抗原偶联选择方法
生物偶联 反应类型
生物偶联反应类型
生物偶联反应是通过生物技术手段，利用生物分子的高度特异性选择性识别和结合性质，将两种生物分子或者分子与固体表面之间进行特异性相互作用，从而实现一种新的化学键合，具有高效特异性及环境友好等特点。
生物偶联反应的类型包括:
1.抗原-抗体偶联反应：抗原-抗体偶联反应是由于抗体与其特异性抗原结合而发生的生物偶联反应。
这种反应常用于生物分析、免疫沉淀等实验中。
2.酶偶联反应：酶偶联反应是指将酶和其底物相结合, 通过酶底物反应来进行检测或者产生荧光和发光信号等应用。
常见的是酶联免疫吸附分析法(ELISA)。
3.核酸偶联反应：核酸偶联反应是通过两个互补的DNA或RNA链之间的特异性结合形成一个新的核酸复合物。
4.蛋白质偶联反应：通过蛋白质的特异性结合，例如利用His-Tag技术，利用His-Tag结合亲和纯化树脂等将蛋白质进行纯化。
5.生物素-链霉素偶联: 生物素-链霉素的偶联体系可特异性结合，广泛用于免疫印迹、免疫磁珠、核酸探针、酶标记等领域。
这些生物偶联反应的类型可以根据具体的应用来选取合适的反应类型，从而实现目标分子的特异性检测、纯化等操作。
抗原偶联选择方法
载体的选择：1.载体表面应首先应具有化学活性基团，这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶联，这是化学偶联制备抗原的前提；2.其次,载体应具备一定的容量,可以偶联足够的分子；3.载体还应该是惰性的,不应干扰偶联分子的功能；4.而且载体应具有足够的稳定性,且应该是廉价易得的.载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等这些蛋白质分子中的α和ε-氨基（等电点8和10）、苯酚基、巯基（等电点为9）、咪唑基（等电点为7）、羧基（等电点2～4,大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ-羧基）等在等电点pH条件下,一部分成为质子,另一部分未质子化的亲核基团则具有反应活性,可与半抗原中的对应基团结合.当然,这些基团的反应性也取决于蛋白质各种氨基酸残基的微环境.牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HAS）分子中含有大量的赖氨酸,故有许多自由氨基存在,且在不同pH和离子强度下能保持较大的溶解度.此外,这些蛋白质在用有机溶剂（如吡啶、二甲基甲酰胺）溶解时,其活性基团仍呈可溶状态,因此,这两种蛋白质是最常用的载体蛋白质.近年来,有研究报道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚赖氨酸)作载体,表现出能增加半抗原的免疫原性,从而使产生征对半抗原的特异性抗体可能性增加,被广泛应用。
人工抗原合成方法：小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响.通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合,不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行.一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法,常用的方法如下：分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联1）混合酸酐法（mixed anhydride method）：也称氯甲酸异丁酯法。
偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride)，然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
抗体偶联类型-概述说明以及解释
抗体偶联类型-概述说明以及解释1.引言1.1 概述抗体偶联是一种重要的生物技术方法，用于将抗体与其他分子或药物结合起来，以发挥其特定的生物活性或治疗效果。
通过将抗体与不同类型的载体结合，可以实现多种功能，如药物递送、免疫治疗、诊断等。
本文旨在探讨抗体偶联的不同类型以及其在生物医学领域中的应用。
抗体偶联主要可以分为两种类型：类似物偶联和共价偶联。
类似物偶联是指将抗体与类似抗体的分子结合，如单克隆抗体与重链抗体结合。
这种偶联方式可以利用类似抗体的结构相似性，增强抗体的亲和力或稳定性，从而提高其治疗效果。
共价偶联则是指将抗体与其他分子通过共价键连接在一起。
常见的共价偶联方法包括化学交联、酶标记、放射标记等。
这种偶联方式可以使抗体与其他分子牢固地结合在一起，从而实现目标分子的靶向治疗或荧光显影。
抗体偶联在医学研究和临床应用中具有广泛的应用前景。
例如，在肿瘤治疗中，通过将抗体与抗肿瘤药物结合，可实现肿瘤靶向治疗，减少对正常细胞的毒副作用。
另外，抗体偶联还可以用于免疫检测，通过将抗体与荧光物质或放射性示踪剂结合，可实现疾病标志物的快速检测和定位。
