测序胶具体步骤和注意事项
二代基因测序流程和试剂
二代基因测序流程和试剂的步骤和流程引言二代基因测序是一种高通量、高效率的基因测序技术，能够大规模地获取DNA或RNA的序列信息。
本文将详细描述二代基因测序的流程和试剂的步骤和流程，确保流程清晰且实用。
流程概述二代基因测序的流程可以分为样品准备、DNA或RNA提取、文库构建、聚合酶链式反应（PCR）、测序和数据分析等步骤。
下面将详细介绍每个步骤的具体操作和试剂使用。
1. 样品准备样品准备是整个二代基因测序流程的关键步骤，合理的样品准备可以保证后续步骤的顺利进行。
样品可以是组织、细胞、血液等，需要根据研究目的进行选择。
样品准备的步骤包括：1.1 样品收集根据研究目的选择合适的样品，并采用合适的方法进行收集。
例如，对于组织样品，可以通过手术获取；对于细胞样品，可以通过培养或离心分离等方法获取。
1.2 样品保存采集后的样品需要及时保存，以防止样品质量的降低。
常用的保存方法包括冷冻保存和固定保存。
冷冻保存可以使用液氮保存或低温冰箱保存，固定保存可以使用甲醛等试剂进行固定。
2. DNA或RNA提取DNA或RNA提取是获取样品中的核酸的关键步骤，常用的提取方法包括酚-氯仿法、盐酸法和商用试剂盒法等。
下面以商用试剂盒法为例进行介绍：2.1 样品裂解将样品加入裂解缓冲液中，通过离心等方法使细胞或组织破碎，释放出DNA或RNA。
2.2 蛋白酶处理加入蛋白酶将样品中的蛋白质降解，以便后续纯化DNA或RNA。
2.3 DNA或RNA纯化将裂解液加入商用试剂盒中，通过离心等方法将DNA或RNA与其他杂质分离。
根据试剂盒的不同，可以使用硅胶膜或磁珠等材料进行纯化。
2.4 洗脱DNA或RNA将纯化后的DNA或RNA从硅胶膜或磁珠上洗脱下来，得到纯化后的DNA或RNA。
3. 文库构建文库构建是将提取到的DNA或RNA转化为测序所需的文库，常用的文库构建方法包括PCR文库构建法和片段文库构建法。
下面以PCR文库构建法为例进行介绍：3.1 DNA片段制备将提取到的DNA通过限制性内切酶或超声波等方法制备成适当的片段。
测序protocol
1、取基因组DNA做常规PCR 。
2、在PCR产物中加3ul的6×Loading buffer进行1%琼脂糖凝胶电泳，110v电压，15min。
在凝胶成像仪上摄像，切下目的条带，放入1.5mlEP管中，进行胶回收。
3、胶回收严格按照试剂盒的操作步骤执行。
（1）将300ul的Binding Buffer 加入有胶块的EP管中，55℃金属浴7min,期间颠倒几次，以确保胶块完全融化。
（2）将融化的胶块转移到做好标记的柱管中，11000rpm离心1min,将离掉的液体弃去。
（3）在柱管中加入700ul的SPW Buffer（使用前应加入80ml的无水乙醇），11000rpm离心1min,将离掉的液体弃去。
（4）重复3步骤一次。
（5）将弃去液体的柱管放入离心机中，11000rpm离心1min,以确保将残余在柱上的液体完全甩干。
（6）把柱子下面的管子弃去，重新放置剪去盖子的EP管，加入15ul的Elution Buffer到柱子的中央，11000rpm离心1min。
（7）重复以上操作一次。
（8）将两次洗脱的液体转移至干净的EP管中，做好标记，保存备用。
4、测序反应取回收的DNA产物作为模板，进行下一步的测序反应。
测序反应的PCR反应体系及条件如下：测序反应的PCR反应体系及条件：反应体系：5×Sequencing buffer 1.0 μLSequencing RR-100 0.5μL引物正向或反向0.5μL回收的扩增DNA产物 1.0μL无菌蒸馏水 2.0μL。
反应条件：96℃5min96℃15s57℃10s 共30个循环60℃4min4℃Forever5、把EDTA二钠（0.5mol/l,PH 8.0）和醋酸钠（3M,PH 5.2）等体积混匀，加入到扩增产物中，每管1 ul，然后每管加入无水乙醇25 ul，室温暗室放置15min,4100转离心30min。
把上清尽量吸干，每管加入70％乙醇40 ul，4100转离心10min，尽量吸干上清，室温暗室放置干燥10-20min，加入HD（甲酰胺）10 ul轻轻混匀，放置10-20min。
abi测序仪的测序原理和操作规程
ABI型DNA测序仪的测序原理和操作规程DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。
自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。
美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。
本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。
【原理】 ABI PRISM310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。
由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。
分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。
PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。
这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。
它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。
