微生物的分离纯化与接种技术
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（2）分区划线分离法（每人划1块营养琼脂平板）
a. 灭菌接种环。 b. 冷却后，蘸取少许混匀的菌液，划线于平板培养基 表面a处。 c. 再将接种环灭菌。 d. 冷却后，从a处将菌划出至b处。 e. 接种环再次灭菌。 f. 从b处划出至c处。 g. 再次灭菌接种环。 h. 从c处划出至d处。 i. 将平皿倒置于37℃培养箱中培养24h后观察结果。
实验六 微生物的分离纯化与接种技术
一、实验目的
1.掌握常用接种工具的使用 2.掌握斜面培养基、液体培养基接种法 3.掌握倒平板技术 4.掌握各种分离单菌落的技术
二、实验原理
• 接种是微生物实验及科研的一项最基本的操作技 术，是将一种微生物移接到灭过菌的新培养基的 过程。接种方法有斜面接种、液体接种、平板接 种、穿刺接种等。在接种过程中，为了确保纯种 不被杂菌污染，必须采用严格的无菌操作。 • 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株 微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分 离法普遍用于微生物的分离与纯化。 • 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落通常 是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑 取单菌落而获得一种纯培养。获取单菌落可用稀 释平板法、划线分离法等。
斜面接种示意图
四、实验步骤
3. 液体接种（每人接种2支液体试管，1支斜面 接液体，1支液体接液体）
• 操作方法与前相同，但要使试管口向上斜，以免 培养基流出。 • 接入菌体后，使接种环和管内壁摩擦几下以利洗 下环上菌体，接种后塞好棉塞将试管在手掌中轻 轻敲打，使菌体充分分散。 • 将接种好的试管斜面放到37℃培养箱中培养24h 后观察结果。
四、实验步骤
（4）用无菌移液管分别吸取10-2，10-3，10-4三 个稀释度的菌液各0.1mL，加入相应编号的营 养琼脂平板中。（注意移液管不能混用） （5）用无菌涂布棒涂抹均匀。（涂抹不同稀释 度菌液要用不同的涂布棒） （6）等菌液吸收进培养基后将平板倒置于37℃ 培养箱中培养24h后观察结果。
四、实验步骤
（3）稀释菌液。取1支无菌移液管，按无菌操 作的方法吸取1mL菌液于10-1试管中。另取1 支无菌移液管，在10-1中吹吸数次，混匀后吸 取1mL菌液至10-2管中。另取1支无菌移液管 ，在10-2中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至 10-3管中。另取1支无菌移液管，在10-3中吹吸 数次，混匀后吸取1mL菌液至10-4管中。（注 意移液管不能混用）
四、实验步骤
四、实验步骤
四、实验步骤
7. 稀释倾注法（每组稀释10-2，10-3，10-4稀释 度菌液各加1mL菌液到平板，倾注培养基分离）
（1）熔化培养基。电炉加热熔化另一瓶60mL营养 琼脂培养基，将熔化的培养基放于45℃水浴中保温 待用。 （2）取4支装有9mL无菌水的试管，依次编号10-1， 10-2，10-3，10-4 ，再取3个无菌空平板，分别编号 10-2，10-3，10-4 。 （3）稀释菌液。取1支无菌移液管，按无菌操作的 方法吸取1mL菌液于10-1试管中。另取1支无菌移液 管，在10-1中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至10-2 管中。另取1支无菌移液管，在10-2中吹吸数次，混 匀后吸取1mL菌液至10-3管中。另取1支无菌移液管， 在10-3中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至10-4管中。
六、思考题
1. 为什么接种环接种前后都要消毒？ 2. 固体琼脂平板为什么要倒置培养？
3. 实验室常用哪几种方法分离纯种细菌？
四、实验步骤
四、实验步骤
5. 琼脂平板划线分离法 • 琼脂平板划线分离的方法一般有连续划线分 离法和分区划线分离法。 （1）连续划线分离法（每人划1块营养琼脂 平板） a.灭菌接种环，冷却后取适量混匀的菌液。 b.在培养基表面连续“之”字形划线，直至划 完整个平板表面。
四、实验步骤
连续划线法
四、实验步骤
五、注意事项
1. 接种环在接种前后都要消毒。 2. 接种环消毒后伸入菌种管蘸取菌种之前， 要在试管内壁上靠一靠，以冷却铂丝的温度， 使不至于烫伤菌种。 3. 用接种环在培养基表面划线分离时，不要 太用力，以免划破培养基。 4. 培养皿一定要倒置培养。 5. 混匀菌液与培养基时注意不能摇出气泡。 6. 用过的沾菌的吸管和涂布棒应放入0.1%的 新洁尔灭溶液中浸泡10min以后才能清洗。
三、实验器材及试剂