总之，抗体偶联作为一种重要的生物技术方法，具有丰富的应用前景。
不同类型的抗体偶联方式在生物医学领域中发挥着重要的作用，为疾病治疗、诊断和研究提供了有力的工具。
对抗体偶联类型的深入研究和应用探索，将有助于推动生物医学领域的发展，并为人类健康做出更大的贡献。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以参考以下内容：文章结构旨在为读者提供一个清晰的指南，帮助他们快速了解文章的内容和组织方式。
本文的结构主要分为引言、正文和结论三个部分。
在引言部分，我们将概述本文的主题，并简要介绍抗体偶联的概念和背景。
通过一些常见的例子，我们将阐述抗体偶联在医疗和诊断领域的重要性和应用。
接下来是正文部分，我们将介绍抗体偶联的两种常见类型：类型A和类型B。
对于每一种类型，我们将详细讨论其原理、特点和应用领域。
抗体偶联药物技术
抗体偶联药物技术抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）技术是一种新型的靶向治疗方法，它将单克隆抗体与小分子细胞毒性药物通过连接子进行偶联，形成一种能够同时具有靶向性和杀伤性的药物。
以下是对抗体偶联药物技术的主要方面的详细介绍：1. 抗体选择在ADC技术中，抗体的选择是至关重要的。
理想的抗体应具有高亲和力、高特异性和高稳定性。
通常使用的抗体是针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体，这些抗原通常在肿瘤细胞表面过度表达，而在正常细胞中不表达或低表达。
2. 药物载荷ADC中的药物载荷通常是小分子的细胞毒性药物，如化疗药物或毒素。
这些药物通过连接子与抗体进行偶联，形成ADC。
连接子的选择对于药物的稳定性、抗体的靶向性以及药物的释放至关重要。
3. 连接子连接子是ADC中的关键组成部分，它能够将抗体与药物载荷连接在一起。
理想的连接子应具有稳定性、可选择性、可降解性和低免疫原性。
常用的连接子包括硫醚连接子、腙连接子和二硫键连接子等。
4. 药代动力学优化ADC的药代动力学性能对其疗效和安全性具有重要影响。
研究人员通过改变抗体与药物载荷的比例、优化连接子的稳定性等手段来优化ADC的药代动力学性能。
优化后的ADC应具有较高的肿瘤组织浓度、较低的正常组织浓度以及较长的半衰期。
5. 安全性评估ADC的安全性评估是其开发过程中的重要环节。
在临床前研究中，需要对ADC进行全面的安全性评估，包括对动物的毒理学研究、药代动力学研究以及对免疫原性的评估等。
在临床试验中，需要对患者的安全性进行密切监测，包括对不良反应的记录和处理。
6. 临床试验ADC的临床试验通常分为多个阶段，包括初步安全性评估、剂量探索和扩大队列验证等。
在临床试验中，需要对患者的病情进行密切观察，并对ADC的治疗效果进行评估。
在试验结束后，需要对患者的生存期、生活质量等进行长期随访和评估。
总之，抗体偶联药物技术是一种具有巨大潜力的靶向治疗方法，它通过将单克隆抗体与小分子细胞毒性药物偶联在一起，实现对肿瘤细胞的精准打击和有效治疗。
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。
4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。
碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、??取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）2、??取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)3、??取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III 液）4、??将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下）5、??室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液6、??4度搅拌12小时7、??静置10小时（4度）8、??有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。
孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法1、??用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L 的溶液。
一种微球与抗体的定向偶联方法及应用与流程
一种微球与抗体的定向偶联方法及应用与流程
一种微球与抗体的定向偶联方法是通过生物素-亲和素相互作用实现。
该方法需要以下材料和步骤：
材料：
1. 微球：通常选择具有较大比表面积和良好的稳定性的微球，如磁性微球或聚合物微球。
2. 抗体：选择目标分子特异性的抗体。
步骤：
1. 微球表面修饰：将微球表面引入生物素官能团。