DNA测序技术的操作方法与注意事项
DNA测序技术的操作方法与注意事项DNA测序技术是现代生物学研究中最为重要的技术之一。
它通过读取DNA序列，揭示了生命的遗传密码，为疾病研究、基因工程、进化生物学等领域提供了强有力的工具。
然而，要想获得高质量的DNA测序结果，操作方法与注意事项是不可忽视的。
一、操作方法1. DNA提取：DNA提取是测序的第一步，要确保提取到足够纯净、高质量的DNA样品。
操作过程中需要注意以下几点：a. 样品的选择：样品可能是细菌、动植物组织、人类血液等不同类型。
不同类型的DNA提取方法有所不同，需要根据样品的特点选择适当的提取方法。
b. 样品的保存：为了避免DNA降解，样品在提取前应得到适当的保存。
冷冻保存是常用的方法。
c. 提取试剂的选择：市面上有多种DNA提取试剂盒可供选择，根据实验需要选择合适的试剂。
d. 操作规范：注意无菌操作，避免外源DNA污染。
同时，注意各个步骤的时间控制和温度控制，以保证提取过程的高效和准确。
2. PCR扩增：PCR扩增是测序前的重要步骤，通过反复复制目标DNA片段，进行扩增并提高检测的灵敏度。
在PCR扩增过程中需要注意以下几点：a. 引物的设计：PCR扩增需要引物与目标DNA序列互补，引物设计应合理，尽量避免非特异性扩增。
b. 影响PCR反应的参数：反应体系中的温度、时间、酶浓度等参数需要精确控制，不同的目标DNA可能需要不同的PCR条件。
c. 循环数的选择：循环数太少可能导致扩增产物过少，循环数太多可能引起非特异扩增，需要根据实际情况选择合适的循环数。
3. PCR产物纯化：PCR产物纯化是为了去除引物、引物二聚体等对测序反应的干扰物质。
在PCR产物纯化过程中需要注意以下几点：a. 使用PCR纯化试剂盒：市面上有多种PCR产物纯化试剂盒可供选择，根据实验需要选择合适的试剂盒。
b. 操作规范：注意洗涤缓冲液的使用和洗涤次数的控制，以确保纯化效果。
4. DNA测序反应：将纯化后的PCR产物进行测序反应前，需要注意以下几点：a. 反应体系的准备：反应体系中需要添加适量的测序引物、缓冲液和酶，同时确保反应体系的最终体积和比例准确。
质粒测序操作流程_简化
质粒测序实验操作流程一、实验试剂和耗材准备：（一）实验试剂：标准质粒，测序引物，Bigdye v3.1, ddH2O，POP7胶，Sequence Standard（3130），10 x Buffer，HiDi（二）实验耗材：96孔板，0.2EP管，移液枪，Centri-SEP纯化柱，计时器，记号笔二、实验操作具体步骤：（一）质粒测序反应体系（标准）：质粒（0.2ug/ul） 1 ul引物(0.8→3.2 pmol/ul) 4 ulBigDye(2.5x) 8 ulddH2O 7 ul总体积20 ul测序PCR循环条件:96 ℃1 min →(96 ℃10 sec →50 ℃5 sec →60 ℃4 min) x 25循环→4℃保温（二）测序产物纯化（Centri-SEP柱纯化）：1．水化离心柱（已提前制备好）2．去除间质液体2.1 打开离心柱的顶盖，然后去掉底部尾塞。
2.3 让离心柱中过量的液体在洗脱管（2ml EP管）中控干，弃去液体。
2.4 将离心柱和洗脱管一起离心（转速750g，2mins）去除间质中的液体。
2.5 大约能去除300ul液体。
如果离心柱底部有液滴，用纸吸干，弃去洗脱管和间质液体。
不要使凝胶过分干燥，即刻开始样品处理。
3．样品处理3.1 将离心柱置于光线充足地方。
将20ul测序产物混合液直接转移至凝胶顶端的正上方中心位置，注意不能碰到凝胶。
3.2 将离心柱放入样品收集管（1.5ml EP管），并置于离心机转子中。
保持原先的离心柱方向，将离心柱和样品收集管同时离心（转速750g，2mins）。
纯化的样品将被收集在样品收集管底部，弃去离心柱3.3 真空离心使样品干燥，不要使用加热法。
（三）测序标准品准备1．取一管低压冻干的Sequencing Standard，加入170ul Hi-Di重悬，混匀离心2. 取10ul至96孔板中（四）样品变性5ul纯化样品+ 5ul HiDi，混匀，至96孔板中，95℃2min变性，迅速放置于冰上，准备上机。
sanger测序实验步骤
sanger测序实验步骤
Sanger测序是一种经典的DNA测序技术，它是由Frederick Sanger在20世纪70年代初开发的。
Sanger测序实验通常包括以下步骤：
1. DNA提取，首先，需要从感兴趣的DNA样品（可以是基因、PCR产物等）中提取DNA。
这可以通过多种提取方法来实现，例如酚/氯仿提取法或商用DNA提取试剂盒。
2. PCR扩增，如果起始DNA量不足，需要进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。
PCR可以放大DNA片段，使其在测序实验中更容易被检测到。
3. 准备反应混合物，将PCR产物与引物、DNA聚合酶、缓冲液和dNTPs等混合物组合在一起。
引物是用于引导DNA合成的短片段DNA。
4. DNA序列反应，在反应混合物中加入一种特殊的二进制缺失核苷酸，当DNA合成酶在合成DNA链时，会随机地将这种缺失核苷酸插入到不同长度的DNA链中。
5. 凝胶电泳，将反应产物加载到聚丙烯酰胺凝胶中，然后通过电泳分离DNA片段。
由于缺失核苷酸的存在，不同长度的DNA片段将在凝胶中产生不同长度的片段。
6. 图像分析，将凝胶放入测序仪中，测序仪会通过激光扫描来检测DNA片段的长度和荧光信号。
7. 数据解读，最后，通过测序仪生成的数据来确定DNA片段的序列。
