Real-time_PCR(从原理到实验方法及数据分析)
实时荧光pcr原理
实时荧光pcr原理实时荧光PCR原理。
实时荧光PCR（Real-time PCR）是一种能够在PCR过程中实时监测DNA扩增情况的技术。
它通过引入荧光探针或染料，实时检测PCR反应体系中的DNA量的变化，从而实现对PCR过程的实时监测和定量分析。
实时荧光PCR的原理主要包括以下几个方面：1. 荧光探针。
在实时荧光PCR中，常用的荧光探针包括TaqMan探针、Molecular Beacon探针和SYBR Green染料。
这些荧光探针在PCR过程中与靶标DNA结合，并产生荧光信号。
通过检测荧光信号的强度，可以实时监测PCR反应的进程。
2. 荧光信号检测。
实时荧光PCR系统配备了特殊的光学检测装置，能够实时监测PCR反应体系中荧光信号的强度变化。
当靶标DNA逐渐扩增，荧光信号也会随之增加。
通过检测荧光信号的变化，可以实时获取PCR反应的动态信息。
3. 数据分析。
实时荧光PCR系统通常配备了专门的数据分析软件，能够实时处理和分析检测到的荧光信号。
通过对荧光信号的定量分析，可以计算出PCR反应体系中靶标DNA的初始量，并绘制出PCR扩增曲线。
通过PCR扩增曲线的形态和特征，可以对靶标DNA进行定量分析和检测。
4. 应用领域。
实时荧光PCR技术在生命科学领域有着广泛的应用，包括基因表达分析、病原微生物检测、基因型分析等方面。
由于其高灵敏度、高特异性和高准确性，实时荧光PCR已成为现代分子生物学研究和临床诊断中不可或缺的技术手段。
总结。
实时荧光PCR技术通过引入荧光探针和光学检测装置，实现了对PCR反应的实时监测和定量分析。
它在生命科学领域有着广泛的应用前景，为基因分析、疾病诊断和药物研发等领域提供了强大的技术支持。
随着技术的不断进步和完善，实时荧光PCR技术必将在未来发挥更加重要的作用。
实时定量pcr原理
实时定量pcr原理实时定量PCR原理。
实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是一种用于定量检测DNA或RNA的技术，它结合了PCR技术和荧光探针技术，能够在PCR过程中实时监测靶标的扩增情况，从而实现对靶标的定量分析。
本文将介绍实时定量PCR的原理及其在科研和临床中的应用。
实时定量PCR的原理。
实时定量PCR是在传统PCR技术的基础上发展而来的，其核心原理是通过不断测量PCR反应体系中的荧光信号强度来实时监测靶标的扩增情况。
在实时定量PCR中，通常使用荧光探针（如TaqMan探针、SYBR Green等）来标记靶标的扩增产物。
当PCR反应进行时，靶标的扩增产物会不断积累，荧光信号强度也会随之增加。
通过测量荧光信号强度的变化，可以确定靶标的起始量，并进行定量分析。
在实时定量PCR中，荧光信号强度的测量通常是通过实时荧光定量PCR仪来实现的。
这些仪器能够在PCR反应进行的同时，实时监测PCR管中的荧光信号强度，并将其转化为荧光信号曲线。
通过分析荧光信号曲线的特征，可以确定靶标的起始量，并计算出靶标在样本中的相对或绝对含量。
实时定量PCR的应用。
实时定量PCR在科研和临床中有着广泛的应用。
在基础科研领域，实时定量PCR常常用于基因表达分析、病原微生物检测、基因型鉴定等方面。
通过实时定量PCR技术，研究人员可以快速、准确地获取靶标在样本中的含量信息，从而揭示基因表达调控、病原微生物的感染情况、基因型的分布规律等重要信息。
在临床诊断领域，实时定量PCR也被广泛应用于疾病诊断、药物疗效监测、遗传病筛查等方面。
实时定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，能够快速、准确地检测靶标在临床样本中的含量，为临床诊断和治疗提供重要依据。
总结。
实时定量PCR作为一种高效、准确的分子生物学技术，已经成为科研和临床领域中不可或缺的工具。
通过实时监测PCR反应体系中的荧光信号强度，实时定量PCR能够实现对靶标的快速、准确的定量分析，为科研和临床诊断提供了强大的技术支持。
RealtimePCR原理及其定量方法
定量PCR技术： 通过对PCR扩增反应中每一 个循环产物荧光信号的实 时检测从而实现对起始模 板定量及定性的分析
2、荧光定量PCR常用的三个概念
扩增曲线、阈值、CT值
plateau phase Liner phase
Exponential phase
Normalised reporter Fluorescence （Rn)
另一种思路
由于PCR反应体系中荧光物质的荧光强度与PCR产物的量成 正比，所以可以用荧光强度来代替PCR产物的量，同时考虑 荧光本底值，则：
Rn= RB+ X0(1+ Ex) Rs
总荧光信号强度=本底信号+分子数量×单位信号强度
Rn：第n个循环时的总信号 RB：本底 RS：单位信号强度 X0：起始DNA数目 Ex：PCR扩增效率
线性关系、扩增效率确认
相关系数（R2）：大于0.98 标准曲线斜率: -3 到 -3.5 PCR扩增效率（Ex）: 0.9到1.2
