微生物的分离纯化与接种技术
微生物的分离纯化综合实验
一、实验方案
1. 实验现象与结果
2. 本实验的关键环节及改进措施
⑴、接种环的灭菌操作要到位:接种环使用前, 直接在酒精灯上烧灼灭菌, 把环和金属丝烧红即可。
接种环使用后, 先在火焰周围把环上标本烤干, 再烧灼灭菌, 以免标本汽化, 爆烈四溅, 污染环境。
金属杆快速通过火焰2－3次, 杀灭表面微生物。
⑵、划线技术要很娴熟,具体要求参照上图。
⑶、整个过程要严格防止实验中被污染,每个阶梯稀释换新的移液管,要等平板冷却后再倒置。
思考题
1.食品中微生物为何繁殖迅速、种类繁多？
2.食品被微生物污染后有哪些危害？
3、检样稀释时, 每个稀释度都要更换刻度吸管, 为什么？
1.答:因为食品中含有大量的淀粉、蛋白质、糖类、脂肪等有机物, 且无机盐含量相对较低, 食品中含有一定的水分, 并且食品包装后容易使内部升温, 这些都是很适合微生物(细菌、原虫、病毒)生长繁殖的情况, 因此食品中的微生物能够繁殖迅速且种类繁多。
所以很多食物要严格灭菌或者添加防腐剂、干燥剂、脱氧剂等, 或者真空包装。
2.答:⑴、降低食品的营养；
⑵、引起食品腐败变质；
⑶、引起呕吐、中毒或者某些疾病(如痢疾、腹泻、呼吸道感染等)和潜在性的慢性危
害等。
3.答: 每个稀释度都要更换刻度吸管可以在一定程度上保证不会沾有上一个稀释度得溶液, 且减少污染, 使浓度稀释得更加准确, 增加实验结果的准确性。
指导教师评语及评分:
签名: 年月日。
分离纯化技术
1:1000），取1:1000 稀释液1ml置于灭菌的平皿中，然后倾 注熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基，摇 匀后待琼脂凝固 ，制成含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现单个菌落 。
五、涂布分离培养技术
1.稀释涂布平板法
Staphylococcus aureus on blood agar, illustration b-hemolysis.
Staphylococcus epidermidis on blood agar With on hemolysis
细菌纯培养
细菌斜面 纯培养法
液体培养基
半固体培养基穿刺培养
5.注意事项
①平板不能倒得太薄，最好在使用前一天倒好。为防止平板表面产生冷凝水，倒平板前 培养基温度不能太高。
②用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些（2%左右），否则会因平板太软而被划破。 ③用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm），环口应十分圆滑，划线时环口与平板
间的夹角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板。 ④为了取得良好的划线效果，可事先用圆纸垫在空培养皿内画上4区，并用接种环练习
， 最后，将左手所持皿底放回皿盖中。 烧去接种环上的残菌
4 恒温培养 将划线后的平板至37℃倒置培养2~3天。 5 挑单菌落 良好的结果应在C区出现部分单菌落，而在D区出现较多独立分布的单菌落。然后从 典型的单菌落中挑取少量菌体至试管斜面，经培养后即为初步分离的纯种。
6 清洗、处理 清洗培养皿，将废弃的带菌平板作高压杀菌后进行清洗、晾干。
一、原理： 1、将待分离的样品进行一系列的稀释，使稀释样
品中的微生物或孢子呈分散状态； 2、然后在适宜的培养机和培养条件下长出单菌落， 3、再将单菌落转移培养，重复此过程两、三次便可获
微生物的分离、接种和培养技术
微生物的分离、接种和培养技术一、实验的目的和内容目的：掌握微生物接种和分离纯化技术，掌握无菌操作技术。
内容：用平板划线法分离微生物；学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。
二、基本原理在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的。
因此，为了取出特定的微生物进行纯培养，必须从中把他们分离出来。
微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。
无菌操作是微生物接种技术的关键。
接种是将微生物或微生物悬液引入新鲜培养基的过程。
