蛋白质相互作用
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抗体筛库：cDNA表达库，抗体结合表达的蛋白质，从 而得到基因。已经被质谱和PCR所淘汰
Western blot
1、电转移效率 2、PVDF膜的充分浸润 3、转移液中有太多的SDS 4、膜的损坏 5、转移时胶和膜没有完全接触 6、抗体的问题 7、抗体的浓度太高或太低 8、还原性物质的存在 9、封闭不充分
Acceptor signal is increased at the acceptor emission maximum (510 nanometers)
Wavelength of the Fluorescent Proteins
Color defining GFP mutation (source) Excitation (max)
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
Excitation frequency
Emission frequency
Donor
(2-10nm)
Acceptor
Emission frequency = Excitation frequency
Donor is excited at the maximum absorbance wavelength (380 nanometers) of the donor
蛋白质相互作用： 1. 本身具有生物学意义：这样的相互作 用在生物体中是起什么作用的 2. 发展技术：利用这样的相互作用创造 出一些人为的作用
研究蛋白质相互作用的目的是发现并明确其相 互作用的生物学意义
蛋白质相互作用是一种表象，通过表象分析规 律，是研究蛋白质相互作用的核心 “种瓜得瓜，种豆得豆”是一种表象，反映了 遗传这样一种本质 现象 可研究对象 合适的研究方法
基因库
lacZ
基因库
B-Pr
AD
确定蛋白质间相互作用的功能基团
Protein A 1 2 3 4
1
2
3
3
白
B-Pr
兰
白
白
鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用
A-Pr B-Pr
兰：相互作用 白：不相互作用
Two-Hybrid的优点： •是酵母细胞内的in vivo相互作用。
•只需要cDNA，简单。
4
5
蛋白质-蛋白质直接相互作用
•Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合） •Affinity interaction（亲和作用） •Yeast two-hybrid and phage display（酵母双 杂交和噬菌体展示） •Surface Plasmon Resonance •FRET •Proteomic analysis（蛋白质组学技术）
蛋白质-蛋白质直接相互作用
Protein interaction Affinity: A+B=AB
Kd=[A][B]/[AB], Kd: dissociation constant
Interaction Streptavidin-biotin binding Antibody-antigen interaction (good) Antibody-antigen interaction (weak) Enzyme-substrate Kd 10-14M 10-8-10-10M 10-6M 10-6-10-10M
•弱的相互作用也能检测到。
Two-Hybrid的缺点： •都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用。 •酵母的翻译后修饰不尽相同。尤其是蛋白质 的调控性修饰。 •自身激活报告基因。 •都基因库的要求比较高，单向1/3是in frame •蛋白质毒性。 •第三者Z插足介导的相互作用。 •假阳性。
UAS
蛋白质-蛋白质直接相互作用
•Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合） •Affinity interaction（亲和作用） •Yeast two-hybrid and phage display（酵母双 杂交和噬菌体展示） •Surface Plasmon Resonance •FRET •Proteomic analysis（蛋白质组学技术）
蛋白质-蛋白质直接相互作用
•Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合） •Affinity interaction（亲和作用） •Yeast two-hybrid and phage display（酵母双 杂交和噬菌体展示） •Surface Plasmon Resonance •FRET •Proteomic analysis（蛋白质组学技术）
Yeast two-hybrid （酵母双杂交）
• 发现新的相互作用蛋白质
• 鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用 • 确定蛋白质间相互作用的功能基团
DB
UAS
AD
lacZ
DB
UAS
AD
lacZ
DB
UAS lacZ
发现新的相互作用蛋白质
AD DB
UAS
B-Pr
lacZ
B-Pr
基因库
Y
DB UAS
Surface Plasmon Resonance
SPR is used to monitor interactions occurring in a biospecific surface on a metal layer by measuring changes in the solute concentration at this surface as a result of the interactions.