这一步通常需要使用特定的软件来分析和解读测序数据。
以上就是Sanger测序实验的基本步骤。
这种技术在基因组学研究和临床诊断中仍然被广泛应用。
一、测序样品要求
一、测序样品要求：质粒：1. 已纯化质粒大于20ul，溶于超纯水浓度大于100ng/ul；2．大质粒必须注明载体长度;3．质粒拷贝数低的样品，请提供质粒。
菌液：1. 请提供１ml以上过夜培养新鲜无污染菌液，用Ependorf管装，并注意封口，以免污染．保存时间较长的甘油菌，请重新摇菌后送样． 2．培养基和抗生素：本公司提供LB培养基和胺卞青霉素、卡那青霉素、氯霉素三种抗生素。
若您的菌株培养时有其他要求，请你提供4～5ml培养好的新鲜菌液或沉淀下来的菌体。
3．请提供质粒的名称、抗性、插入片段的长度，指定确切的通用引物。
PCR产物：1. 样品检测标准：上样3～5ul，琼脂糖电泳鉴定，为清晰可见的单一亮带。
2．不接受样品小于150bp、电泳检测有弥散的，多带的样品，非单一条带样品，建议克隆后测序。
3．未纯化的PCR产物样品，体积大于50ul，浓度大于50ng/ul；已纯化PCR产物体积为20ul，浓度大于50ng/ul，可取2ul样品电泳检测条带清晰PCR产物明亮，长片段需加浓度。
不管测序是否成功，本公司都将收取纯化费用。
4．若您自己纯化，请一定要进行Agarose凝胶电泳方式纯化回收，溶解在超纯水中（勿用TE溶解），浓度＞30 ng/ul ，同时提供PCR引物。
5．长度超过1kb，需要2个以上的测序反应才能测通的PCR样品，建议克隆后测序，否则单覆盖难以得到包括PCR引物序列在内的完整序列号。
6．引物请提供20ul，浓度大于3μM。
二、免费提供通用引物列表：T7；SP6；M13F；M13R；M13F（-47）；M13R（-48）；M13（-96）；T7TER；T3；S.TAG；A-FACTOR；PBV220F；PBV220FR；5’AOX；3’AOX；PGEX-5’；PGEX-3；PEGFP-C-5’；PEGFP-C-3’；PEGFP-N-5’；PEGFP-N-3’；PCDNA3.1F；PCDNA3.1R三、注意事项:1．客户样品编号请用数字、英文字母（大写）或下划线，不超过5个字符；E-Mail要用大写字母填写，并要求字迹规范、工整、清楚。
焦磷酸测序操作流程
焦磷酸测序操作流程一、准备工作。
焦磷酸测序听起来就很厉害的样子呢，但其实只要我们做好准备工作，就没有那么难啦。
我们得先把实验室的环境准备好哦。
要确保实验室干净整洁，各种仪器摆放整齐，这样我们在操作的时候心情也会好很多呢。
然后就是仪器的检查啦。
就像我们出门前要检查钥匙有没有带一样，要看看测序仪是不是能正常工作。
检查它的电源连接是否稳固，各个部件有没有松动或者损坏的迹象。
要是仪器出问题了，那可就像做饭的时候炉灶坏了一样，啥都干不成啦。
试剂也是很重要的一部分哦。
焦磷酸测序需要用到很多种试剂呢，我们要把它们都找齐。
这些试剂就像做菜的调料一样，少了哪一种都不行。
要检查试剂的保质期，要是用了过期的试剂，那结果可就没准儿啦。
就像过期的牛奶喝了会拉肚子一样，过期的试剂肯定会让测序结果出岔子的。
二、样本准备。
样本可是我们测序的主角呢。
我们要小心翼翼地对待它们。
首先要采集到合适的样本，这个过程就像寻宝一样，要找对地方，用对方法。
如果是生物样本的话，要确保采集的样本具有代表性。
比如说从组织中采集样本，可不能只采到病变边缘或者完全正常的地方，得采到能反映真实情况的部分。
采集好样本之后，就要对样本进行处理啦。
这个处理过程就像是给样本做个“美容”，让它能更好地适应测序的过程。
可能需要提取DNA或者RNA之类的，这个过程要按照标准的操作规程来做。
要是手法太粗糙，就像给头发做造型的时候用力过猛，把头发扯断了一样，样本也可能被破坏掉呢。
处理好的样本要进行定量和质检。
这一步就像是给样本量身高称体重一样，看看它符不符合测序的要求。
如果样本的量太少或者质量不好，就像一个身体虚弱的运动员参加比赛，很难有好的表现的，测序结果可能就不准确啦。
三、测序反应。
把混合好的东西放到测序仪里面，就像把宝贝放进保险箱一样。
然后启动测序仪，这个时候就只能耐心等待啦。
测序仪在工作的时候，就像一个勤劳的小蜜蜂，在那里忙忙碌碌地进行着各种复杂的操作。
我们可不能去打扰它哦，不然它可能就会出错啦。
DNA测序操作步骤
DNA测序操作步骤1.提取DNA：首先需要从待测物质中提取出DNA样本。
这可以通过不同的方法实现，如细胞裂解、蛋白酶处理和有机溶剂提取等。
2.PCR扩增：为了提高测序的准确性和效率，需要对待测的DNA片段进行扩增。
常用的方法是聚合酶链式反应（PCR），通过引入引物来扩增所需的DNA片段。
3.准备测序反应混合物：将扩增后的DNA片段与测序引物、缓冲液和酶等混合，以便进行后续的测序实验。
4. DNA测序反应：反应混合物通常通过循环测序法（Sanger测序）进行DNA测序。
在反应中，DNA聚合酶会合成新的DNA链，同时也会加入一种特殊的标记物（即分子君主）。
5.凝胶电泳：完成反应后，需要将产生的DNA片段进行分离和检测。
通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过将DNA片段置于电场中，根据其大小来进行分离。
6.凝胶图像分析：凝胶电泳后，可以通过紫外线照射，观察DNA片段的迁移距离并获取图片。
图片可以通过图像分析软件进行数据提取和分析。
7.数据解读和序列装配：通过分析凝胶图像，可以确定DNA序列。
此外，根据不同的测序方法和技术，可以使用计算机软件将序列数据进行装配，以获得完整的DNA序列。