由于实验目的、培养基种类及实验器皿等不同，所用接种方法不尽相同。
斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。
分离培养微生物时，要考虑微生物对外界的物理、化学等因素的影响。
即选择该类微生物最适合的培养基和培养条件。
在分离、接种、培养过程中，均需严格的无菌操作，防止杂菌侵入，所用的器具必须经过灭菌，接种工具无论使用前后都要经过灭菌，且在无菌室或无菌箱中进行。
三、材料及器材（一）菌种：大肠杆菌、枯草杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌。
（二）培养基：肉汤培养基试管斜面，肉汤半固体培养基，肉汤固体培养基试管斜面，肉汤固体培养基平板，查氏培养基试管斜面，查氏培养基平板。
易（三）仪器及其他工具：接种环，接种针，接种钩，镊子，酒精灯，火柴，酒精棉，试管架，标签纸，恒温培养箱等。
四、方法与步骤（一）接种。
1、试管菌种转接：试管细菌菌种转接主要用于菌种的活化、分离、纯化。
（1）将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与其他四指之间，用右手的无名指与小指和手掌边拔出棉塞并挟住。
（2）置试管口于酒精火焰附近。
（3）将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰3次，然后再放入有菌试管中，在管壁上停留片刻待其冷却。
（4）取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。
（5）取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。
（6）重新塞上棉塞。
（7）烧死接种工具上的残余菌，把试管和接种工具放回原处。
微生物的接种分离和纯培养
穿刺接种技术：用接种针从菌种斜面上挑取 少量菌体并竖直穿刺到半固 体培养基中；
接种无菌操作步骤
1. 将菌种斜面和待接种新鲜斜面夹在左手 的食指、中指和无名指之间，大拇指按在两 只试管中间。右手旋松棉塞，便于拔出； 2. 右手拿接种环，竖直伸入火焰中，环端 及伸入试管中部分均充分灭菌；
I
冷却至 45℃左右
每皿约倒入15ml
肉汤培养基
II
III
0.2ml 0.2ml
0.2ml
微生物的计数
血球计数法 平板活菌计数法
计繁殖数法只适宜于单细胞状态的微生物 或丝状微生物产生的孢子
血球计数法
一、实验原理
血球计数器是一特制的厚载玻片，上面 刻有一定面积的方格，将盖玻片盖上后，由 于两者之间存在着距离使之形成一定容积的 小室。滴入待测样品后，使样品均匀充满小 室，在显微镜下计算小室内的菌数，换算成 单位体积的样品中所含的菌数。
度。
思考题
1. 微生物的纯种分离通常采用那些方法，并说明个 方法的特点。
2. 什么叫微生物的污染？如何防止？ 3. 从两种方法计数得出的菌液浓度是否一致？分析
误差产生的原因，由此比较一下两者的优缺点及 各自的适用范围。 4. 平板活菌计数中，为何选择生长有25～250个菌 落的平板？
碰到火焰，以免烧死菌体 6. 血球计数器要洁净干燥，滴入菌液时在盖玻片与
载玻片间不能有气泡 7. 血球计数时显微镜光线不宜太亮
实验安排（三人一组）
斜面接种：每组三支 液体接种：每组三支（大肠、四联、枯草各一支） 穿刺接种：每组二支（四联一支、变形一支） 平板划线分离：每人划一块平板（混合菌液) 稀释分离：I、II、III各一块平板（混合菌液) 血球计数：写出小格数目，并算出酵母菌液
微生物的接种与分离纯化技术及培养方法
微生物的接种与分离纯化技术及培养方法
（一）接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
1、接种工具和方法
1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀
2、常用的接种方法
•１）划线接种２）点植接种３）穿刺接种４）倾注接种
•５）涂布接种６）液体接种７）注射接种８）活体接种
(二)、分离纯化
1 稀释倾注平板法：
1、先稀释样品，加入平板
2、倒平板时注意培养基温度
3、混合均匀
３、平板划线法：.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.