这可以通过直接合成或修饰微球表面的化学反应来实现。
2. 生物素修饰的抗体制备：将抗体与生物素分子结合，使抗体表面具有生物素官能团。
这可以通过化学交联或生物化学方法（如使用生物素化的抗体）来实现。
3. 微球与抗体的定向偶联：将生物素修饰的微球与生物素修饰的抗体进行反应，利用生物素-亲和素相互作用实现微球与抗体的定向偶联。
这可以在适当的缓冲液中进行，并通过控制反应条件（如反应时间、温度等）来优化偶联效率。
4. 优化及鉴定：根据具体的应用需要，可以进一步优化定向偶联方法，如调整微球和抗体的浓度或反应时间等。
最后，使用适当的方法（如免疫荧光染色、酶联免疫吸附分析等）来验证定向偶联的效果。
应用：
微球与抗体的定向偶联方法在生物分析、生物传感器和药物传递等领域具有广泛的应用。
例如，在生物分析中，可以利用微球上的抗体将目标分子捕获到微球表面，并通过
检测抗原-抗体反应来定量分析目标分子的存在和浓度。
另外，通过将药物修饰到微球上，可以实现靶向药物传递，提高治疗效果并减少副作用。
抗体adc偶联工艺
抗体adc偶联工艺
抗体均为蛋白质分子，可以结合到特定的抗原上。
ADC（Antibody-Drug Conjugate，抗体
药物偶联物）是一种通过将特定的药物与抗体结合来增强治疗效果的药物传递系统。
抗体ADC的偶联工艺通常包括以下步骤：
1. 选择适当的抗体：选择具有高亲和力且特异结合于靶向肿瘤细胞的抗体。
通常选择单克隆抗体，以确保高度专一性。
2. 修饰抗体：在抗体分子上引入化学修饰，以提供药物偶联的位置。
最常用的修饰是通过基于酶的反应，如Sortase A，将药物结合位点引入抗体分子中。
3. 药物偶联：将药物与修饰后的抗体结合。
药物通常是细胞毒性化合物，如化疗药物。
偶联的方法包括使用特定的化学反应（如酰胺反应）、交联剂（如SMCC）或特定酶的使用（如Lys-C）。
4. 纯化和表征：纯化ADC以去除未偶联的抗体和未偶联的药物。
然后，对ADC进行各种表征，如浓度测定、电泳分析和质谱分析。
5. ADC稳定性评估：对ADC的稳定性进行评估，包括在不同的温度、pH和储存条件下的稳
定性检测。
抗体ADC的偶联工艺可以根据具体的药物和抗体的要求进行修改和改进。
这种技术可以增强
药物的特异性，减少对正常细胞的毒性，提高治疗效果，并降低治疗剂量和副作用。
半抗原与蛋白质偶联技术课件
录
• 半抗原的介绍 • 蛋白质偶联技术的介绍 • 半抗原与蛋白质偶联的方法 • 偶联效果的评估 • 实例展示
01
半抗原的介绍
半抗原的定义
半抗原
是指那些能够与抗体结合，但没 有免疫原性的小分子物质。
半抗原的特点
具有反应原性，即能够与抗体结 合的特性，但本身不具有免疫原 性，不能诱导机体产生免疫应答 。
蛋白质偶联技术的应用
蛋白质偶联技术在免疫分析、 生物传感器、抗体药物等领域 具有广泛的应用。
通过将半抗原与蛋白质载体进 行偶联，可以制备出具有特定 功能的免疫分析试剂，用于检 测生物样品中的目标物质。
此外，蛋白质偶联技术还可以 用于制备抗体药物和生物传感 器，以治疗疾病和监测环境中 的有害物质。
03
荧光标记法
利用荧光标记技术检测偶联产物的荧光强度，通过与标准品比较，判断偶联产 物的活性。
偶联产物的稳定性检测
热稳定性检测
通过加热处理偶联产物，观察其稳定性和热失活情况，以评 估偶联产物的热稳定性。
储存稳定性检测
将偶联产物在不同温度和湿度条件下储存，定期检测其活性 变化，以评估偶联产物的储存稳定性。
偶联产物的活性检测
通过生物学实验验证偶联产物是否保 持了原有蛋白质的生物学活性，如细 胞增殖、信号转导等。
实际应用中的实例
肿瘤免疫治疗
利用半抗原与蛋白质的偶联技术制备肿瘤免疫治疗药物，通过激活患者自身的免疫系统 来攻击肿瘤细胞。
疫苗研发
将半抗原与病毒或细菌的蛋白质结合，制备出具有免疫原性的疫苗，用于预防传染病。
碳二亚胺法
总结词
一种高选择性的偶联方法，通过形成稳 定的酰胺键将半抗原偶联到蛋白质上。
VS
半抗原偶联
• 对氨基苯胺的衍生物的半抗原与抗体反应
• 抗苯胺、邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、 对氨基苯甲酸的抗血清。
• 旋光异构体（右旋酒石酸、左旋酒石酸、 内消旋酒石酸）
半抗原与载体偶联时，思考问题 •
1）半抗原的溶解度和稳定性：在结合反应中应不导致半抗原活性 的改变，同时也不能使载体变性至不溶解的程度。 2）偶联的位置：抗体对远离蛋白质联接点的半抗原部分有最好的 特异性，故联接时应使联接键远离半抗原的决定簇。 3）选择适合的偶联试 剂：不同的半抗原在偶联时，应根据半抗 原的化学结构，以及反应方式选择适当的偶联试剂。如小分子肽 类有一定的三级结构，在溶液中依靠氨基酸残基来维持其结 构的 稳定。因此，用双功能的亚氨酸酯不但对氨基酸有选择，而且能 代替被取代的每一个ε-氨基的正电荷。蛋白质与偶联剂接触后， 使不同蛋白质分子的功能基团 交联并凝聚。广泛交联的蛋白质， 其溶解度常降低，而这种溶解度差的蛋白质却是有效的免疫源。 • 4)载体蛋白的选择,异源性以及不干扰未来的检测对象 .