8.数据质量控制：对测序数据进行质量控制是非常重要的。
此步骤包括检查序列的准确性、测序深度和覆盖度等参数，以确保结果的可靠性。
9.结果分析和应用：最后，通过对测序结果的分析和解读，可以获得关于DNA序列的信息，并将其应用于基因功能研究、疾病诊断和个体鉴定等领域。
需要指出的是，随着技术的发展，DNA测序方法已经多种多样。
除了传统的Sanger测序外，第二代测序技术（如Illumina、Roche 454、Ion Torrent等）和第三代测序技术（如PacBio、Nanopore等）也被广泛应用于DNA测序领域。
虽然具体的操作步骤可能会有所不同，但总体上仍然可以参考以上的大致操作流程。
PCR类型测序模板注意事项
PCR类型测序模板注意事项总反应体积建议为50uL或100uL，扩增结束后取3ul用1%左右的琼脂糖电泳检测，应为单一的条带。
3ul样品总量不低于50ng(非常小的PCR产物可以酌情减小)，PCR 产物产量过低说明PCR扩增结果不是很理想，应改进条件重新扩增。
对于有杂带和扩增弥散的PCR产物，需经琼脂糖电泳将目的片段切下来并回收，建议将PCR产物作克隆后进行测序。
有杂带的和扩增弥散的PCR产物即使通过琼脂糖电泳纯化，测序仍有可能出现双峰等异常结果。
经上述检测合格的PCR产物，需经过琼脂糖电泳纯化去除未反应的引物，dNTP，引物二聚体等影响测序反应的组分。
有多种纯化方法可供选择，Promega，Qiagen和生工等公司都有相应的产品可供选择。
纯化后的PCR产物经电泳检测估计总量应不低于200ng/Kb(非常小的PCR产物可以酌情减小)。
与质粒模板相比，PCR产物彼此间差异很大，因此，每个PCR模板应尽可能提供相应的PCR退火温度和PCR产物的长度，以供测序时参考。
PCR模板一般不应短于200bp，过短的PCR产物应经克隆后进行测序。
纯化好的PCR产物应溶于双蒸水中，TE缓冲液会严重影响测序反应。
若让公司对PCR产物进行纯化，PCR产物需满足∶总量不低于1ug/kb，片段长度不低于200bp各种PCR测序模板均应提供相应的测序引物，并尽可能提供引物的全序列，并将引物浓度准确稀释到5pmole/ul 。
引物浓度的换算关系∶总ng数 = pmole x 分子量/1000由于PCR产物测序相对较难，为使您能拿到一个好的结果，请尽量满足上述要求。
测序常见问题分析序列中出现N值的常见原因：通常有以下几种情况将造成测序结果中N值较多：∙PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N 值。
通常我们很容易辨别PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿色峰），这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们用T载体克隆PCR产物就是根据该原理的。
Q24焦磷酸测序操作流程
Q24焦磷酸测序操作流程1、开机前检查：(1) 检查过滤探针：确保过滤探针不发生堵塞，否则更换。
(2) 检查废液桶：必要时清除废液。
(3) 检查卡夹（Cartridge）：确保Cartridge已经在上次使用过后检查过未发生堵塞，并且已经晾干，否则更换。
(4) 检查真空系统：确保真空系统的压力正常。
2、开机程序：打开机器电源→等待约1分钟进入主界面→插入带有程序的U盘3、标本检测程序将PCR产物加入到预先准备好的2ul Beads及40ul Binding Buffer混合液中→放置在平板振荡仪上1400rpm混合5-10分钟→准备测序引物与Annealing Buffer混合液25ul →根据实验设计分配到对应的24孔板孔位上→准备work station上的各种缓冲液→将PCR 产物混合液转移到work station上→在work station上进行DNA链的分离→将24孔板放置在80度上温浴2min后在室温放置5分钟→根据pre run information加入相应体积的酶、底物和dNTP至试剂仓（Cartridge）中→将试剂仓放进Q24设备中→将24孔板放进Q24设备中→从屏幕上选择需要运行的程度→再次确认后设备开始运行→结束后数据自动保存在U盘上→将U盘上数据拷贝回电脑上进行分析4、关机程序4.1 关闭真空工作站打开真空开关，将真空抽滤工具放置在高纯水中清洗约10秒→将真空抽滤工具以垂直90度竖值约10秒→关闭真空抽滤工具的开关→放置在Park位置上→关闭真空泵电源→清洗work station上的各缓冲液槽后晾干4.2 关闭PyroMark Q24选择屏幕上的Shutdown选项→确认后等待屏幕上显示“It is now safe to turn off the instrument”→关闭仪器电源→丢弃测序24孔板，取出仪器内的试剂仓→用高纯水清洗试剂仓，确认无堵塞后室温晾干或37度烘干。
基因测序操作流程(PCR扩增)
基因测序操作流程(PCR扩增)简介基因测序是一种用于鉴定和分析基因序列的方法。
其中，PCR （聚合酶链反应）扩增是常用的基因测序方法之一。
本文档将介绍PCR扩增的操作流程。
操作流程以下是PCR扩增的基本操作流程：1. 实验准备- 准备所需的PCR试剂盒，包括聚合酶、引物、模板DNA和缓冲液。
- 检查PCR仪和其他实验设备是否正常工作。
- 准备工作台和操作区域，确保干净和无菌。
2. 准备PCR反应体系- 在一个无菌管中组装PCR反应混合液，包括聚合酶、引物、模板DNA和缓冲液。
根据实验需要，调整各组分的浓度和体积。