• 接种环、酒精灯、试管、移液管、培养皿、 涂布棒、营养琼脂培养基、营养肉汤培养 基、生理盐水、大肠杆菌菌液。
四、实验步骤
1. 接种环的使用 • 接种环是用铂丝或细电炉丝制成的，使用 前后都要用酒精灯外焰严格灭菌。
接种环的灭菌方法
四、实验步骤
2. 斜面接种（每人接种2支试管斜面，1支斜面 接斜面，1支液体接斜面）
四、实验步骤
灭菌接种环
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环
第三区划线 灭菌接种环
四、实验步骤
四、实ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ步骤
6. 稀释涂布法（每组稀释10-2，10-3，10-4稀释 度菌液各涂布1块平板）
（1）倒平板：电炉加热熔化其中一瓶60 mL营养 琼脂培养基。待培养基冷却到50℃左右（用手抓 瓶子不烫手）后，取3个无菌培养皿，每皿倒入 15～20mL培养基（自然铺满整个底面为准）， 等凝固后备用。 （2）取4支装有9mL无菌生理盐水的试管，依次编 号10-1，10-2，10-3，10-4，再取3个倒好营养琼脂 培养基的平板，分别编号10-2，10-3，10-4 。
四、实验步骤
（4）用无菌移液管分别吸取10-2，10-3，10-4 三个稀释度的菌液各1mL，加入相应编号的 空平板中。 （5）取保温于45℃水浴中的营养琼脂培养基 倒入上述平板中，每板倒入15～20mL培养基， 立即平面旋摇使菌液与培养基充分混匀，盖上 平板盖子。 （6）等培养基凝固后将平板倒置于37℃培养 箱中培养24h后观察结果。
• 将菌种管（若是液体菌种应先摇匀）与空白斜面培养基管 握在左手大拇指和其他四指之间，菌种管位于上侧，培养 基管位于下侧，斜面均向上。 • 右手持接种环火焰灭菌。以右手掌心、小指和无名指同时 夹取两管口的棉塞，将两试管口迅速通过火焰灭菌。 • 在火焰附近，用灭菌的接种环从菌种管挑取少量菌苔或一 环菌液，伸进待接种的培养基管斜面底部，向上“Z”形 划线。接种时不要划破培养基表面，沾菌的接种环进出试 管时不应触及试管口。 • 接种完后灼烧管口，塞上棉塞。灼烧接种环，放回原处。 • 将接种好的试管斜面放到37℃培养箱中培养24h后观察结 果。
四、实验步骤
4. 倒平板（每组倒6或8块营养琼脂平板） （1）熔化培养基：电炉加热熔化120mL（或 160mL）那瓶营养琼脂培养基（电炉加热时 人要在旁边看着，防止培养基爆沸！）。 （2）倒平板：待培养基冷却到50℃左右（用 手抓瓶子不烫手）后，取无菌培养皿，每皿 倒入15～20mL培养基（自然铺满整个底面 为准），等凝固后备用。
a. 灭菌接种环。 b. 冷却后，蘸取少许混匀的菌液，划线于平板培养基 表面a处。 c. 再将接种环灭菌。 d. 冷却后，从a处将菌划出至b处。 e. 接种环再次灭菌。 f. 从b处划出至c处。 g. 再次灭菌接种环。 h. 从c处划出至d处。 i. 将平皿倒置于37℃培养箱中培养24h后观察结果。
实验六 微生物的分离纯化与接种技术
一、实验目的
1.掌握常用接种工具的使用 2.掌握斜面培养基、液体培养基接种法 3.掌握倒平板技术 4.掌握各种分离单菌落的技术
二、实验原理
• 接种是微生物实验及科研的一项最基本的操作技 术，是将一种微生物移接到灭过菌的新培养基的 过程。接种方法有斜面接种、液体接种、平板接 种、穿刺接种等。在接种过程中，为了确保纯种 不被杂菌污染，必须采用严格的无菌操作。 • 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株 微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分 离法普遍用于微生物的分离与纯化。 • 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落通常 是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑 取单菌落而获得一种纯培养。获取单菌落可用稀 释平板法、划线分离法等。
斜面接种示意图
四、实验步骤
3. 液体接种（每人接种2支液体试管，1支斜面 接液体，1支液体接液体）
• 操作方法与前相同，但要使试管口向上斜，以免 培养基流出。 • 接入菌体后，使接种环和管内壁摩擦几下以利洗 下环上菌体，接种后塞好棉塞将试管在手掌中轻 轻敲打，使菌体充分分散。 • 将接种好的试管斜面放到37℃培养箱中培养24h 后观察结果。
四、实验步骤
（4）用无菌移液管分别吸取10-2，10-3，10-4三 个稀释度的菌液各0.1mL，加入相应编号的营 养琼脂平板中。（注意移液管不能混用） （5）用无菌涂布棒涂抹均匀。（涂抹不同稀释 度菌液要用不同的涂布棒） （6）等菌液吸收进培养基后将平板倒置于37℃ 培养箱中培养24h后观察结果。
四、实验步骤