四格法
平板划线法：1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。
2、划线方法
微生物的培养方法
（一）一般培养法（需氧培养）
•培养温度:25~37℃；接种后平板、试管、三角瓶，置于恒温培养箱
（二）、厌氧培养方法
1、简易的厌氧培养法：
•（1）庖肉培养法
•（2）铁丝圈厌氧培养法
•（3）焦性没食子酸法
2、厌氧罐法
3、厌氧手套箱法
A、厌氧缸法：厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
•接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内
培养。
B、厌氧罐法：装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气(N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V)。
（三）二氧化碳培养法
•1、烛缸法2、二氧化碳置換法
•3、化学法：每一升用重碳酸钠0.4克与浓盐酸0.35亳升加入
•4、二氧化碳培养箱法。
微生物的分离与纯化实验报告
微生物的分离与纯化实验报告实验目的：
通过实验了解微生物分离的基本原理和方法；掌握微生物纯化方法，了解常用的分离培养基和微生物培养条件。
实验原理：
微生物的分离和纯化是微生物学中的基本实验技术之一。
微生物分离的基本原理是把混合菌落使之分离成单一菌落，并将分离出的单一菌落进行种类鉴定。
微生物纯化是指从混合菌落中将目标微生物菌种分离出来并纯化到原核培养物中。
实验步骤：
1. 原始样品的处理
将样品取一定量于无菌 Erlenmeyer瓶内，加入相应容积的生理盐水，均匀搅拌，并制成1：10、1：100、1：1000等稀释液。
2. 稀释液接种分离培养基
将稀释液通过平板涂布法、斜面培养法或混悬液播种法接种于相应的分离培养基中。
3. 观察菌落生长情况
分别观察不同菌液在不同培养基中生长情况，并根据菌落特征确定是否为单一菌种。
4. 分离纯化单一菌落
通过稀释、涂片和感染小白鼠等方法，将菌落分离纯化并制备鉴定鉴定纯菌株。
实验结果：
通过实验，我们成功地从样品中分离出多种微生物，并用分离纯化方法分离出了单一的微生物菌种。
结论：
通过微生物的分离和纯化实验，我们掌握了微生物分离的基本原理和方法，成功分离出单一菌种并加以鉴定。
这对于微生物学基础研究和其它相关领域具有重要的意义。
实验四 微生物的分离、纯化和接种
实验四微生物的分离、纯化和接种（一）微生物的分离、纯化1 目的1.1 了解微生物分离和纯化的原理1.2 掌握常用的分离纯化微生物的方法2 原理从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。
值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。
3 材料3.1 培养基淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。
3.2 溶液或试剂10%酚液，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。
3.3 仪器或其它用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板、涂布器等。
4 流程倒平板→制备梯度稀释液→涂布（或划线法）→培养→挑单菌落→保存。
5 步骤5.1 稀释涂布平板法5.1.1 倒平板将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶化待冷至55～60℃时，高氏I号琼脂培养基中加入10%酚数滴，马丁氏培养中加入链霉素溶液(终浓度为30μg/ml)，混合均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。