• （1） 琥珀酸酐法：本法用于带有羟基的半抗 原的改造。琥珀酸酐加水转变成琥珀酸。如将 带有羟基的半抗原和琥珀酸酐在无水吡啶中反 应，即可得到带有羧基的半抗原琥珀酸的衍生 物。
四、通过巯基偶联
• 将半抗原中的巯基，通过交联剂马来酰亚胺活 化的载体蛋白与含SH-的半抗原的交联
含巯基半抗原偶联反应图
七、通过酚基与载体蛋白偶联 • 一氯醋酸钠：本法适于带有酚基半抗原的改造。 将带有酚基的药物与一氯醋酸钠反应即可得到 带有羧基的半抗原衍生物
将酚基与对氨基苯甲酸反应 • 将酚基与对氨基苯甲酸反应导入羧基，再进一 步通过EDC等方法，实现半抗原与载体蛋白质 的偶联
八、通过糖基的过碘酸氧化法
关于半抗原偶联载体的方案 人工抗原的合成是化学免疫的重要问题
关于半抗原偶联载体的方案人工抗原的合成是化学免疫的重要问题，化学免疫研究的对象，除上面提及的药物、毒物、激素外，还有多糖类、神经递质、肽类、核酸及生物体内其它小分子活性物质，总起来说，它们大多都是无免疫原性的半抗原，在对其进行免疫学及其它相关研究时，一方面要通过化学合成的手段，即蛋白质连接技术，经与载体蛋白交联合成制备人工抗原，继而用其免疫动物制备相应的抗体或单克隆抗体，作为研究用的探针；另一方面还必须将此探针用各种标记物进行标记，如本文论及的酶标记，以便用作研究工具；在分子生物学研究中，包括核酸或基因探针的研究及应用，多种类型探针的标记也都将涉及蛋白质连接技术。
半抗原分子量一般较小，其结构及化学功能团的性质多种多样，数量各不相同，在与酶蛋白或载体蛋白进行交联时，必须考虑交联双方的性质、交联剂、交联方法和载体. 2．混合酸酐法制备G6PDH(葡糖—6—磷酸脱氢酶)标记利多卡因(Lidocaine．Li)结合物[29] (1)Li—混合酸酐的制备首先将Li经化学修饰(琥珀酸酐法，略)，在其分子中引入羟基(一COOH)，制成Li—COOH(Li一琥珀酸半酯)；然后，将此Li—COOHl0mg(0．0285mm0l)溶于375ul的DMF中，用电磁搅拌混溶。
在一10℃条件下，边搅动边滴入21ul的三乙胺，再缓慢滴入14ul的卡必醇氯甲酸酯，于一10。
C继续搅拌反应1．5小时，此全部过程应保持无水，即获得Li—混合酸酐(Li—MA)。
3．(2)酶——底物溶液的制备在冰浴中，将G6FDH(L．m)lmg用50mmol／LpH8．1Tris—HCl溶解，同时加入G6P—Na(葡糖—6一磷·酸钠盐)10mg及NADH 3mg(底物一辅酶系统，用于保护酶活性)，使其溶解，随后缓慢加入300ul卡必醇，用2m0l／LNaOH调pH至9．0。
4．(3)G6PDH —Li的交联将酶—底物溶液置于冰浴中，在搅拌条件下，每隔10~15分钟向此酶液中缓慢加入一定量(25ul，50ul，100ul……)的Li—MA溶液，反应10~15分钟后，分别取出反应液5u1测定酶活性及Li半抗原的抗体对标记酶活性的抑制率.直至加入Li—MA的量所引起酶活性的下降程度最低，而抗体对酶活性的抑制率又最高时，此标记过程即完成(表2—8) 5．表2—8 G6PDH—Lidocaine交联反应中酶活性变化及抗体抑制率3.碳化二亚胺法(EDC)制备人工抗原 4.最近几年，在对无免疫原性小分子物质的化学免疫研究中，采用碳化二亚胺作为交联剂制备合成人工抗原的工作愈来愈多，因为用这种试剂进行交联最为方便，除交联的一方作为载体的蛋白质，具有多个氨基或羧基外，不少小分于化合物也具有此反应基团，或通过化学修饰引入羧基。
人工结合抗原制备
人工结合抗原
半抗原 偶联桥
载体蛋白
半抗原：能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应 、又不能单独激发人或动 物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全 抗原。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物 质（ 如青霉素、磺胺剂等 ） ，称为简单半抗原。
蛋白偶联方法
• 含羟基半抗原的偶联
• ①琥珀酸酐法
-OH-+琥珀酸酐 无水吡啶 带有羧基的中间体 EDC法或混合酸酐法 结合产物
• ②羰基二咪唑法（CDI）
N，N’-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂
方法举例（EDC法实验步骤）
mTP 5 mg
cBSA 2.5 mg
EDC·HCl 79 mg充分溶解于
偶联桥
结构简单，能量低，直链，有助于半抗原暴露在外面 最好3-6个直链的碳原子结构
半抗原的分子空间结构
最好有分支结构， 最好尽可能利用不同位点都合成出人工抗原，然后 筛选。
人工抗原的质量评定
• 浓度测定
紫外吸收法、福林酚法、双缩脲法、微量凯式定量法、染色结合法和 荧光法等。
• 纯度鉴定和结构分析
紫外光谱扫描法 电泳技术鉴定是否达到电泳纯
正丁胺
-COOH-
中间体+NH3+
+氯甲酸异丁酯
结合产物
• ②碳二亚胺法(EDC)
EDC
半抗原
载体蛋白
关于半抗原偶联载体的方案
关于半抗原偶联载体的方案早上起来，一杯咖啡，看着窗外的阳光，心情大好。
今天要写的方案是关于半抗原偶联载体的，这个课题我已经研究了10年，是时候把我的思考整理出来了。
我们得明确半抗原偶联载体的概念。
简单来说，就是将半抗原和载体结合起来，形成一种新的免疫原，用于制备抗体或疫苗。
