吸附柱色谱分离技术

2.上样 （1）样品能被流动相溶解 •将其中极性溶剂尽可能的用旋转蒸发仪去除后， 加入少许流动相稀释。 •待将吸附剂上面的多余洗脱剂放出，直到柱内液体 表面降至石英砂表面时，停止放出洗脱剂。 •将样品用滴管或漏斗沿柱子内壁直接加入柱中。 •样品稀释要尽可能用少的洗脱剂，然后用最少量洗 脱剂洗涤器皿与层析柱内壁，洗涤完毕，开放活塞， 使液体渐渐放出，液面降至石英砂下端时，再加入 流动相洗脱。
3.洗脱与收集 一般先用极性较小溶剂，然后逐渐加大极性。极性 溶剂的增加开始要缓慢，然后增加的幅度可逐渐增 大。在常压下，加入溶剂后，将柱抽干，收集为一 个流分。抽干后再更换溶剂和容器，重复以上操作， 并用TLC 跟踪每一个流分的分离情况。通常收集 20～25个流分可将所有成分洗脱。
减压柱色谱
利用柱后减压使洗脱 剂迅速通过固定相从 而很好的分离样品的 色谱技术。具有快速， 简易，高效，价廉等 优点。
1. 装柱 将吸附剂装入漏斗或短柱中，轻轻拍紧或减压拍打 或从顶端挤压，直至吸附剂紧密，最后变得坚硬。 吸附剂的高度一般不超过5cm。对于微量分离，样 品＜100mg,可采用直径为0.5～1cm 色谱柱或漏斗， 吸附剂高度为5cm，一般固定相用量为10～15：1 倍。 加大吸附剂与样品比例，可提高分离度。
1．吸附剂 •常用氧化铝或硅胶为吸附剂。 •一般干柱层析吸附剂粒度200～300目较好（硅 胶），干柱色谱样品与吸附剂比例1：300～1： 500。 2.装柱 •与一般柱层析一样。
3.上样与展开： •将混合物溶于展开剂中;或将样品溶 于溶剂中，加入5倍量的吸附剂，在 旋转蒸发仪上蒸干后。均匀地加载于 柱子上端，上面再覆盖少量石英砂。 加入展开剂，使柱的顶端保持有3－5 厘米厚的液面。展开时展到柱子底端 即可，然后去除色谱柱支撑物。
同常压柱色谱
快速柱色谱的条件与步骤： （1）选用对欲分离成分在TLC 板上有较好的分 离效能的洗脱剂，Rf 值＝0.35；△Rf>0.15。 （2）选择合适的层析柱，内装粒度230-400目的 硅胶，高度5-6inch。 （3）加入洗脱剂，在压力下快速将硅胶中空气 排除。 （4）上样后，加洗脱剂洗脱，控制(压力)流速 2.0in/min （约5cm/min）。
(1) 干法装柱 在柱子上端放一漏斗，直接加入硅胶。轻轻敲打 层析柱，或上下震动层析柱，使填装均匀，再加 一层石英砂，然后加入洗脱剂，使硅胶润湿。必 要时加压或减压以除去气泡，加速溶剂化速度。
(2) 湿法装柱 将吸附剂硅胶与一定量溶剂调 成悬浆状，快速倒入柱管中， 打开活塞，使溶剂慢慢流出， 吸附剂慢慢下降而均匀沉入色 谱柱底。吸附剂填料完毕,一般 再覆盖0.5cm厚的石英砂。
3.洗脱 （1）洗脱剂的选择应以TLC检测为依据。被分 离物质的最佳Rf值应在0.2-0.5内。被分离的2个 点之间△Rf值应尽可能的大，越大越好。 （2）洗脱剂应不断加入，保持一定高度。 （3）洗脱液收集洗脱液采用等份法收集。 （4）控制洗脱液流出速度。不能太快，一般以 1-2滴/秒为宜。
4.合并 洗脱液按编号TLC点 样展开，将Rf值相同 者合并，浓缩，最后 进一步纯化。
4检查与分离 •按色带或紫外下的色带用小 刀将柱子切开，将各段吸附 剂分别放在索氏提取器中， 溶剂提取。
快速柱色谱
快速柱色谱可克服普通柱分 离的缺陷，它具有快速省时、 分离效率高、简单易行的优 点。对于0.01-10g的样品，Rf 值>0.15的情况下，在10-15分 钟可快速得到分离。
1.装柱、上样
（2）样品不能被流动相溶解 •可选择极性大的溶剂溶解。如氯仿，丙酮，乙醇， 甲醇，四氢呋喃，吡啶，免用DMSO,DMF沸点较 高溶剂。 •再加入适量的硅胶于溶剂中（一份样品+ 约5份柱 填料），用旋转蒸发仪减压蒸去溶剂至干，让样 品均匀地涂布在固定相表面上，然后通过漏斗装 于柱子上端。旋转蒸发时，一定要加防爆球，以 防样品硅胶爆沸。
吸附柱色谱分离原理
•利用欲分离的混合物中各组分分配在固 定相和洗脱剂之间，被吸附的性质不同， 而相互得以分离。 •化合物被吸附作用越强，该化合物溶解 在洗脱剂中越少，沿洗脱剂移动的距离 则越小。反之，越多。
常压柱色谱
装柱
上样
洗脱
合并
1.装柱 •所用吸附固定相一般为硅胶，氧化铝，粒度要 求100-160目或160目以上。 •吸附剂粒度越小，分离度越大，但洗脱速度越 慢。 •Rf值相差较大时，应用硅胶100-160目，可上样 30mg/g硅胶，更多的情况下硅胶量为10mg/g硅 胶（即分离1g 样品需要100g 硅胶）。 •应用氧化铝时，粒度要求100－150目，分离1g 样品需要20－50g氧化铝。
吸附柱色谱分离技术
色谱分离技术在药物研究中 具有重要意义
柱色谱分离特点
• 柱色谱分离与薄层色谱类似，是靠洗脱剂把 分离的各组分逐个洗脱下来的过程，故也称 洗脱色谱。 • 由于色谱柱填充的吸附剂的量远远大于薄层 板，因而柱色谱可用于分离量比较大（克数 量级）的物质。所以作为较大量样品的制备 分离，柱色谱优于薄层色谱。
注意！
1.吸附剂表面应尽量平整， 并水平。 2.吸附剂充填时必须非常 均匀，不可出现空气泡、 隙缝等。 3.样品层应尽量薄。
干柱色谱
•是指用填充剂干装成柱，然后进行层析分离的一 种方法。实际上是制备薄层的一种改进。即由薄层 板改为柱状，采用塑料薄膜或玻璃柱。 •将吸附剂填充到塑料薄膜柱中，把欲分离混合物 置于柱子顶端，加展开剂展开，当展开剂到达柱底 部时即完成分离。用小刀沿着分离部位将柱子切开 或将吸附剂推出，从分段的吸附剂中用溶剂提取所 需的化合物。
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2.上样 放掉真空后，常压下加入低极性溶剂于吸附剂表面 上，减压使溶剂均匀流过吸附剂。如有空隙，需要 重装。使柱子抽干后，重复1～2 次，即可准备上 样。用低极性溶剂或洗脱剂（如石油醚、正己烷） 溶解样品。常压下小心加入柱顶端，再加入洗脱剂 或溶剂覆盖吸附剂表面，慢慢减压，使样品在柱顶 端形成样品层。可也采用固体上样法。即先将样品 溶于极性溶剂，加入5～10 份吸附剂，旋转蒸发至 干后，加到吸附剂的表面上，然后进行洗脱。