GST pull down
GST Fusion Protein Purification
binding
wash
elution
GST pull down
GST fusion protein 不够纯， 用作bait会产生太多的非特 异性蛋白质污染。
GST pull down
GST Pulldown
• 从物学功能到蛋白质相互作用。通过改变生 物学现象，分析蛋白质间的遗传相互作用， 进一步研究相关蛋白质的相互作用。
容易犯的错误：找到了平行变化的不相关蛋白 质。
发现蛋白质相互作用
蛋白质-蛋白质直接相互作用 遗传功能分析 序列与结构比较模拟
验证蛋白质相互作用 不同方法的交叉验证 不同生物体系中验证
SPR 优点：无标记、实时
Label-free detection SRP does not require any labels or reporter groups to detect biomolecular interactions. It follows every step in a multistep analysis procedure, in contrast to label-based methods that often only report the final step. Real time measurement The progress of interactions is displayed directly, as a plot of response (which is directly related to concentration changes at the surface) against time. Immediate feedback on the status of an interaction speeds up assay development and analysis. The results can be processed further after the run, for example to extract kinetic constants for the interaction.
ຫໍສະໝຸດ Baidu
研究蛋白质相互作用需要微观和宏观的结合
象与象的一部分
定量分析是研究蛋白质相互作用的基础
Input：10~20mg total proteins IP sample： Immunoprecipitated from 1000mg of total proteins
定量分析是研究蛋白质相互作用的基础
Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）
Western blot：变性抗原，主要用于检测蛋白质的存 在与否。
免疫共沉淀：非变性抗原，用于鉴定不同蛋白质间的 相互作用。 免疫共沉淀：Ab－Pr1－Pr2 非特异性结合：Pr1－Ab－Pr2
稳定的相互作用与瞬间的相互作用共同构成蛋 白质相互作用的内涵。
研究蛋白质相互作用是为了研究相应的 生物学功能
确定研究目标
寻找相互作用
建立相互作用网络 和功能体系
• 从蛋白质相互作用到生物学功能。运用蛋白 质直接相互作用，发现相互作用蛋白质，再 分析这些作用的生物学意义。
容易犯的错误：研究一大堆的蛋白相互作用， 却不知道这些相互作用有什么生物学意义。
lacZ
Auto activation
DB
X
AD
UAS
lacZ
Y
Phage display（噬菌体展示）
Phage display（噬菌体展示） Phage display的最大优点是数量大 细胞：108~109 细菌：1010 Phage：1012
寻找受体的配体
7肽：8x1016
蛋白质-蛋白质直接相互作用
Relative exposure level
研究蛋白质相互作用的意义 1、蛋白质间的相互作用是细胞生命活动 的基础。
2、基因只是决定蛋白质，而蛋白质才是 发挥作用的主体。蛋白质的相互作用是 发挥其功能的主要活动。
生物学效应
稳定相互作用 形成蛋白质复合体
瞬时相互作用
（enzyme-substrate） （protein complex）
Affinity interaction（亲和作用）
GST pull down：已知蛋白质和GST融合，与细胞或 组织的“蛋白质汤”混合，用谷胱甘肽亲和层析分 离和已知蛋白质结合的新蛋白质。GST tag。 Biotin－Avidin结合：Biotin标记已知蛋白质，通过 Avidin结合biotin标记的蛋白质，从而得到与biotin 标 记蛋白结合的新蛋白质。优点是biotin－avidin的结 合是最牢靠的；缺点是细胞内结合biotin的蛋白质很 多。 各种不同的tag。许多
SDS－PAGE acrylamide的浓度
蛋白质上样的量 相邻泳道的蛋白质量、离子强 度和样品体积 转移膜：PVDF膜 nitrocellulose膜 抗体
免疫共沉淀 免疫共沉淀：Ab－Pr1－Pr2 非特异性结合：Pr1－Ab－Pr2
免疫共沉淀
1 2
3
1. 抗体很差， 2. Western blot问题 3. Loading比例不对 4. 样品太多 5. 正确
•Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合） •Affinity interaction（亲和作用） •Yeast two-hybrid and phage display（酵母双 杂交和噬菌体展示） •Surface Plasmon Resonance •FRET •Proteomic analysis（蛋白质组学技术）
binding
wash
elution
Biotin－Avidin结合：生物界最稳定的结合之 一
蛋白质-蛋白质直接相互作用
•Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合） •Affinity interaction（亲和作用） •Yeast two-hybrid and phage display（酵母双 杂交和噬菌体展示） •Surface Plasmon Resonance •FRET •Proteomic analysis（蛋白质组学技术）
Western blot
1、电转移效率 2、PVDF膜的充分浸润 3、转移液中有太多的SDS 4、膜的损坏 5、转移时胶和膜没有完全接触 6、抗体的问题 7、抗体的浓度太高或太低 8、还原性物质的存在 9、封闭不充分
Acceptor signal is increased at the acceptor emission maximum (510 nanometers)
Wavelength of the Fluorescent Proteins
Color defining GFP mutation (source) Excitation (max)
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
Excitation frequency
Emission frequency
Donor
(2-10nm)
Acceptor
Emission frequency = Excitation frequency
Donor is excited at the maximum absorbance wavelength (380 nanometers) of the donor
蛋白质相互作用： 1. 本身具有生物学意义：这样的相互作 用在生物体中是起什么作用的 2. 发展技术：利用这样的相互作用创造 出一些人为的作用
研究蛋白质相互作用的目的是发现并明确其相 互作用的生物学意义
蛋白质相互作用是一种表象，通过表象分析规 律，是研究蛋白质相互作用的核心 “种瓜得瓜，种豆得豆”是一种表象，反映了 遗传这样一种本质 现象 可研究对象 合适的研究方法
基因库
lacZ
基因库
B-Pr
AD
确定蛋白质间相互作用的功能基团
Protein A 1 2 3 4
1
2
3
3
白
B-Pr
兰
白
白
鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用
A-Pr B-Pr
兰：相互作用 白：不相互作用
Two-Hybrid的优点： •是酵母细胞内的in vivo相互作用。
•只需要cDNA，简单。
4
5
蛋白质-蛋白质直接相互作用
•Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合） •Affinity interaction（亲和作用） •Yeast two-hybrid and phage display（酵母双 杂交和噬菌体展示） •Surface Plasmon Resonance •FRET •Proteomic analysis（蛋白质组学技术）
蛋白质-蛋白质直接相互作用
Protein interaction Affinity: A+B=AB
Kd=[A][B]/[AB], Kd: dissociation constant
Interaction Streptavidin-biotin binding Antibody-antigen interaction (good) Antibody-antigen interaction (weak) Enzyme-substrate Kd 10-14M 10-8-10-10M 10-6M 10-6-10-10M
•弱的相互作用也能检测到。
Two-Hybrid的缺点： •都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用。 •酵母的翻译后修饰不尽相同。尤其是蛋白质 的调控性修饰。 •自身激活报告基因。 •都基因库的要求比较高，单向1/3是in frame •蛋白质毒性。 •第三者Z插足介导的相互作用。 •假阳性。
UAS
蛋白质-蛋白质直接相互作用
•Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合） •Affinity interaction（亲和作用） •Yeast two-hybrid and phage display（酵母双 杂交和噬菌体展示） •Surface Plasmon Resonance •FRET •Proteomic analysis（蛋白质组学技术）
蛋白质-蛋白质直接相互作用
•Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合） •Affinity interaction（亲和作用） •Yeast two-hybrid and phage display（酵母双 杂交和噬菌体展示） •Surface Plasmon Resonance •FRET •Proteomic analysis（蛋白质组学技术）
Yeast two-hybrid （酵母双杂交）
• 发现新的相互作用蛋白质
• 鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用 • 确定蛋白质间相互作用的功能基团
DB
UAS
AD
lacZ
DB
UAS
AD
lacZ
DB
UAS lacZ
发现新的相互作用蛋白质
AD DB
UAS
B-Pr
lacZ
B-Pr
基因库
Y
DB UAS
Surface Plasmon Resonance
SPR is used to monitor interactions occurring in a biospecific surface on a metal layer by measuring changes in the solute concentration at this surface as a result of the interactions.