这个过程涉及到生物化学、分子生物学和免疫学等多个领域，所以方案要尽量全面，又要突出重点。
一、方案背景1.1半抗原概述半抗原，顾名思义，就是只有抗原性而没有免疫原性的物质。
它不能单独引起免疫反应，但可以与载体结合，形成免疫原。
常见的半抗原包括药物、糖类、多肽等。
1.2载体概述载体是具有免疫原性的物质，能够与半抗原结合，形成免疫原。
常见的载体有蛋白质、多聚糖、脂质等。
1.3半抗原偶联载体研究意义半抗原偶联载体在疫苗研发、抗体制备等领域具有广泛的应用前景。
通过半抗原偶联载体，我们可以提高抗原的免疫原性，降低副作用，提高疫苗的疗效。
二、方案目标2.1筛选合适的半抗原和载体2.2优化偶联方法，提高偶联效率2.3评估偶联载体的免疫原性2.4探索偶联载体在疫苗研发和抗体制备中的应用三、方案实施3.1半抗原筛选3.1.1收集文献，整理半抗原候选物质3.1.2分析候选物质的抗原性和免疫原性3.1.3筛选出具有潜在应用价值的半抗原3.2载体筛选3.2.1收集文献，整理载体候选物质3.2.2分析候选物质的免疫原性和生物相容性3.2.3筛选出具有潜在应用价值的载体3.3偶联方法优化3.3.1分析现有偶联方法的优缺点3.3.2设计新型偶联方法，提高偶联效率3.3.3对比实验，验证新型偶联方法的优越性3.4免疫原性评估3.4.1制备偶联载体3.4.2检测偶联载体的免疫原性3.4.3分析免疫原性结果，优化偶联载体3.5应用研究3.5.1疫苗研发3.5.2抗体制备3.5.3产业化推广四、方案进度安排4.1第一阶段：半抗原和载体筛选（1-3个月）4.2第二阶段：偶联方法优化（4-6个月）4.3第三阶段：免疫原性评估（7-9个月）4.4第四阶段：应用研究（10-12个月）五、预期成果5.1筛选出具有潜在应用价值的半抗原和载体5.2优化偶联方法，提高偶联效率5.3成功制备具有免疫原性的偶联载体5.4探索偶联载体在疫苗研发和抗体制备中的应用前景这个方案的实施需要团队的共同努力，大家一起加油，争取早日取得突破性成果！注意事项一：半抗原筛选的准确性解决办法：筛选半抗原时，一定要仔细分析文献，避免遗漏任何可能的候选物质。
如何用碳二亚胺法将半抗原偶联到蛋白上
如何用碳二亚胺法将半抗原偶联到【摘要】用碳二亚胺（EDC）法将14位羟基修饰的雷公藤内酯醇(TP)和不同的蛋白载体（阳离子化牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白）偶联合成TP的人工免疫抗原和检测抗原，紫外光谱鉴定偶联效果，计算偶联率。
利用免疫抗原免疫小鼠，制备小鼠多克隆抗体，用检测抗原分析血清抗体效价，利用抗原竞争ELISA分析抗体特异性，为进一步研究TP的分子作用机理以及制备TP的单克隆抗体奠定基础。
【关键词】雷公藤内酯醇；14位羟基修饰；人工抗原；多克隆抗体雷公藤内酯醇（triptolide，TP）分子式C20H24O6，分子结构如图1，相对分子质量360.41，为二萜类三环氧内酯化合物，是从植物雷公藤（Tripterygium Wilfordii Hook.f.）中提取的有效成分里活性最强的部分，具有消炎散结、清热解毒、抗菌、免疫抑制以及抗生育等功效。
长期以来，TP作为临床上公认的免疫抑制剂，主要用于各种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎以及器官移植排斥反应的治疗。
近年来研究发现，该药对多种肿瘤细胞有诱导凋亡的作用，与化疗药物联合应用能协同杀伤肿瘤细胞或逆转肿瘤耐药，说明它具有抗肿瘤效果，因此在肿瘤治疗方面的应用也日益受到人们的关注。
除此以外，它还对细胞发育增殖、细胞周期等有调控作用。
近年来，国内外对TP具有如此广泛作用的分子机理产生了越来越浓厚的兴趣，从多个不同的角度进行了研究。
但是，由于缺少方便快捷的TP检测手段，长期以来对TP直接作用位点的研究一直十分困难，对TP作用的靶蛋白和作用途径知之甚少。
细胞免疫化学是追踪分子在细胞内作用过程的有力工具，如果能够得到TP的抗体，就为利用细胞免疫化学研究TP的作用靶点和在细胞内的定位等提供了分子探针，为最终研究TP作用机制和寻找其靶蛋白提供了可能。
作为小分子半抗原，TP需要和大分子蛋白载体偶联才能成为能够诱导产生抗体的免疫原。
为了不影响小分子的生物活性，提高偶联效率，我们需要选择合适的反应基团。
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。
4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。
碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、??取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）2、??取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)3、??取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III液）4、??将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下）5、??室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液6、??4度搅拌12小时7、??静置10小时（4度）8、??有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。
孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法1、??用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。
2、??加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。
多肽抗原的设计与抗体制备第
BAG4： SR00079 LRRSGYGPSDGPSY
SR00007 Dicer GKVRVTVEVVGKGK
合成完整长度粗肽的纯度不仅取决于多肽的本身长度和序列的特异性，还和使用的各种试剂的质量密切相关，因此我们合成多肽使用的试剂都是色谱纯。 Fmoc固相多肽合成每个氨基酸的偶连效率在95%以上。对于一个15aa的粗肽，其完整长度多肽的合成效率一般在50%左右。
72
5
981(10)
表 葡聚糖凝胶(Sephadex )的物理特性
多肽脱盐条件选择
Sephdex G-15: 适用于分子量在1500-2000多肽的脱盐，对于分子量超过1500的多肽能够完全排阻。
柱子的选择：鼎国自产10mm×20cm色谱柱
柱床体积：根据上样体积确定，一般柱床的体积不要少于上样体积的10%。我们一般脱盐1.0ml的多肽，柱床体积通常选者10-15ml。
免疫原性肽选择的基本程序
尽量使用N端或C端的序列
利用在线设计软件或DNAStar筛选抗原性强的多肽序列
01
该序列经Blast后在人的其他蛋白中同源性要低，最好在小鼠或大鼠中高度保守
02
用peptide companion 软件判定易于合成的14-16个氨基酸
03
免疫原性肽选择的注意事项
避开信号肽，磷酸化，糖基化位点 避开很多蛋白所共有的相同的或相近的motif,例如zinc finger，SH2 domains ，GTP binding sites 。 有些蛋白在成熟的过程中会切割掉一小段肽段。 如果选用MBS交联方法，需要在N端或C端加上C 对于有些基因来说，可能含有不止一个转录异构体（transcript variants ），这时就要在这些转录异构体的共有序列中寻找抗原多肽
生物偶联技术原理与应用
生物偶联技术原理与应用一、偶联技术原理偶联技术是指在生物体系中将两个或多个分子连接起来的方法。
在生物学领域，偶联技术常用于将一个生物分子（称为偶联物）与另一个目标分子（称为底物）连接起来，以实现特定的功能或研究目的。
二、抗体偶联抗体偶联是指将抗体与另一种分子连接起来，形成偶联抗体。
这种偶联抗体可以用于诊断或治疗，例如免疫疗法、药物传递和放射免疫显像等。
在抗体偶联过程中，要确保抗体的活性和特异性不受影响，同时保证连接的分子与目标分子有较高的亲和性。
三、核酸偶联核酸偶联是指将核酸（如DNA或RNA）与另一个分子连接起来。
这种偶联的核酸可以用于基因诊断、基因治疗和核酸疫苗等领域。
在核酸偶联过程中，要保证核酸的稳定性和活性，同时选择适当的连接方法以保证偶联物的功能和安全性。
四、酶偶联酶偶联是指将酶与另一个分子连接起来，形成偶联酶。
这种偶联酶可以用于生物催化反应和生物传感器等领域。
在酶偶联过程中，要选择适当的酶和连接分子，以保证偶联酶的活性和稳定性。
五、荧光标记偶联荧光标记偶联是指将荧光物质与另一个分子连接起来，形成荧光标记物。
这种荧光标记物可以用于生物成像、生物传感和免疫分析等领域。
在荧光标记偶联过程中，要选择适当的荧光物质和连接方法，以保证荧光标记物的稳定性和灵敏度。
六、放射性标记偶联放射性标记偶联是指将放射性同位素与另一个分子连接起来，形成放射性标记物。
这种放射性标记物可以用于放射免疫分析、放射显像和放射治疗等领域。
在放射性标记偶联过程中，要选择适当的放射性同位素和连接方法，以保证放射性标记物的安全性和有效性。
七、免疫偶联技术免疫偶联技术是指利用免疫反应原理将两个不同的分子连接起来的方法。
这种技术可以用于免疫分析、免疫疗法和疫苗研发等领域。
在免疫偶联技术中，要选择适当的抗体、抗原和连接方法，以保证连接物的特异性和活性。
八、生物传感器偶联生物传感器偶联是指将生物分子与传感器材料连接起来，形成生物传感器。
抗原核酸偶联方法 -回复
抗原核酸偶联方法-回复什么是抗原核酸偶联方法？这种方法在生物医学研究和临床诊断中的应用有哪些？抗原核酸偶联方法是一种常用于生物医学研究和临床诊断的实验技术。
它通过将抗体与核酸分子结合，实现对特定蛋白质或细胞的检测和分析。
这种方法的关键步骤涉及到抗体与核酸的修饰、结合和检测。
首先，抗原核酸偶联方法的第一步是对抗体和核酸进行修饰。
抗体往往需要与染料、荧光探针或酶等物质结合，以实现对特定抗原的检测和定位。
核酸分子则可以被标记为特定的序列或结构，以便与目标抗原发生结合。
这样，修饰后的抗体和核酸就具备了特异性和可检测性。
接下来，修饰后的抗体和核酸被混合在一起，在特定条件下进行结合。
这个过程非常关键，要求抗体和核酸之间有足够的亲和力和稳定性。
通常可以采用化学交联、亲和层析、生物转染等方法来实现抗体和核酸的结合。
完成结合后，抗原核酸偶联物就可以应用于生物医学研究和临床诊断。
该方法的应用非常广泛。
