3蛋白组学-生物质谱2

MALDI
(Matrix-assisted laser desorption/ionization)
MALDI
337 nm UV laser
cyano-hydroxy cinnamic acid
MALDI
MALDI
MALDI可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子 待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成
质量分析器
磁质谱仪 （magnetic-sector mass spectrometer）
• 经典质量分析器：带电粒子在磁场中运动受到罗伦兹力的作用转弯
m Br z 2V
r
2 2
m: 离子的质量 z: 离子所带电量 V: 离子飞行速度
B: 磁场强度
若固定加速电压U，连续改变磁场强度B，称为磁场扫描； 若固定磁场强度B，连续改变加速电压U，称为电场扫描（常用）。
MALDI Sample Limits



磷酸盐缓冲液 < 50 mM 重碳酸铵 < 30 mM Tris buffer < 100 mM 胍 (盐酸盐, 硫酸盐) < 1 M Triton < 0.1% SDS < 0.01% 碱金属盐 < 1 M 甘油 < 1%
MALDI 基质应具有的特性

缺点：碎片离子较复杂，图谱难以解析。
2、CAD模式

CAD与CID的原理一样，只是CAD采用串级质谱来实 现分子离子产生的碎片离子的过程。
第一个四极杆质谱仪选择单一的母离子进入第二级质谱仪，第二级质谱仪内充有惰 性气体，母离子飞入时与惰性气体分子发生碰撞产生碎片，碎片离子再经第三级质 谱仪得以检验。
空间串联质谱仪Biblioteka Baidu
MS/MS

优点： a) 高重现性(稳定性)； b) 最好定性分析工具； c) 可以实现高分辨； d) 高灵敏度； e) 宽的动态范围； f) 可以实现多级质谱的串 联； g) 高能collision-induced dissociation (CID) 谱重 现性好。

缺点:
a) 不能较好的与脉冲离子化技 术联用(如: MALDI)； b) 造价高，体积大； c) 联动扫描MS/MS谱的分辨率 低。

应用:
a) 所有的有机质谱分析方法； b) 精确质量测量； c) 定量分析； d) 同位素丰度比的测量。
飞行时间质谱仪 (Time-of-flight mass spectrometer)
1 2= mv qU 2 v = 2qU / m t= L L = v 2qU / m
U L m为离子的质量，q为离子所带的电荷，L为离子飞行的距离，v为离子的飞 行速度，V为离子的加速电压，z为离子所带的电荷数，e微电子的电量。
碎片谱图解析


由于蛋白质基本结构由肽键构成，肽键断裂的方式有ax、 by、cz三种。 所产生的碎片离子分别为a、b、c、x、y、z六种类型。含 有 N-terminal 碎片离子称为：a, b or c；含有C terminal 的碎片离子称为： x, y or z. 根据键能的大小，主要以b、Y型离子为主。
蛋白质组学
浙江大学 生命科学学院 江辉
第三章 生物质谱技术
考试时间：2014年11月28日（周五） 下午1：15-3：15 考试地点：东1A-218
闭卷考试，考生自带笔、计算器，不许带电脑、手 机以及能够上网的终端。
基质辅助激光解吸电离技术MALDI
(Matrix-assisted laser desorption/ionization)
Peptide Mass Fingerprinting
intact protein enzyme peptide fragments
MEMEKEFEQIDKSGSWAAIYQDIRHEASDFPCRVAKLPKNKNRNRYRDVS PFDHSRIKLHQEDNDYINASLIKMEEAQRSYILTQGPLPNTCGHFWEMVW EQKSRGVVMLNRVMEKGSLKCAQYWPQKEEKEMIFEDTNLKLTLISEDIK SYYTVRQLELENLTTQETREILHFHYTTWPDFGVPESPASFLNFLFKVRE SGSLSPEHGPVVVHCSAGIGRSGTFCLADTCLLLMDKRKDPSSVDIKKVL LEMRKFRMGLIQTADQLRFSYLAVIEGAKFIMGDSSVQDQWKELSHEDLE PPPEHIPPPPRPPKRILEPHNGKCREFFPNHQWVKEETQEDKDCPIKEEK GSPLNAAPYGIESMSQDTEVRSRVVGGSLRGAQAASPAKGEPSLPEKDED HALSYWKPFLVNMCVATVLTAGAYLCYRFLFNSNT
为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分
子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并 得到电离。 MALDI适用于生物大分子， 如肽类，核酸类化合物。可得 到分子离子峰，无明显碎片峰。 此电离方式特别适合于飞行时 间质谱计。


MALDI是以激光脉冲照射在固定于平面电极上的蛋白质 分子，经平行电场加速，在由质谱仪进行分析。以波长 337nm的氮气激光脉冲（此波长不会被蛋白质中的芳香环 状分子所吸收，避免蛋白质碎裂）击打固定于基质上的蛋 白质分子，使得蛋白质从基质上游离並帶上微弱的正电荷。 此时再经由高能平行电场加速提高核质比，进入质谱仪进 行分析，此方式能分析帶电量低的分子，以及含有許多不 同种类分子的混合物。 通常MALDI都会配上TOF（time of flight）分析器。 MALDI使用的基质有很多种，主要的三种为 :
MALDI