GST pull down
GST Fusion Protein Purification
binding
wash
elution
GST pull down
GST fusion protein 不够纯， 用作bait会产生太多的非特 异性蛋白质污染。
GST pull down
GST Pulldown
• 从物学功能到蛋白质相互作用。通过改变生 物学现象，分析蛋白质间的遗传相互作用， 进一步研究相关蛋白质的相互作用。
容易犯的错误：找到了平行变化的不相关蛋白 质。
发现蛋白质相互作用
蛋白质-蛋白质直接相互作用 遗传功能分析 序列与结构比较模拟
验证蛋白质相互作用 不同方法的交叉验证 不同生物体系中验证
SPR 优点：无标记、实时
Label-free detection SRP does not require any labels or reporter groups to detect biomolecular interactions. It follows every step in a multistep analysis procedure, in contrast to label-based methods that often only report the final step. Real time measurement The progress of interactions is displayed directly, as a plot of response (which is directly related to concentration changes at the surface) against time. Immediate feedback on the status of an interaction speeds up assay development and analysis. The results can be processed further after the run, for example to extract kinetic constants for the interaction.
ຫໍສະໝຸດ Baidu
研究蛋白质相互作用需要微观和宏观的结合
象与象的一部分
定量分析是研究蛋白质相互作用的基础
Input：10~20mg total proteins IP sample： Immunoprecipitated from 1000mg of total proteins
定量分析是研究蛋白质相互作用的基础
Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）
Western blot：变性抗原，主要用于检测蛋白质的存 在与否。
免疫共沉淀：非变性抗原，用于鉴定不同蛋白质间的 相互作用。 免疫共沉淀：Ab－Pr1－Pr2 非特异性结合：Pr1－Ab－Pr2
稳定的相互作用与瞬间的相互作用共同构成蛋 白质相互作用的内涵。
研究蛋白质相互作用是为了研究相应的 生物学功能
确定研究目标
寻找相互作用
建立相互作用网络 和功能体系
• 从蛋白质相互作用到生物学功能。运用蛋白 质直接相互作用，发现相互作用蛋白质，再 分析这些作用的生物学意义。
容易犯的错误：研究一大堆的蛋白相互作用， 却不知道这些相互作用有什么生物学意义。
lacZ
Auto activation
DB
X
AD
UAS
lacZ
Y
Phage display（噬菌体展示）
Phage display（噬菌体展示） Phage display的最大优点是数量大 细胞：108~109 细菌：1010 Phage：1012
寻找受体的配体
7肽：8x1016
蛋白质-蛋白质直接相互作用
Relative exposure level
研究蛋白质相互作用的意义 1、蛋白质间的相互作用是细胞生命活动 的基础。
2、基因只是决定蛋白质，而蛋白质才是 发挥作用的主体。蛋白质的相互作用是 发挥其功能的主要活动。
生物学效应
稳定相互作用 形成蛋白质复合体
瞬时相互作用
（enzyme-substrate） （protein complex）
Affinity interaction（亲和作用）
GST pull down：已知蛋白质和GST融合，与细胞或 组织的“蛋白质汤”混合，用谷胱甘肽亲和层析分 离和已知蛋白质结合的新蛋白质。GST tag。 Biotin－Avidin结合：Biotin标记已知蛋白质，通过 Avidin结合biotin标记的蛋白质，从而得到与biotin 标 记蛋白结合的新蛋白质。优点是biotin－avidin的结 合是最牢靠的；缺点是细胞内结合biotin的蛋白质很 多。 各种不同的tag。许多
SDS－PAGE acrylamide的浓度
蛋白质上样的量 相邻泳道的蛋白质量、离子强 度和样品体积 转移膜：PVDF膜 nitrocellulose膜 抗体
免疫共沉淀 免疫共沉淀：Ab－Pr1－Pr2 非特异性结合：Pr1－Ab－Pr2
免疫共沉淀
1 2
3
1. 抗体很差， 2. Western blot问题 3. Loading比例不对 4. 样品太多 5. 正确
•Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合） •Affinity interaction（亲和作用） •Yeast two-hybrid and phage display（酵母双 杂交和噬菌体展示） •Surface Plasmon Resonance •FRET •Proteomic analysis（蛋白质组学技术）
binding
wash
elution
Biotin－Avidin结合：生物界最稳定的结合之 一
蛋白质-蛋白质直接相互作用
•Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合） •Affinity interaction（亲和作用） •Yeast two-hybrid and phage display（酵母双 杂交和噬菌体展示） •Surface Plasmon Resonance •FRET •Proteomic analysis（蛋白质组学技术）