扩增效率
106 105 104 103 102 10
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
扩增效率理论值为1，即每增加一个循环PCR产物加倍。
实时荧光定量PCR原理和定量方法 一、荧光定量PCR的原理
在PCR反应体系中加入荧 光基团，利用荧光信号累积 实现了实时监测整个PCR进程， 对起始模板进行定量分析的 方法。
三个关键词： 实时，定量，荧光
1、定量与常规PCR的差别
常规PCR技术： 对 PCR 扩 增 反 应 的 终产物进行定量及 定性分析
非理想的PCR反应：
Xn＝X0 ×（1＋Ex）n
n：扩增循环数 X0：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量 Ex：PCR扩增效率
real-time PCR 数据分析
real-time PCR 数据分析无论所使用的real-time PCR是何种型号，正确的数据分析对于获得有效的实验结果都是至关重要的。
这里介绍有关real-time PCR数据分析的知识。
在讨论基本分析过程之前，先介绍如何设计一个好的实验。
如果你是自己设计的引物和探针，那有助于下一步的工作。
但是在有些情况下，人们使用出版文献上的序列会更方便。
记住，即便是出版物提供的序列也不能保证会得到优化的实验结果。
而且排版错误的可能性也需要考虑在内。
所以进入实验室之前使用BLAST对全部序列进行核实确保他们是正确的。
下订单前先检察引物和探针的序列和Tm值是实验设计的基本要求。
标准曲线是判断实验质量的重要手段。
使用一个已知的模板，PCR产物，合成的寡核苷酸或转录的RNA做个标准曲线能够确定PCR的效率，敏感性，动态范围和其他的参数。
建立标准曲线时使用OD260的模板样本。
模板的总量以DNA分子的数量来描述，把质量转化为DNA含量的公式如下：（质量（克）*阿伏伽德罗常数）每个碱基的平均质量*模板的长度。
例如，合成70-mer的单链DNA，样本质量为0.8*10ˆ-11gm。
代入公式得：（0.8*10ˆ-11*6.023*10ˆ23molecules/mole）330gm/mole/base*70 base。
如果使用双链的模板，则碱基的平均质量为660gm/mole/base。
标准曲线使用的模板含量从1*10ˆ7开始连续稀释7次每次稀释10倍，最终得到10个模板拷贝。
这样的浓度有助于得到最高的ΔRn和最低的Ct。
用Excel画曲线时以模板数量的对数值为X，Ct（cycle threshold）值为Y轴。
标准曲线的计算公式如下：y=mx+b。
y就是Ct，m是斜率，x=log10template amount，b=y-intercept。
用斜率计算出实验效率Efficiency【10ˆ（-1/斜率）】-1。
实验效率告诉我们PCR反应的执行情况。
Agilent Real-time qPCR 检测 操作手册说明书
Real-time qPCR 检测操作手册1/ 6一、实验概述Real-time Quantitative PCR Detecting System ，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR 。
是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR 从定性到定量的飞跃。
二、实验流程三、实验材料： 1.主要试剂试剂名称 试剂来源 Cat.No. Trizol 上海普飞 3101-100 M-MLV promega M1705 dNTPs promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Bulge-LoopTM miRNA广州锐博 详见实验报告 qPCR Primer Set Rnase Inhibitor promega N2115 Primer(R&F) 上海生工 详见实验报告 SYBR Master MixtureTAKARADRR041B2/ 6样本收集Trizol 法抽取RNARNA 反转录获取cDNAReal-time qPCR2.主要器材器材名称来源Cat.NoNanodrop 分光光度计Thermo 2000/2000C稳压电泳仪上海天能EPS-600超细匀浆机FLUKO公司F6/10Real time PCR 仪器Agilent公司MX3000p反转录耗材Axygen四、实验步骤：1.总RNA 抽提（1）收取样品，Trizol 裂解。
细胞样品：收集细胞（6 孔板 80%细胞密度），2000 rpm 离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置 5 min，然后转移至新的 1.5 mL EP 管中；组织样品：将待研磨的组织样品从液氮或者-80℃冰箱中取出，无菌刀片于干冰上将组织样品切割成约 3 mm×3 mm×3 mm 大小，置于装有 1 mL Trizol 裂解液的 1.5mL EP 管中。