用激光轰击样品使其离子化。 样品先与能够吸收紫外波长的基质混合 （sinapinic acid for proteins, 4hydroxycinnaminic acid for peptides） 激光波长与基质的最大吸收波长相同，在 这个波长下，基质将本身的一部分能量传 递给样品。
Speed
capacity
slow
small
rapid
large
MS/MS capability
strong
weak
分析器
分析器
在蛋白质组学研究中，目前有三种分析仪 （analyzer）搭配ESI/ MALDI source使 用，分別是： triple quadrupole（三级四极杆） ion trap（离子肼） quadrupole-time of flight（四极杆-飞行 时间）

α-cyano-4-hydroxycinnamic acid （-氰基-4-羟基肉桂酸） 2,5-dihydroxybenzoic acid （2，5-二羟基苯甲酸） sinapinic acid（芥子酸）

其中α-cyano-4-hydroxycinnamic acid是最常用的基质。
3、PSD模式


PSD是常用于反射飞行时间质谱的一种碎片产生模式。 由于在离子的产生过程中，分子离子获得足够的能量，在飞向反射 场的过程中发生断裂，释放出多余的能量。 质量大的离子具有较高的动能，能进入反射场较深的位置；而质量 小的离子由于动能较小，只能进入反射场较浅的位置。
PSD测序
PSD mass spectrum of substance P in CHCA employing RE-TOF-MS. 15 kV accelerating potential, 50 laser pulses averaged for each reflector voltage segment.
质谱法结合数据库检索对蛋白质进行鉴定

肽质量指纹图谱（Peptide Mass Fingerprinting, PMF）法鉴定蛋白质




每个蛋白质经过酶解成为长短不一的肽段后，同一时 间获得所有肽段分子质量，而形成一个肽段分子质量 图谱，这个图谱对蛋白质应该是专一的、特异的，因 此称为肽质量指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)。 只需将实验获得的PMF 与蛋白质数据库中蛋白质的理 论PMF 比对就可以鉴定该蛋白质。 比传统方法速度快、通量高，是最早用于大规模蛋白 质鉴定的质谱方法，也是目前最简便的蛋白质鉴定方 法之一。 PMF 鉴定蛋白质是依赖数据库的。
生物学信息学的检索


对PMF 的实验结果和理论图谱进行比较和评价， 是将实验数据转换成具有生物学意义的结果的 关键。 目前已发展了不少算法和工具，这些软件都可 以在互联网上免费使用，当然互联网上的软件 使用的都是公用数据库。
Mascot查询结果
氨基酸序列质谱解析
碎片产生的模式


生物质谱仪可根据肽段的碎片离子之间的 质量差进行氨基酸序列的推测。 生物质谱产生碎片离子的模式常采用CID、 CAD、PSD等。
MALDI Ionization
+ + +-+ + + + ++ + +
+
+ + Matrix Laser

Analyte

基质发色团吸收紫外 激光，电离。 基质分裂，电荷转移 到分析物分子上 。 在超声波的作用下基 质膨胀，分析物被膨 胀的基质捕获。
+
+
MALDI



与ESI不同，MALDI 产生的分子离子只 带一个电荷。 正离子检测方式：M + H 负离子检测方式：M - H 比ESI方法有效 （tolerates salts and nonvolatile components） 容易使用与维护 样品的需求量 10 μL ，浓度 1 pmol/μL



能够嵌入样品分子间并能起到隔离样品分 子之间的相互作用（如形成共结晶）； 能溶解于可溶解样品分子的溶剂； 在真空状态下是稳定的； 可吸收激光，既与激光形成共振吸收； 可激发样品分子离子化。

样品引入方式 直接进样


优点： a) 快速获得分子量的信息； b) 快速获得混合肽的肽谱。

常 用 的 基 质
寡核苷酸
常用的 MALDI matrices at 337 nm(N2)
Matrix 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) 2,5-二羟基苯甲酸 3,5-Dimethoxy-4hydroxycinnamic acid (sinapinic acid) 3,5-二甲氧基-４-羟基肉硅酸（反 式） a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Α-腈基-４-羟基肉硅酸 Application Peptides, proteins, lipids, and oligosaccarides Peptides, proteins, and glycoproteins Peptides, proteins, lipids, and oligonucleotides
缺点: a) 金属离子干扰, Na, K； b) 离子源结构复杂； c) 没有LC/MALDI 接口； d) 实现MS/MS 困难； e) 需要基质
质量范围 分子量小于500,000 Da
Comparison of ESI and MALDI
Charge Sample preparation ESI multiple liquid MALDI single solid
1、CID模式

离子经过电喷雾源在进入质量检测器前，施加 一定的电压，使离子的运动速度大大提高，当 离子与中性分子撞击时，发生如下反应： A++N→（A+）* → B++C++D+
A+：离子（母离子） N：中性分子如Ar、N2 （A+）*：激发态离子（含有过多能量的分子离子） B+、C+、D+：分子离子产生的碎片离子
CID技术在肽测序方面的应用
De novo 蛋白质测序
含有 N terminal 碎片离子称为：a, b or c；含有C terminal的碎片离子称为： x, y or z.
CID分类


低能（Low Energy） CID特点:
反应发生在四极杆分析器和离子阱分析器； 质谱图中出现 N terminal 碎片离子：a, b or c 和C terminal的碎片离子： x, y or z. 但主要是形成 a, b 和 y系列离子。 在碎裂过程中易丢失中性小分子NH3 和H2O， 分别 形成 a*, b* 和 y* 和a0, b0 和y0。