(完整版)现代生命科学与生物技术-07基因技术

第3步：终止反应（4℃）
PCR反应在热循环仪（PCR仪）中自动化进行。
反应控制：温度的加热或冷却过程，关键是每
步反应温度精确，升温和降温的时间控制。
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PCR产物的电泳结果
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7.1.3 PCR技术应用进展
• 原理没有变，技术改进，派生出多种类型和用 途。
• 基因克隆方面： ➢反转录PCR(RT-PCR)：以RNA为模板，基因
扩增 ➢多重PCR(multiplex PCR)：同一反应中使用
多组引物，扩增多个基因
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7.2 基因测序技术
基因是由A、T、G、C4种碱基组成 基因组测序就是排列出其DNA上所有碱基顺序。
gcgtacgtacgtagagtgctagtctagtcgtagcgccgtagtcg
atcgtgtgggtagtagctgatatgatgcgaggtaggggatagga
•1977，Maxam和Gilbert：化学降解法测序。PNAS。
•1980，Messing等: 测序优化，计算机数据处理。
•1982，Hood等: 部分自动化，荧光检测，PCR测序。
•1990，自动测序仪，测序酶，配套荧光染料，机器人高通量工具， 人类基因组测序启动。
•2000，毛细管测序仪，机器人使用，加速测序
•1965，Holley R等：测定酵母tRNA全部77bp的序列。
•1971，Wu,Taylor：dNTP，λDNA黏末端12bp。
•1973，Gilbert和Maxam，RNA聚合逆转录DNA，RNA测序。
•1975, Sanger:加减法测定了X174 DNA的6386bp序列。
•1977，Sanger：酶法测序。双脱氧链终止法。PNAS。
变性 退94火℃ 55℃ 延伸 72℃
第1轮
指数增加
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第2轮 第3轮5
2、PCR仪原理
加热方式：水加热，空气加热， 电热丝加热，半导体+电热丝
致冷方式：水致冷，空气致冷， 压缩机致冷，半导体致冷
样品池
传感
热敏元件
热泵
温控系统
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热池
仪器构造：三传感器， 双区域温度--温度梯度
❖应用：测序，功能研究，诊断与检测，物质
生产…
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7.1.2 PCR原理与技术
1、原理
1971，Kleppe等首先描述了基因合成的基本原理
PCR技术发明人： Kary Mullis（Cetus公司）
1983，构想DNA链的合成。
1985，Klenow片段扩增出哺乳动物单拷贝基因
1993，获得诺贝尔化学奖。
计算机芯片控 制过程参数6
2、PCR仪，热循环仪
The PCRJet from MegaBase gives fast PCR with large samples.
More 2020/2/19reactions in the same space with 1,536 wel7ls
3、操作过程
PCR的条件与循环参数
第1步：25－40个循环，变性(94-96℃，12min)——退火（降低温度使得引物结合到模板 的特定序列上。55℃，1-2min)——延伸 （DNA聚合酶由引物的3端开始，沿着DNA链 合成新的互补链。72℃，1000bp/min)。
第2步：强化延伸，72℃，7－13min
•PCR反应的基本组分： ✓DNA模板：含靶基因的DNA片段 ✓引物：1对人工合成的短寡核苷酸，18－25bp， 决定扩增的起始和终止位置及扩增长度 ✓DNA聚合酶：作用是催化合成复制扩增的区域 ✓底物：4种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)，A、T、G、 C ✓缓冲体系:提供适合聚合酶行使功能的化学环境。 •2石020蜡/2/1油9 ：防止蒸发；管盖（可加热）封闭反应管 8
•2005 － 2007 ， 以 Genome Sequencer System 、 Genome
Analyzer system、SOLiD System为代表的基因组测序分析系
统2的02诞0/2生/19，标志着进入超高通量基因组测序的新时代。
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7.2.2 传统测序技术
1、基本原理
（1）产生长度只差1bp的一系列寡核苷酸：
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7.2.1 核酸测序技术简史
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cgatgatagcggtaggtagacttcgcgcataaagctgcgcgag
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氧链终止法，Maxam-Gilbert DNA化学降解法。
聚合酶链式反应：Polymerase chain reaction， PCR
分子生物学技术，生物体外，扩增一段DNA片段。
百度文库
通202常0/2不/19 超过10kb,特定方法扩增40kb左右。
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PCR原理：在DNA聚合酶催化下DNA的复制过程，利用反复 相同程序，DNA聚合酶在体外扩增特定的DNA片段。
第7章 基因技术
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本章内容
7.1 基因克隆技术 7.2 基因测序技术 7.3 基因重组技术 7.4 生物制造
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7.1 基因克隆技术
7.1.1 基因克隆
❖概念：由少量（单拷贝）基因扩增产生大量 （高拷贝）基因。分子克隆
❖策略：化学合成－已知序列（60－80bp）; 生物合成（基因扩增）(已知部分或全部序列)； 文库筛选
固定起点，随机终止于特定一种或者多种残基（A、 T、C、G）。长度由特定碱基在DNA上位置所决定。
（2）检测长度只差1bp的一系列寡核苷酸：
SDS－PAGE电泳分离，发光成像。
（3）确定序列：放射性（32P、33P）、荧光（非放 射性荧光），直接读出DNA上的核苷酸顺序。
•产生只差1bp寡核苷酸方法，分两种：Sanger双脱