RT-PCR和realtimePCR原理及步骤
装载
将样品和试剂装入PCR板或 realtimePCR板中。
进样
将PCR板或realtimePCR板放 入仪器中开始反应。
评价和解读结果
1
数据分析
利用专业软件对荧光信号和扩增曲线进
基因表达计算
2
行分析。
比较样品之间的基因表达水平。
3
标准曲线制备
用标准品建立浓度和荧光信号之间的关 系。
实验控制和误差处理
1 防止样品污染
2 合理设计实验
避免引入外源DNA或RNA。
提前考虑样品数、重复次 数和阴性对照。
3 数据验证
CR的优缺点比较
RT-PCR
灵敏度高，适用于低表达基因，但结果需要后续凝 胶电泳分析。
realtimePCR
结果即时可见，无需后续分析，但对样品纯度和荧 光信号分析要求较高。
RT-PCR和realtimePCR的应用领域
医学诊断
RT-PCR和realtimePCR用于病 原体检测、基因突变分析和 疾病诊断。
基因表达分析
这两种技术用于研究基因调 控、蛋白质表达和细胞信号 传导。
环境监测
RT-PCR和realtimePCR可用于 检测环境中的微生物和污染 物。
RT-PCR和realtimePCR的原理
应用案例
• 基因表达差异分析 • 疾病诊断 • 新药研发 • 环境污染监测
发展前景
随着技术的不断改进，RT-PCR和realtimePCR在医学、生物学和环境科学等领 域都会有更广泛的应用。
结论与展望
RT-PCR和realtimePCR是重要的分子生物学技术，为科学研究、医学诊断和环 境监测提供了强大的工具。
RT-PCR和realtimePCR原理 及步骤
real time RT-PCR
Molecular Beacons
发夹型杂交探针
Molecular Beacons
原理：荧光谐振能量传递（ 原理：荧光谐振能量传递（FRET） ）
环
环与目标序列完全配对
茎
荧光素
茎由互补配对的序列组成
淬灭剂
Molecular Beacons 优点
对目标序列有很高的特异性 ——SNP检测最灵敏试剂之一 SNP检测最灵敏试剂之一 SNP 荧光背景低
朱红 空白 87.3
HC 、HSC 2d 1 HSC 4d 、 HSC 2d 2 88.3
63度20s 度
HSC 2d 1 、 HSC 4d 88.3
65度20s 度
标准曲线制备
体外转录RNA 体外转录 体外合成ssDNA 体外合成 纯化的质粒dsDNA 纯化的质粒 cDNA PCR产物 产物 将待测基因的PCR产物用胶回收试剂盒进 将待测基因的 产物用胶回收试剂盒进 行纯化，然后按10倍梯度稀释即可得到标 行纯化，然后按 倍梯度稀释即可得到标 准品，用于做标准曲线。 准品，用于做标准曲线。
Molecular Beacons 缺点
设计困难
只能用于一个特定的目标 价格较高
TaqMan
TaqMan
荧光素 淬灭剂
探针
水解型杂交探针
TaqMan
目标特异性探针 5’ 为荧光素， 3’ 为淬灭剂
5’ 荧光素 3’淬灭剂
与目标序列互补
TaqMan
R F Q R
工作原理
报告基团被淬灭
R 报告基团 Q 淬灭基团
Ct值的概念 Ct值的概念
Ct值的定义是 值的定义是PCR扩增过程中 ， 扩增产物 扩增过程中， 值的定义是 扩增过程中 (荧光信号）到达阈值时（进入指数增长期） 荧光信号） 荧光信号 到达阈值时（进入指数增长期） 所经过的扩增循环次数 所经过的扩增循环次数
实时荧光定量pcr的原理
实时荧光定量pcr的原理实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一种用于检测DNA或RNA的数量的分子生物学技术。
它通过利用荧光探针实时监测PCR反应过程中的DNA合成情况，从而可以快速、准确地定量目标序列的数量。
实时荧光定量PCR的原理基于PCR技术和荧光探针技术的结合，具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，因此被广泛应用于基础研究、临床诊断、环境监测等领域。
实时荧光定量PCR的原理主要包括PCR反应、荧光探针和检测系统三个方面。
首先，PCR反应是实时荧光定量PCR的核心步骤。
PCR反应通过不断循环的高温变性、低温退火和中温延伸，使目标DNA序列得以扩增。
在每一个PCR循环中，目标序列的数量呈指数增长，这种指数增长的特点为后续的定量提供了基础。
其次，荧光探针是实时荧光定量PCR的关键。
荧光探针是一种含有荧光染料和荧光淬灭剂的寡核苷酸探针，它与目标序列特异性结合，并在PCR反应中被3'→5'外切酶切割，释放出荧光信号。
荧光信号的强度与目标序列的数量成正比，因此可以通过监测荧光信号的变化来实现对目标序列数量的实时定量。
最后，检测系统是实时荧光定量PCR的重要组成部分。
检测系统包括荧光定量PCR仪和数据分析软件，它能够实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度，并将荧光信号转化为目标序列的数量。