- 使用无菌滴管将PCR反应混合液分配到PCR管或微孔板中。
3. 执行PCR反应- 将PCR管或微孔板放置在PCR仪中，根据实验要求设置温度和时间参数。
- 启动PCR仪，让反应体系在所需的温度下进行扩增。
- 在PCR反应过程中，监控PCR仪显示的温度曲线和时间。
4. PCR产物分析- 扩增结束后，取出PCR管或微孔板。
- 可使用凝胶电泳等方法分析PCR扩增产物。
- 将PCR产物送入测序机进行基因测序。
5. 结果分析- 根据基因测序结果进行数据分析和序列比对。
- 利用基因测序结果进行后续的研究和实验设计。
注意事项- 所有实验过程中，应遵守无菌操作规范，以避免污染和干扰实验结果。
- 在PCR反应设置中，注意选择合适的温度和时间参数，以确保扩增效果和产物质量。
- 在PCR产物分析和基因测序阶段，保证实验设备和仪器的准确性和灵敏度。
以上是基因测序操作流程的简要介绍，供参考和实践。
具体实验细节和参数设定需根据具体实验要求和实验室标准进行调整。
DNA测序技术的使用注意事项
DNA测序技术的使用注意事项DNA测序技术是一项非常重要且广泛应用的分子生物学工具。
它已经在许多领域中发挥了关键作用，比如基因组学、医学诊断、生命科学研究等。
然而，由于该技术的特殊性和高度复杂性，使用者在进行DNA测序时必须遵守一些注意事项，以确保结果的准确性和可靠性。
本文将介绍几个关键的使用注意事项，帮助使用者提高DNA测序实验的质量。
首先，样本处理是DNA测序的重要步骤之一，需注意避免外源性DNA污染。
人为的DNA污染可能来源于操作者的皮肤细胞、空气中的DNA颗粒、实验器皿、实验室设备等。
为了降低污染的风险，使用者应戴上手套、面具和实验室外套，并严格遵循无菌实验室操作规范。
此外，实验器皿和设备应经过严格的清洁和消毒，并注意分析每个实验室操作的DNA量。
第二，正确的DNA样本准备也是关键。
使用者应该注意选择适当的方法来提取DNA，并在保证质量的情况下得到足够的DNA量。
一般而言，选择DNA提取方法时需考虑样本类型、目的和预算。
值得一提的是，使用者在准备DNA样本时应避免DNA的降解。
DNA的降解可能会导致测序结果的不准确。
为此，应该遵循正确的样本保存和处理方法，比如低温保存、避免反复冻融等。
第三，合理的文库准备很关键。
文库准备是指将DNA样本片段连接到载体上，以便后续进行DNA测序。
在进行文库准备时，使用者需注意片段大小的选择、连接效率的优化以及删除低质量的片段。
合理的片段大小选择可以显著提高文库质量，以最大限度地提高测序效果。
此外，优化连接效率可以减少文库制备的重复次数，提高测序效率和准确性。
在删除低质量的片段时，可以使用适当的净化和筛选方法，如琼脂糖凝胶电泳、序列相关的质量控制等。
第四，选择适当的测序平台也是非常重要的。
目前市场上有各种不同的测序平台可供选择，比如Sanger测序、Illumina测序、Ion Torrent测序等。
使用者应根据实验的目的、质量需求和预算来选择合适的测序平台。
ABI测序仪的测序原理和操作规程
ABI型DNA测序仪的测序原理和操作规程DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。
自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。
美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。
本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。
【原理】 ABI PRISM310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。
由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。
分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。
PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。
这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。
它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。
使用DNA测序技术解析基因组结构的步骤与注意事项
使用DNA测序技术解析基因组结构的步骤与注意事项DNA测序技术是一项重要的科学技术，它可以帮助我们解析基因组结构，从而深入了解生物的遗传特征和进化历程。
然而，在进行DNA测序之前，我们需要了解一些步骤和注意事项。
首先，进行DNA测序之前，我们需要提取DNA样本。
DNA可以从各种生物体的细胞中提取出来，包括人类、动物、植物等。
提取DNA的方法有很多种，常用的方法是使用盐酸和酶来破坏细胞壁，并使用酒精沉淀法将DNA从其他细胞成分中分离出来。
提取的DNA样本应该具有足够的纯度和浓度，以确保后续的测序结果准确可靠。
接下来，我们需要对DNA样本进行文库构建。
文库是指将DNA样本分解成小片段，并将其连接到载体上，以便在测序过程中进行扩增和读取。
文库构建的关键是选择合适的酶和适当的连接方法。
此外，为了提高文库构建的效率和准确性，我们还需要进行质控，确保文库中的DNA片段长度均匀分布，并且没有杂质。
文库构建完成后，就可以进行DNA测序了。
DNA测序技术有很多种，包括传统的Sanger测序和近年来发展起来的高通量测序技术。