微生物的接种分离和纯培养
接种工具：接种环、接种针、 移液管和刮铲等
○ 接种必须在严格无菌的环 境中进行！
试验材料
菌种：四联球菌，大肠杆菌，枯 草杆菌，变形杆菌，混合菌液
培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养 基，牛肉
膏蛋白胨固体培养基，牛肉膏蛋 白胨半固体培养基
其他：接种针，接种环，培养皿， 吸管，记号笔等
以无菌操作用接种环 沾取待分离的混合菌 液；
左手持盛培养基的三 角瓶，在火焰附近， 用右手手掌边夹取棉 塞，将三角瓶转移到 右手，瓶口过火；
左手持培养皿底并使 其面向火焰，划线， 划线距离恰当（尽量 靠近，但线与线勿碰 到）。
左手取一无菌培养皿， 在火焰边稍稍打开皿 盖，倒入培养基15ml 左右，放在桌面上轻 轻摇匀，待凝后即成 平板；
微生物的接种分离和纯培养
什么是纯种培养？
自然界中的微生物都是杂居在一起的，通过分离，
01
使它们由混杂状态到单个个体在固体培养基上成为
一个菌落，就获得纯种。
原理是将待分离的样品进行一定的稀释，使之分散，
02
在固体培养基上形成单个菌落，再转接到适当的培
养基上，就认为是纯种。
接种技术
接种技术是将微生物接到适 于生长繁殖的人工培养基或 生物体内的过程。
穿刺接种技术
一．用接种针以无菌操作挑取少许菌体穿刺与半固体培养基中间，刺至管底， 再按原途退出。穿刺时要做到手稳、动作轻巧、快速；
二．塞紧棉塞后，放入37℃恒温培养箱内培养24小时观察结果。
实验步骤之二分离法
01
琼脂平板划线分离法
02 稀释分离法
琼脂平板划线分离法
牛肉膏蛋白胨琼脂培 养基加热熔化后，冷 却至45℃左右；
微生物分离纯化与接种技术
微生物分离纯化与接种技术微生物分离纯化与接种技术微生物学是一门研究微生物的学科，在医学、食品工业、环境保护等行业有着广泛的应用。
而微生物的研究需要用到微生物分离纯化与接种技术，这些技术可以让我们有效地获取纯净的微生物，并在实验室中控制其生长条件，从而更好地研究微生物的特性和应用价值。
按照微生物的性质，可以将微生物分为细菌、真菌和病毒三大类。
不同的微生物类型需要不同的分离纯化与接种技术。
细菌分离纯化技术是微生物学中最基础的技术，其中最常用的方法就是传统的培养基分离法。
这种方法直接将微生物置于固体培养基中，允许其在特定的温度和pH条件下生长，然后通过形态特征和生长习性的观察，将细菌区分出来。
而对于那些难以直接用固体培养基分离纯化出来的细菌，我们还可以采用流式细胞术分离法、限制性酶切片段长度多态性分析法等先进的分离技术。
真菌分离纯化技术一般采用无菌活体动物或者人工培养基的方法。
在真菌分离和鉴定时，需要根据真菌的外部形态、菌丝的生长特性和菌落的颜色等特征来进行区分和鉴定。
为了保证真菌的纯度，我们也需要通过重复传代、提取DNA序列、限制性酶切片段长度多态性分析等方法进行多角度的鉴定，以确保纯化出来的真菌种类正确。
病毒是一种极小的微生物，一般无法在常规的细胞培养中生长。
因此，分离纯化技术对于病毒的研究尤其重要。
常见的病毒分离技术有鸡胚培养、细胞培养等。
鸡胚培养可以在和病毒感染相同的生理和代谢环境下使病毒生长，而细胞培养则是让病毒通过培养基中细胞对它的反应来分离纯化。
此外，病毒也可以通过电镜、PCR等现代分析技术来进行分离纯化和鉴定。
接种技术是指将纯化出来的微生物直接加入到培养基或其他基质中，让它们在有利的环境中进行生长和加工。
接种技术对于微生物学的研究至关重要，它可以帮助我们更好地了解微生物的特性，有效地应用于医学、环境保护、食品工业以及其他相关行业。
总之，微生物分离纯化与接种技术是微生物学中的重要技术，在微生物学和相关行业中有着广泛的应用。
微生物纯种分离,培养及接种技术实验原理
微生物纯种分离,培养及接种技术实验原理微生物纯种分离、培养及接种技术是微生物学中最基本的实验技术之一。
其目的是从混合的微生物菌群中分离出单一的微生物菌落，并在适宜的培养条件下进行纯化和生长，以获得纯种微生物。