通过合理设置PCR反应条件和分析荧光信号的曲线，可以实现对目标序列的快速、准确定量。
总的来说，实时荧光定量PCR的原理是基于PCR技术和荧光探针技术的结合，通过PCR反应、荧光探针和检测系统三个方面的协同作用，实现对目标序列数量的实时定量。
这种原理使实时荧光定量PCR成为一种高效、快速、准确的分子生物学技术，为科研和临床诊断提供了重要的技术支持。
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• 相对定量(Relative Quantification，RQ)
• 基因在不同组织中的表达差异 • 药物疗效考核 • 耐药性研究
• 等位基因分型(Allelic Discrimination，AD)
• 基因突变分析 • SNP研究 • 物种鉴定、菌株鉴定
total RNA total RNA
cDNA
cDNA
cDNA
cDNA
相对定量：内对照 Endogenous Control
用以标准化样品操作
time t =0 t=12 t=24 t=48
total RNA total RNA
total RNA total RNA
cDNA
cDNA
cDNA
cDNA
突变的存在形式
目标序列的有无
等位基因分型
• 定义：等位基因分型(AD)分析是一种多重（每个反应包括一个以上的 引物和探针对）、终点（在PCR过程的终点收集数据）分析实验，用 于检测某个核酸序列的变异。 每个反应中包括两个引物和探针对，允许在一个目标模板序列的单核 苷酸多态性（SNP）位点上出现两个可能的变异基因型。 目标序列的实际量不确定。
Mechanisms of Small RNA-Induced Gene Regulation
为何研究miRNA？
• miRNA已被确认为一类新的基因调控因子，参 与了细胞的发育、分化和联络 • 对miRNA功能的研究将有助于设计siRNA干扰 实验 • miRNA有可能成为新的生物分子标记 • 有重要的临床应用价值
等位基因自动识别软件
• • • • 加速数据分析 等位基因分组识别 每一个孔的质量评分 用户自定义的质量评分 标准 基于每一个标记的识别 限制用户的主观干扰
• •
阴性阳性鉴定
• 定义：阳性/阴性实验是一种终点分析，它可以确定某个样本中是（阳 性，用加号表示）否（阴性，用减号表示）存在一个特异性目标序列。 在终点分析中，数据是在PCR过程结束时获得的。 什么是IPC？IPC是一种阳性内对照，它被用在阳性/阴性实验中，用 于监测PCR过程并确定阴性结果不是因为PCR失败而造成。，IPC包 括一个模板、一组引物和一个荧光标记（VIC）的探针，被加到反应 板的每一个孔中。
基线 阈值 Ct值 [DNA]0
由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品 扩增结果存在很大的差异
同时扩增96的相同样品的结果
扩增曲线：四个阶段
线性图谱 对数图谱
平台期
线性增长期 指数增长期 基线期
平台期 线性增长期 指数增长期
基线期
基线
阈值
Ct值
[DNA]0
什么是基线？
基线就是扩增曲线中的水平部分。
1. 2. 3. 4. 5. 6. Transcription Hairpin release in the nucleus Export to cytoplasm Dicer processing Strand selection by RISC Translational repression
*mature active strand
荧光定量PCR化学原理
SYBR Green I作用机理
数量关系
1. 每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去 2. 染料一结合，就产生荧光信号 3. 信号强度与DNA分子总数目成正比
TaqMan探针的FRET
E
TaqMan® Probe
E
R Q
E
R
E
Q
TaqMan作用机理
数量关系
Workflow
mirVana™ miRNA Isolation Kit
TaqMan® MicroRNA RT kit TaqMan® MicroRNA Assays
TaqMan® Universal Master Mix,No UNG
Five Fully Integrated Systems for Real-Time PCR
•
阴性结果示例
阳性结果示例
microRNA
• MicroRNA(miRNA)是一种 22个碱基左右的内源性单链 小分子RNA • 由带茎环结构的双链RNA前 体剪切而成 • 具有高度保守性、时序性和 组织特异性 • 通过与特异mRNA结合，抑 制目标基因表达或降解 mRNA
miRNA Expression
• 阴性阳性鉴定(Plus/Minus with IPC，+/-)
实时 实时PCR PCR分析 分析
绝对定量 绝对定量 相对定量 相对定量
根据标准曲线 提供数量测量