无论是哪种测序技术，其基本原理都是通过逐个测定DNA序列中的碱基来确定基因组的结构。
在测序过程中，我们需要使用特定的引物和酶来进行DNA的扩增和读取，然后使用计算机软件将读取的数据转化为DNA序列。
然而，在进行DNA测序时，我们需要注意一些问题。
首先，DNA测序是一项复杂的技术，需要高度的实验技巧和仪器设备的支持。
因此，我们需要在实验室中进行测序，并确保实验环境的洁净和稳定。
其次，由于DNA测序是一项昂贵的技术，我们需要合理规划实验的样本数量和测序的深度，以最大限度地利用资源并确保测序结果的可靠性。
此外，我们还需要对测序结果进行质控和分析，以排除测序错误和杂质的影响，并确保测序结果的准确性。
除了上述步骤和注意事项，还有一些新兴的DNA测序技术值得关注。
例如，单分子测序技术可以直接读取单个DNA分子的序列，避免了文库构建的过程，提高了测序的效率和准确性。
Sanger测序的基本原理、过程及注意事项
Reaction DNA
引物 (3.2 pmol/μL) BigDye (2.5x) Seq Buffer (5x) 去离子水 总体积
1/8x 1uL 1uL 0.5uL 1.75uL 5.75uL 10uL
1/16x 1uL 1uL 0.25uL 1.875uL 5.875uL 10uL
BigDye的终浓度：(2.5x ×0.25 μL + 5x ×1.875 μL ) / 10 μL = 1x
• 每管加入1 μL 125 mM EDTA(pH=8)，1 μL 3 M NaAc(pH=5.2)，加到管底； • 加入35 μL 100% 酒精，封严，震荡4次，室温放置15 min； • 3700rpm 4 °C离心30 min，马上倒置96孔板， 离心至850rpm停止离心； • 加入50 μL 的-20°C预冷70% 酒精，3700rpm 4 °C离心15 min，马上倒置96
劈峰(Split Peaks)和pull up峰(peaks under peaks)出现。
310型DNA测序仪的测序原理和操作规程
310型DNA测序仪的测序原理和操作规程ABI 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。
自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。
美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。
本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。
【原理】 ABI PRISM310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。
由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。
分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。
PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。
这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。
它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。
测序样品处理步骤
1.破菌模板先用27F和1492R扩增，后电泳检测。
2.若电泳检测结果为一条清晰明亮的带，则切胶回收/过柱/用乙醇和醋酸钠沉
淀。
3.回收的DNA模板用BigDye试剂盒扩增，反应体系为：
模板DNA 10-40ng
引物P300 3.2pmol
2.5×Ready Reaction Premix 4 ul
5×BigDye Sequencing Buffer 5 ul
灭菌纯水补足至20 ul。
4.PCR反应程序：
96℃ 1min→→(96℃ 10s→50℃ 5s→60℃ 4min)25个循环→4℃保温。
5.样品从PCR仪上取下，混匀。
6.每管加入5ul 125mM的EDTA,确保加到管底。
7.加入60ul的无水乙醇,确保加到管底。
8.用铝箔包裹遮光，并上下颠倒三四次混匀。
9.室温放置15分钟。
10.4℃下，1400-1500g离心45分钟（2000-3000g离心30分钟）。
11.颠倒并185g离心（这步要紧接着第六步立即进行）。
12.加入60ul 70%乙醇。
13.4℃离心，1650g15分钟。
14.迅速转至185g离心1分钟，取下。
15.若继续测样，则用injection buffer重悬样品。
若暂时不用，则包上铝箔，4℃储存。
注意：管必须干燥，注意遮光。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
测序凝胶板的制备
1. 玻璃板的处理：
银染测序的玻璃板一定要非常清洁，一般先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。
玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高(棕色)。
长玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。
这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。
(1) 长玻璃板的处理