一、实验器材和试剂1.灭菌针2.毛细胞计数板3.显微镜4.平板接种器、针头5.无菌匀浆棒、吸管6.细菌培养基7.消毒液二、实验步骤1. 样品处理及制备首先需要选择一份待测试的样品，包括土样、水样、空气、食品等，然后将样品采集到无菌容器中，再将其送到实验室。
在进行样品处理之前，需要先进行简单的初步处理，将样品进行稀释或者过滤，将其中的杂质和大颗粒物去除，以利于后续实验的操作。
接下来需要进行制备培养基，根据不同的微生物种类，需要选择适当的培养基进行培养。
通常情况下，我们可以使用凝胶培养基、液体培养基、甜菜汁培养基等，以满足微生物在不同环境下生长所需的营养物和成分。
2.分离纯化分离纯化是该实验的关键步骤。
将经过预处理的样品移到无菌试管中，打开试管口，加入适量的制备好的培养基，然后利用匀浆棒或吸管将混合物均匀混合。
然后利用平板接种器将混合物接种到培养基平板上，使其密切接触。
然后将接种好的平板置于恒温箱中，以利于微生物的生长和营养物质的自我繁殖。
在接种后2-7天内，不同类型的微生物将在培养基平板上生长出不同的菌落，每一种菌落都代表一种单一的微生物。
将这些菌落分离提取，并再次进行培养，就能得到单纯的微生物菌种。
3.纯种微生物菌种接种在获得单纯的微生物菌种之后，需要将其再次接种到培养基中进行培育。
将相应体积的纯种菌种接种到培养基平板上，使其能够生长繁殖。
在接种后约24小时内，微生物将在培养基中生长出许多菌落。
根据菌落的特征和形态，可以对不同的微生物进行鉴定和分类。
如果需要进行更加深入的分析，可以对微生物菌种进行进一步培养、萃取定量和测序等工作，以获取更多的相关信息。
三、实验注意事项1. 实验前需要保证实验室内部环境和仪器均为无菌状态。
微生物的分离纯化实验报告
一、实验目的1. 理解微生物分离纯化的基本原理和方法。
2. 掌握倒平板、涂布平板等微生物接种技术。
3. 学习观察微生物的菌落形态特征，进行初步鉴定。
4. 培养无菌操作意识和实验室基本操作技能。
二、实验原理微生物的分离纯化是指从混杂的微生物群体中，分离出只含有一种或某一株微生物的过程。
实验中常用的分离纯化方法有稀释平板法、涂布平板法、划线分离法等。
通过在固体培养基上形成单菌落，可以实现对微生物的纯化。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂糖、无菌水、无菌棉签、无菌镊子、无菌培养皿、酒精灯、酒精棉球、显微镜等。
2. 仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、电子天平、无菌操作台等。
四、实验步骤1. 土壤样品的处理- 称取适量土壤样品，加入10倍体积的无菌水，充分振荡混匀。
- 以无菌操作，取1ml土壤悬液，加入9ml无菌水中，制成10^-1稀释液。
- 重复上述步骤，制成10^-2、10^-3等不同稀释度的土壤悬液。
2. 倒平板- 将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，待冷却至50-55℃时，倒入无菌培养皿中，使培养基厚度约为2-3mm。
- 待培养基凝固后，用无菌镊子取适量不同稀释度的土壤悬液，分别滴加到培养皿中。
- 将培养皿倒置，放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。
3. 涂布平板- 将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，待冷却至50-55℃时，倒入无菌培养皿中，使培养基厚度约为2-3mm。
- 待培养基凝固后，用无菌棉签蘸取适量土壤悬液，均匀涂布在培养皿表面。
- 将培养皿倒置，放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。
4. 划线分离- 将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，待冷却至50-55℃时，倒入无菌培养皿中，使培养基厚度约为2-3mm。