提供精确的起始材料 相对数量差异
绝对定量与相对定量的定义
• 绝对定量分析用于确定未知样本中某个核酸序列的绝对量值，即通常 所说的拷贝数。 相对定量用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序 列表达的相对变化。校正样本可以是一个未经处理的对照或者是在一 个时程研究中处于零时的样本。
上游引物 TaqMan 探针
R
3’ 5’
Q
5’ 3’
下游引物
R Q
3’ 5’
5’ 3’
1. 每产生一条DNA链，就切断一条探针 2. 每切断一条探针，就产生一个单位信号 3. 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
Real-time PCR 应用
• 绝对定量(Absolute Quantification，AQ)
log X O log( RT − R B ) − log RS CT = − + log(1 + E X ) log(1 + E X )
即 CT = - k lg X0 + b
（线性方程）
标准曲线：CT值对[DNA]0作图
C T值
CT = - k lgX0 + b
lg [起始DNA]
成功的定量PCR
miRNA 分析的技术挑战
Northern Blot (杂交法) • Homegrown technology and easy to access (易于操作) • Large sample amount requirement (ug scale) (需大量样品) • Low dynamic range (two orders of magnitude) (可测范围低) • Mismatch hybridization often cannot distinguish well between miRNAs that only have small sequence differences (错配杂交问题)
Precursor miRNA Mature miRNA
Microarrays (芯片法) • High throughput (高产出) • Improved dynamic range (可测范围较宽) • Large sample RNA requirement, approximately 5 µg per array (需大量样 品) • Difficult or impossible to distinguish between the Pre-miRNA and miRNA (很难区分前体miRNA and 成熟miRNA) • Do not distinguish well between miRNAs that have only small differences in sequence. (对类似结构的miRNA分辨率差) Quantitative Real-Time PCR (实时定量PCR) • Dramatically less sample requirement (只需微量样品) • Significantly wide dynamic range (7 logs) (非常宽的可测范围) • High sensitivity and specificity (高灵敏度, 高特异性) • However, how to design a TaqMan real-time PCR assay on a ~22 base polynucleotide fragment? (但是, 如何设计这样一个靶物只有22个碱基 TaqMan real-time PCR?) Solution: TaqMan® MicroRNA PCR Assays
T=0 (calibrator) T=1hr T=6hr T=24hr
Relative Quantity of Expression
10 8 6 4 2 0
IL-2 24 24 23 28
18S ΔCt 9 15 10 14 11 12 10 18
8.0
ΔΔCt 0 -1 -3 3
2-ΔΔCt 1.0 2.0 8.0 0.1
Real-time PCR
Xiao Jin Applied Specialist Molecular & Cellular Biology
Real-time PCR 原理
数学原理 化学原理
Real-time PCR 应用
绝对定量 相对定量 等位基因分型 阴阳性判定 microRNA
荧光定量PCR数学原理
•
•
正常与突变探针在同一管里反应的点突变检测
基因分型检测
FAM VIC Homozygote for FAM-specific allele
VIC FAM Homozygote for VIC-specific allele
FAM VIC
Heterozygote for both alleles
•
绝对定量：从荧光到拷贝数
The well contains 400 target copies
Y= mx+b
Ct values