A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鲜的粘合溶液。
B. 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板, 整个板面都必须擦拭。
(用镜头纸蘸取亲和硅烷bind-silane 溶液少许（1ml左右），涂在长玻璃板上。
要将整块板都涂满、涂匀。
)
C. 4-5分钟后, 用95%乙醇单向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。
重复三次这一清洗过程, 每次均须换用干净的纸, 除去多余的粘合溶液。
冬天可能要放的时间更久一些，或者用电吹风吹一下。
[注意]
1. 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷, 使凝胶不能很好地粘附。
2. 准备短玻璃板之前要更换手套，防止粘染粘合硅烷。
3. 防止粘合溶液沾染在短玻璃板上是很重要的, 否则将导致凝胶撕裂。
(2) 短玻璃板的处理
A. 用适量（1.5ml左右）的浸透Sigmacote溶液（剥离硅烷溶液）的棉纸擦拭清洗过的短玻璃板。
要将整块板都涂满、涂匀。
B. 5-10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。
[注意]
1.用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。
玻璃板须用去
污剂完全清洗。
或者凝胶用10% NaOH浸泡后除去。
为防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开, 如果出现交叉污染, 以后制备的凝胶可能撕裂或变得松驰。
2.亲和硅烷不可用于硅化玻璃容器。
3.天气气温低时，剥离硅烷有时会析出，涂板时会造成粘胶现象，因此当
室内温度低于20度时，要首先将剥离硅烷预热到30-40度，玻璃用吹风机吹热才开始涂板。
4.因为跑一次电泳比较费时费力，而亲和硅烷和玻璃硅烷使用条带与温度
和个人的使用手法有关，因而在初次使用时，可以先涂完制胶后，直接分离测试一下，看结果是否理想。
以免浪费时间和样本。
特别是亲和硅烷，在没有完全凉干时就制胶，很溶液造成胶贴到另一边，分开时将胶弄破。
凝胶的制备：
(1) 玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后，即可固定玻璃板。
该方法是用0.2mm或0.4mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。
在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。
(2) 根据所需要的凝胶浓度，一般6%-8%的胶浓度可获得较好的结果。
配制过程中，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis(丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合溶液)和10×TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2ml，并用0.45mm的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。
溶解尿素时不必加热。
如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。
一般在胶灌制后4-6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。
(3)胶配制好后，即可灌制胶板。
一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。
[注意]
1．使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。
2. 灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。
电泳：
1.预电泳
（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。
（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。
（3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。
（4）按30V/cm的电压预电泳20-30分钟。
预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。
高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。
[注意]
（1）用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。
（2）应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。
2.样品的制备：
当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1-3分钟，立即置于冰上即可。
如果样品长时间不用，则应重新处理。
可使用4-6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.4mm。