在研究方面，抗原核酸偶联方法可以用来检测细胞表面的特定蛋白质、分析蛋白质相互作用、研究抗体的亲和性和特异性等。
在临床诊断方面，抗原核酸偶联方法则具备了高灵敏度和高特异性的优势，可以用于检测疾病标志物、诊断感染病原体、评估药物的疗效等。
抗原核酸偶联方法具有多种不同的检测和分析技术。
其中，最常用的是免疫荧光和酶联免疫吸附测定法（ELISA）。
免疫荧光是一种通过检测抗体与荧光标记的核酸结合反应来实现定量或定位分析的方法。
酶联免疫吸附测定法则利用酶标记分子对抗原-抗体结合事件的放大效应，通过酶的催化作用转化为可检测的信号量。
这两种技术都具有高灵敏度和高特异性的特点。
总结起来，抗原核酸偶联方法是一种在生物医学研究和临床诊断中广泛应用的实验技术。
通过将抗体与核酸结合，该方法可以实现对特定蛋白质或细胞的检测和分析。
抗原核酸偶联方法的应用领域很广，包括研究生物分子相互作用、确定疾病标志物、诊断感染病原体等。
常用的检测技术包括免疫荧光和酶联免疫吸附测定法。
国内外抗体偶联磁球方法
国内外抗体偶联磁球方法
国内外抗体偶联磁球（Antibody-Crystallocenters Magnetic Beads，ACMB）的方法主要包括以下步骤：
1. 制备抗体偶联物：首先，需要将特异性抗体与磁球表面进行反应，
使得抗体能够牢固地结合到磁球表面。
在此过程中，需要严格控制反
应条件，以确保抗体的活性部位能够暴露出来，同时避免破坏磁性颗
粒与抗体之间的链接。
2. 化学偶联：接下来，需要将抗体偶联物与相应的抗原进行反应，使
得抗原能够被抗体识别并结合。
在这个过程中，需要确保所有的抗原
都能够与抗体偶联物成功结合，并保持其活性。
3. 磁分离和洗脱：反应完成后，将样品置于磁场中，抗体偶联物与抗
原结合的ACMB会被吸附到磁棒上，而未结合的ACMB则会被洗脱下来。
这个过程可以通过离心、过滤或凝胶过滤等方法实现。
4. 储存和运输：最后，需要将ACMB储存于适当的条件下，以确保其
稳定性和活性。
此外，国内外还有多种其他方法可用于抗体偶联磁球的制备，例如利
用免疫磁性纳米颗粒和纳米球等。
这些方法可以根据实际需求和条件
进行选择和应用。
总的来说，抗体偶联磁球是一种具有广泛应用前景的生物标志物检测
方法。
它具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，可以应用于临
床诊断、传染病检测、药物筛选等领域。
抗原与蛋白偶联方法
抗原与蛋白偶联方法常用的半抗原与蛋白偶联方法EDAC：EDC是一种羧基和氨基反应零长度交联剂。
EDC和与羧基反应形成氨基活化的O酰基异脲中间体，他可以迅速与氨基反应形成酰胺键，释放异脲副产物。
该媒介在水中不稳定，因此两步共轭反应依赖N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)稳定结构。
和氨基失败的反应导致媒介水解，羧基再生，释放N 代尿素。
副反应形成N酰基脲，这通常限制羧基定位蛋白的疏水区。
EDC用于偶联半抗原到载体蛋白原料：1.载体蛋白：2mg牛血清白蛋白BSA，卵白蛋白OV A或血蓝蛋白Keyhole limpet hemocyanin KLH2.偶联缓冲液：0.1M MES，pH4.5-53.EDC：10mg4.Hapten：1-2mg5.脱盐柱或凝胶过滤柱5-6KD阻隔。
操作步骤：1.平衡EDC到室温，加入2mg的BSA、OVA或KLH到200ul偶联缓冲液，如果用热电的载体蛋白用无菌水溶解。
2.溶解2mg多肽或半抗原到500ul偶联缓冲液加入200ul载体蛋白中。
3.对BSA或OVA结合，溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加100ul(1mg EDC)该溶液到载体-多肽溶液中。
对KLH结合溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加50ul(0.5mgEDC)该溶液到载体-多肽溶液中，如果发生沉淀进一步减少EDC用量。
4.室温反应2小时。
用脱盐柱纯化偶联蛋白，如果存储免疫原数天，无菌过滤储存在无菌容器中4或-20度保存。
用EDC和NHS或Sulfo-NHS两步法偶联偶联蛋白用EDC和Sulfo-NHS活化反应在pH4.5-7.2有效，然而NHS激活或Sulfo-NHS激活的分子具有伯胺在pH7-8时有效。
最好的结果是最初第一步反应在MES缓冲液中(或其他无氨基无羧基缓冲液pH5-6)，接着用磷酸盐缓冲液提高pH7.2-7.5(或其他无氨基无羧基缓冲液)立即与含氨基分子反应。
为了淬灭第一个反应用2巯基乙醇或其他可以容易去除的试剂，用脱盐柱换液。
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抗原偶联选择方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1
载体的选择：
1.载体表面应首先应具有化学活性基团，这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶联，
这是化学偶联制备抗原的前提；
2.其次,载体应具备一定的容量,可以偶联足够的分子；
3.载体还应该是惰性的,不应干扰偶联分子的功能；
4.而且载体应具有足够的稳定性,且应该是廉价易得的.