- 待培养基凝固后，用无菌接种针取适量土壤悬液，在培养皿表面进行划线分离。
- 将培养皿倒置，放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。
5. 菌落观察与鉴定- 观察不同平板上的菌落形态，记录菌落的颜色、大小、形状、边缘等特征。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
四、实验步骤
4. 倒平板（每组倒6或8块营养琼脂平板） （1）熔化培养基：电炉加热熔化120mL（或 160mL）那瓶营养琼脂培养基（电炉加热时 人要在旁边看着，防止培养基爆沸！）。 （2）倒平板：待培养基冷却到50℃左右（用 手抓瓶子不烫手）后，取无菌培养皿，每皿 倒入15～20mL培养基（自然铺满整个底面 为准），等凝固后备用。
四、实验步骤
（4）用无菌移液管分别吸取10-2，10-3，10-4 三个稀释度的菌液各1mL，加入相应编号的 空平板中。 （5）取保温于45℃水浴中的营养琼脂培养基 倒入上述平板中，每板倒入15～20mL培养基， 立即平面旋摇使菌液与培养基充分混匀，盖上 平板盖子。 （6）等培养基凝固后将平板倒置于37℃培养 箱中培养24h后观察结果。
（2）分区划线分离法（每人划1块营养琼脂平板）
a. 灭菌接种环。 b. 冷却后，蘸取少许混匀的菌液，划线于平板培养基 表面a处。 c. 再将接种环灭菌。 d. 冷却后，从a处将菌划出至b处。 e. 接种环再次灭菌。 f. 从b处划出至c处。 g. 再次灭菌接种环。 h. 从c处划出至d处。 i. 将平皿倒置于37℃培养箱中培养24h后观察结果。
四、实验步骤
（4）用无菌移液管分别吸取10-2，10-3，10-4三 个稀释度的菌液各0.1mL，加入相应编号的营 养琼脂平板中。（注意移液管不能混用） （5）用无菌涂布棒涂抹均匀。（涂抹不同稀释 度菌液要用不同的涂布棒） （6）等菌液吸收进培养基后将平板倒置于37℃ 培养箱中培养24h后观察结果。
三、实验器材及试剂
• 接种环、酒精灯、试管、移液管、培养皿、 涂布棒、营养琼脂培养基、营养肉汤培养 基、生理盐水、大肠杆菌菌液。
四、实验步骤
1. 接种环的使用 • 接种环是用铂丝或细电炉丝制成的，使用 前后都要用酒精灯外焰严格灭菌。
接种环的灭菌方法
四、实验步骤
2. 斜面接种（每人接种2支试管斜面，1支斜面 接斜面，1支液体接斜面）
四、实验步骤
灭菌接种环
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环
第三区划线 灭菌接种环
四、实验步骤
四、实验步骤
6. 稀释涂布法（每组稀释10-2，10-3，10-4稀释 度菌液各涂布1块平板）
（1）倒平板：电炉加热熔化其中一瓶60 mL营养 琼脂培养基。待培养基冷却到50℃左右（用手抓 瓶子不烫手）后，取3个无菌培养皿，每皿倒入 15～20mL培养基（自然铺满整个底面为准）， 等凝固后备用。 （2）取4支装有9mL无菌生理盐水的试管，依次编 号10-1，10-2，10-3，10-4，再取3个倒好营养琼脂 培养基的平板，分别编号10-2，10-3，10-4 。
• 将菌种管（若是液体菌种应先摇匀）与空白斜面培养基管 握在左手大拇指和其他四指之间，菌种管位于上侧，培养 基管位于下侧，斜面均向上。 • 右手持接种环火焰灭菌。以右手掌心、小指和无名指同时 夹取两管口的棉塞，将两试管口迅速通过火焰灭菌。 • 在火焰附近，用灭菌的接种环从菌种管挑取少量菌苔或一 环菌液，伸进待接种的培养基管斜面底部，向上“Z”形 划线。接种时不要划破培养基表面，沾菌的接种环进出试 管时不应触及试管口。 • 接种完后灼烧管口，塞上棉塞。灼烧接种环，放回原处。 • 将接种好的试管斜面放到37℃培养箱中培养24h后观察结 果。
四、实验步骤