（3）稀释菌液。取1支无菌移液管，按无菌操 作的方法吸取1mL菌液于10-1试管中。另取1 支无菌移液管，在10-1中吹吸数次，混匀后吸 取1mL菌液至10-2管中。另取1支无菌移液管 ，在10-2中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至 10-3管中。另取1支无菌移液管，在10-3中吹吸 数次，混匀后吸取1mL菌液至10-4管中。（注 意移液管不能混用）
四、实验步骤
四、实验步骤
四、实验步骤
7. 稀释倾注法（每组稀释10-2，10-3，10-4稀释 度菌液各加1mL菌液到平板，倾注培养基分离）
（1）熔化培养基。电炉加热熔化另一瓶60mL营养 琼脂培养基，将熔化的培养基放于45℃水浴中保温 待用。 （2）取4支装有9mL无菌水的试管，依次编号10-1， 10-2，10-3，10-4 ，再取3个无菌空平板，分别编号 10-2，10-3，10-4 。 （3）稀释菌液。取1支无菌移液管，按无菌操作的 方法吸取1mL菌液于10-1试管中。另取1支无菌移液 管，在10-1中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至10-2 管中。另取1支无菌移液管，在10-2中吹吸数次，混 匀后吸取1mL菌液至10-3管中。另取1支无菌移液管， 在10-3中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至10-4管中。
六、思考题
1. 为什么接种环接种前后都要消毒？ 2. 固体琼脂平板为什么要倒置培养？
3. 实验室常用哪几种方法分离纯种细菌？
四、实验步骤
四、实验步骤
5. 琼脂平板划线分离法 • 琼脂平板划线分离的方法一般有连续划线分 离法和分区划线分离法。 （1）连续划线分离法（每人划1块营养琼脂 平板） a.灭菌接种环，冷却后取适量混匀的菌液。 b.在培养基表面连续“之”字形划线，直至划 完整个平板表面。
四、实验步骤
连续划线法
四、实验步骤
五、注意事项
1. 接种环在接种前后都要消毒。 2. 接种环消毒后伸入菌种管蘸取菌种之前， 要在试管内壁上靠一靠，以冷却铂丝的温度， 使不至于烫伤菌种。 3. 用接种环在培养基表面划线分离时，不要 太用力，以免划破培养基。 4. 培养皿一定要倒置培养。 5. 混匀菌液与培养基时注意不能摇出气泡。 6. 用过的沾菌的吸管和涂布棒应放入0.1%的 新洁尔灭溶液中浸泡10min以后才能清洗。
三、实验器材及试剂
• 接种环、酒精灯、试管、移液管、培养皿、 涂布棒、营养琼脂培养基、营养肉汤培养 基、生理盐水、大肠杆菌菌液。
四、实验步骤
1. 接种环的使用 • 接种环是用铂丝或细电炉丝制成的，使用 前后都要用酒精灯外焰严格灭菌。
接种环的灭菌方法
四、实验步骤
2. 斜面接种（每人接种2支试管斜面，1支斜面 接斜面，1支液体接斜面）
四、实验步骤
灭菌接种环
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环
第三区划线 灭菌接种环
四、实验步骤
四、实ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ步骤
6. 稀释涂布法（每组稀释10-2，10-3，10-4稀释 度菌液各涂布1块平板）
（1）倒平板：电炉加热熔化其中一瓶60 mL营养 琼脂培养基。待培养基冷却到50℃左右（用手抓 瓶子不烫手）后，取3个无菌培养皿，每皿倒入 15～20mL培养基（自然铺满整个底面为准）， 等凝固后备用。 （2）取4支装有9mL无菌生理盐水的试管，依次编 号10-1，10-2，10-3，10-4，再取3个倒好营养琼脂 培养基的平板，分别编号10-2，10-3，10-4 。
四、实验步骤
（4）用无菌移液管分别吸取10-2，10-3，10-4 三个稀释度的菌液各1mL，加入相应编号的 空平板中。 （5）取保温于45℃水浴中的营养琼脂培养基 倒入上述平板中，每板倒入15～20mL培养基， 立即平面旋摇使菌液与培养基充分混匀，盖上 平板盖子。 （6）等培养基凝固后将平板倒置于37℃培养 箱中培养24h后观察结果。
• 将菌种管（若是液体菌种应先摇匀）与空白斜面培养基管 握在左手大拇指和其他四指之间，菌种管位于上侧，培养 基管位于下侧，斜面均向上。 • 右手持接种环火焰灭菌。以右手掌心、小指和无名指同时 夹取两管口的棉塞，将两试管口迅速通过火焰灭菌。 • 在火焰附近，用灭菌的接种环从菌种管挑取少量菌苔或一 环菌液，伸进待接种的培养基管斜面底部，向上“Z”形 划线。接种时不要划破培养基表面，沾菌的接种环进出试 管时不应触及试管口。 • 接种完后灼烧管口，塞上棉塞。灼烧接种环，放回原处。 • 将接种好的试管斜面放到37℃培养箱中培养24h后观察结 果。
四、实验步骤
4. 倒平板（每组倒6或8块营养琼脂平板） （1）熔化培养基：电炉加热熔化120mL（或 160mL）那瓶营养琼脂培养基（电炉加热时 人要在旁边看着，防止培养基爆沸！）。 （2）倒平板：待培养基冷却到50℃左右（用 手抓瓶子不烫手）后，取无菌培养皿，每皿 倒入15～20mL培养基（自然铺满整个底面 为准），等凝固后备用。