载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等
这些蛋白质分子中的α和ε-氨基（等电点8和10）、苯酚基、巯基（等电点为9）、咪唑基（等电点为7）、羧基（等电点2～4,大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ-羧基）等在等电点pH条件下,一部分成为质子,另一部分未质子化的亲核基团则具有反应活性,可与半抗原中的对应基团结合.当然,这些基团的反应性也取决于蛋白质各种氨基酸残基的微环境.牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HAS）分子中含有大量的赖氨酸,故有许多自由氨基存在,且在不同pH 和离子强度下能保持较大的溶解度.此外,这些蛋白质在用有机溶剂（如吡啶、二甲基甲酰胺）溶解时,其活性基团仍呈可溶状态,因此,这两种蛋白质是最常用的载体蛋白质.近年来,有研究报道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚赖氨酸)作载体,表现出能增加半抗原的免疫原性,从而使产生征对半抗原的特异性抗体可能性增加,被广泛应用。
人工抗原合成方法：
小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响.通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合,不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行.一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法,常用的方法如下：
分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联
1）混合酸酐法（mixed anhydride method）：也称氯甲酸异丁酯法。
偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixedacidanhydride)，然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
2）碳二亚胺法（CDI）：碳二亚胺(EDC)使羟基和氨基间脱水形成酰胺键,半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间物,然后再与蛋白质上的氨基反应,形成半抗原与蛋白质的结合物（见图）.EDC被称作零长度交联剂之一,因为它作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子.
此连接方法十分简便,只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中,然后加入水溶性碳化二亚胺,搅拌1～2h,置室温24h,再经透析即可。
如果半抗原分子中不含羧基,可通过某些化学反应引入羧基.在引入羧基后,也可用上述方法进行偶联。
含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联
1）戊二醛法：双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff键(-N=C<，在半抗原和蛋白质间引入一个5碳桥。
这一反应条件温和，可在4～40℃及～内进行，操作亦简便，因此应用广泛。
戊二醛受到光照、温度和碱性的影响，可能发生自我聚合，减弱其交联作用，因此最好使用新鲜的戊二醛。
2）重氮化法：用于活性基团是芳香胺基的半抗原，芳香胺基与NaNO2和HCl
反应得到一个重氮盐，它可直接接到蛋白质酪氨酸羧基的邻位上，形成一个偶氮化合物。
含羟基半抗原的偶联
1）琥珀酸酐法：半抗原的羟基与琥珀酸酐在无水吡啶中反应得到一个琥珀酸半酯(带有羧基的中间体)，再经碳二亚胺法或混合酸酐法与蛋白质氨基结合，在半抗原与蛋白质载体间插入一个琥珀酰基。
2）羰基二咪唑法：N，N’-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂，在肽合成中首次表明了是形成极好的酰胺键试剂[33]。
含羟基的分子同羰基二咪唑反应，形成中间体咪唑基甲酸酯，它能和N-亲核试剂反应，得到N-烷基化的甲酸酯键，通常蛋白质通过N-端(α-氨基)和赖氨酸侧链的(ε-氨基)和分子形成不带电的类似尿烷的衍生物，具有极好的化学稳定性。
含巯基半抗原的偶联
可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。
此外，将载体蛋白用溴乙酰胺激活。
或将载体蛋白与半抗原在的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。
影响人工抗原质量的因素主要有： 1) 偶联比 2) 偶联桥 3）半抗原的分子空间结构人工抗原的质量评定：
1.浓度测定（mg/ml，每ml抗原溶液中含有蛋白质多少mg）紫外吸收法、Folin-酚法、
双缩脲法、微量凯式定量法、染色结合法和荧光法
2.纯度鉴定和结构分析分配层析和电泳技术
3.偶联比的测定分光光度法标记抗原示踪法
反应实例
氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法?
1、5．8mgMIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
2、酶用2ml50mmol/LNa2CO3溶解。
3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。
4、过sephadexG-25层析柱，柱用含NaCl100mmol/L、MgCl210mmol/L、2-巯基乙醇10mmol/L的50mmol/LTris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA％（w/v）、NaN3%(w/v)的缓冲液中。
碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤
1、取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）
2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)
3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III液）
4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下）
5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液
6、 4度搅拌12小时
7、静置10小时（4度）
8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原
芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤?
1、用mol/LHCl溶液配制4mmol/L浓度的半抗原。
2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。
NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50mmol/LKI进行监控。
游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。
3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。
4、用、浓度为200mmol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。
5、边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH 到。
6、冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到。
7、用PBS透析2天
8、 -20度保存（浓度为20mg/mL）。