厚度小于0.4mm的胶可能导致信号太弱。
加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。
3.上样及电泳
关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。
上样顺序一般为G、A、T、C。
加样完毕后，立即电泳。
开始可用30V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40-60V/cm，并保持恒压状态。
一般来说，一个55cm长，0.2mm厚的凝胶板，在2500V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28mA降至25mA。
为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。
[注意]
1. 上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。
2. 一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。
电泳中可进行恒功率电泳。
测序凝胶的银染(个人认为，这步骤可以参考关于时间的建议，而关于溶液和详细步骤不用照搬。
因为我需要的精确程度不是测序级)
染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。
因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。
在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。
2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。
保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。
3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。
从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。
4. 凝胶染色(硝酸银溶液)：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。
5. 凝胶显影：
(1)在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液
的配制。
(2)从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。
注意，
把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。
浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。
若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。
(3)立刻将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板
带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟,或直至所有条带出现。
6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。
停止显影反应,固定凝胶。
7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。
在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。
[注意]
测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响。
1. 水的质量对于染色的成功极其重要。
超纯水(NANO pure R 或Milli-QR 的水)或双蒸水可获得较好的效果, 如果水中有杂质, 则低分子量条带可能无法出现。
2. 碳酸钠也非常重要。
使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher 和Kodak ACS试剂级碳酸钠(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可获得较好的结果。
3. 染色后的洗涤步骤是非常关键的。
如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA, 产生很少或没有序列信号。
如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。
4. 如果凝胶厚度超过0.4mm或丙烯酰胺浓度高于4-6%，则有必要延长固定和染色的时间。
如果凝胶比0.4mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒。
5. 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。
显影溶液必须预冷至10-12℃以减小背景杂色。
注意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。
用新配的染色及显影溶液。
不要重复使用任何溶液。