（3）稀释菌液。取1支无菌移液管，按无菌操 作的方法吸取1mL菌液于10-1试管中。另取1 支无菌移液管，在10-1中吹吸数次，混匀后吸 取1mL菌液至10-2管中。另取1支无菌移液管 ，在10-2中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至 10-3管中。另取1支无菌移液管，在10-3中吹吸 数次，混匀后吸取1mL菌液至10-4管中。（注 意移液管不能混用）
四、实验步骤
四、实验பைடு நூலகம்骤
四、实验步骤
7. 稀释倾注法（每组稀释10-2，10-3，10-4稀释 度菌液各加1mL菌液到平板，倾注培养基分离）
（1）熔化培养基。电炉加热熔化另一瓶60mL营养 琼脂培养基，将熔化的培养基放于45℃水浴中保温 待用。 （2）取4支装有9mL无菌水的试管，依次编号10-1， 10-2，10-3，10-4 ，再取3个无菌空平板，分别编号 10-2，10-3，10-4 。 （3）稀释菌液。取1支无菌移液管，按无菌操作的 方法吸取1mL菌液于10-1试管中。另取1支无菌移液 管，在10-1中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至10-2 管中。另取1支无菌移液管，在10-2中吹吸数次，混 匀后吸取1mL菌液至10-3管中。另取1支无菌移液管， 在10-3中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至10-4管中。
五、注意事项
1. 接种环在接种前后都要消毒。 2. 接种环消毒后伸入菌种管蘸取菌种之前， 要在试管内壁上靠一靠，以冷却铂丝的温度， 使不至于烫伤菌种。 3. 用接种环在培养基表面划线分离时，不要 太用力，以免划破培养基。 4. 培养皿一定要倒置培养。 5. 混匀菌液与培养基时注意不能摇出气泡。 6. 用过的沾菌的吸管和涂布棒应放入0.1%的 新洁尔灭溶液中浸泡10min以后才能清洗。
实验六 微生物的分离纯化与接种技术
一、实验目的
1.掌握常用接种工具的使用 2.掌握斜面培养基、液体培养基接种法 3.掌握倒平板技术 4.掌握各种分离单菌落的技术
二、实验原理
• 接种是微生物实验及科研的一项最基本的操作技 术，是将一种微生物移接到灭过菌的新培养基的 过程。接种方法有斜面接种、液体接种、平板接 种、穿刺接种等。在接种过程中，为了确保纯种 不被杂菌污染，必须采用严格的无菌操作。 • 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株 微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分 离法普遍用于微生物的分离与纯化。 • 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落通常 是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑 取单菌落而获得一种纯培养。获取单菌落可用稀 释平板法、划线分离法等。
斜面接种示意图
四、实验步骤
3. 液体接种（每人接种2支液体试管，1支斜面 接液体，1支液体接液体）
• 操作方法与前相同，但要使试管口向上斜，以免 培养基流出。 • 接入菌体后，使接种环和管内壁摩擦几下以利洗 下环上菌体，接种后塞好棉塞将试管在手掌中轻 轻敲打，使菌体充分分散。 • 将接种好的试管斜面放到37℃培养箱中培养24h 后观察结果。
四、实验步骤
四、实验步骤
5. 琼脂平板划线分离法 • 琼脂平板划线分离的方法一般有连续划线分 离法和分区划线分离法。 （1）连续划线分离法（每人划1块营养琼脂 平板） a.灭菌接种环，冷却后取适量混匀的菌液。 b.在培养基表面连续“之”字形划线，直至划 完整个平板表面。
四、实验步骤
连续划线法
四、实验步骤
六、思考题
1. 为什么接种环接种前后都要消毒？ 2. 固体琼脂平板为什么要倒置培养？
3. 实验室常用哪几种方法分离纯种细菌？