘌呤半硫酸盐（Adenine hemisulfate salt）购自Amresco；其它各种氨基酸均为国产分析纯。

YPD培养液：

蛋白胨 20g

酵母提取物 10g

葡萄糖 20g

加水至1000mL，调pH5.8，高温高压灭菌。

YPDA培养液：在1L YPD培养基中加入15ml 0.2％腺嘌呤半硫酸盐至终浓度为0.003％，调pH5.8，灭菌

0.2%腺嘌呤半硫酸盐配方：0.4387g Ademin Sulfate 溶于200ml ddH2O 过滤灭菌，4℃保存

固体YPDA培养基：YPDA培养液中加入琼脂粉至浓度为2.0％。

10×省却成分培养基（简称10×DO培养基）：

按照下表的配方分别配制：

一缺10×DO：10×DO/-Trp，10×DO/-Leu

二缺10×DO：10×DO/-Trp/-His，10×DO/-Leu/-Trp

三缺10×DO：10×DO/-Trp/-Leu/-His

四缺10×DO：10×DO/-Trp/-Leu/-His/-Ade

各种氨基酸在10×DO溶液中的浓度（按需要省去部分氨基酸）

氨基酸10×浓度

L-Adenine hemisulfate salt 200 mg/L

L-Arginine HCl 200 mg/L

L-Histidine HCl monohydrate 200 mg/L

L-Isoleucine 300 mg/L

L-Leucine 1000 mg/L

L-Lysine HCl 300 mg/L

L-Methionine 200 mg/L

L-Phenylalanine 500 mg/L

L-Threonine 2000 mg/L

L-Tryptophan 200 mg/L

L-Tyrosine 300 mg/L

L-Uracil 200 mg/L

L-Valine 1500 mg/L

完全极限培养基(亦称缺陷型培养基、选择性压力培养基)：

YNB 6.7g

10×DO 100ML

Glucose 20g

加水至1000mL，

调pH5.8，灭菌。

固体培养基：上述液体培养基加入琼脂粉至浓度2%。

酵母转化试剂【化学法转化】

10×TE缓冲液： 0.1M Tris-HCl，10mM EDTA (pH 7.5)，高压灭菌。