高粱组织培养技术研究进展

高粱组织培养技术研究进展彭祥;张德春【摘要】高粱是全球第五大谷类作物,是食品、饲料和加工业的原料,也是一种潜在的能源作物,具有重要的应用价值.然而,通过基因工程技术对高粱进行遗传改良却十分困难,其主要原因是缺乏高效的组织培养体系.结合近年来的研究,从基因型、外植体、培养基、植物激素等影响高粱组织培养的主要因素进行综述,重点讨论了促进高粱再生的策略,并提出解决高粱组培再生困难的两大研究方向:一是深入研究植物再生的遗传及表观遗传机制;二是根据各基因型的代谢特点,进一步优化培养条件,旨为建立高效的高粱组织培养体系提供参考.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2018(034)010【总页数】8页(P41-48)【关键词】植物组织培养;基因型;外植体;培养基;植物激素【作者】彭祥;张德春【作者单位】三峡大学生物技术研究中心,宜昌 443002;三峡大学生物技术研究中心,宜昌 443002;湖北省三峡特色植物繁育工程技术研究中心,宜昌 443002【正文语种】中文高粱（Sorghum bicolor L. Moench）是继小麦、水稻、玉米和大麦之后的全球第五大谷类作物，具有极强光合作用效率和抗逆能力，耐高温、耐旱、耐涝、耐盐碱、耐贫瘠、耐干热风，素有“作物中的骆驼”之称［1］。

高粱产品用途广泛，经济价值高，是食品、饲料和加工业的重要原料［1］。

在干旱和半干旱地区，尤其是非洲和亚洲某些地区，高粱是主要的粮食作物，为全世界超过30个国家约5亿人口提供膳食来源［2］。

近年来，能源危机和环境问题日益突出，生物质能以其独特的优点在解决能源和环境矛盾中受到世界各国的高度重视［3］。

高粱尤其是甜高粱，其秸秆中含有大量的可溶性糖分，可直接用于发酵生产燃料乙醇，秸秆中大量的纤维素是生产纤维素乙醇的重要原料［1］。

因此，甜高粱是目前公认的最有应用前景的再生能源作物之一［4］。

但现有高粱品种存在不少缺陷：其一，易感染病虫害［5-6］；其二，营养价值、产量及其他相关农艺性状有待改良。

植物基因工程育种是现代生物技术的重要组成部分，其在水稻［7］、棉花［8］、大豆［9］等作物中的应用已有广泛的报道，并取得良好的效果。

这为高粱的种质资源改良提供了一条思路。

在植物基因工程育种中，植物组织培养技术起着重要的基础作用。

高效的植物组培再生体系是成功进行遗传转化的先决条件［10］。

然而，大量的研究表明，高粱通过组织培养再生比较困难，这是制约高粱遗传转化的一个技术瓶颈。

长期以来，高粱植物组织培养面临着三大困难：有害色素的释放，再生频率低，愈伤组织再生能力维持时间短［11］。

这些问题直接制约着高粱遗传转化技术的发展。

虽然，目前已有研究者建立了高效的遗传转化体系，如Liu等［12］获得了高达20.7%的转化率，Wu等［13］获得了33%的转化率，Do等［14］利用标准双元载体，也获得超过14%的转化率，但这都是集中在个别所谓的模式品种（Tx430和P898012）中实现的，其他高粱品种依然面临着转化率低的问题［15］。

Li等［16］报道了一种高粱遗传转化体系，采用农杆菌侵染有创伤的成熟种子，试图通过种子萌发获得转基因植株，该方法巧妙避开了组织培养过程，基因型依赖性弱，然而最终转化率却只有4%。

Lowe等［17］利用玉米形态发生调控因子Bbm和Wus2来促进单子叶植物遗传转化，虽然Bbm和Wus2在包括玉米、高粱在内的单子叶植物中显示了一定的效果，提高了某些品种的转化率，然而该方法并不能完全摆脱基因型和外植体的限制。

因此，这个问题的解决仍然要回归到高效再生体系的建立上。

随着农业生物技术的发展，高粱组织培养技术也取得一定进展。

本文对近年来高粱组织培养研究成果进行总结，重点讨论基因型、外植体、培养基和植物激素对高粱组织培养的影响，并结合笔者的研究提出一些看法，以期为高粱组织培养技术研究提供参考。

1 基因型对高粱再生的影响在高粱组织培养过程中，不同基因型的高粱往往表现出极大的差异。

Cai等［18］利用幼穗诱导高粱胚性愈伤时，系统比较了8种高丹宁含量的高粱品种在色素产生、胚性愈伤形成、芽分化和分化能力的维持等方面的差异，结果表明：（1）丹宁含量高的基因型，其培养物通常会产生大量的酚类物质，但不同基因型的培养物产生的色素的颜色、密度不同，培养物对有毒色素的耐受力也不同，IS3150产生的色素为紫色，培养物坏死程度较轻，而IS4225产生色素为棕色，培养物坏死较为严重；（2）不同基因型培养物产生胚性愈伤的时间不同，IS3150在诱导培养后期即可见白色胚性愈伤，而IS6881直到继代培养阶段才出现胚性愈伤，此外，各基因型胚性愈伤诱导率（8%-70%）和分化率（1%-73%）差异较大；（3）继代培养过程中，褐化和生长活力丧失是胚性愈伤维持分化能力的障碍，不同基因型培养物，其分化能力维持差异较大。

例如，IS3150胚性愈伤培养40-160 d，可以产生900株幼苗，培养到220-310 d，仅产生15株幼苗，分化能力严重下降；而IS8260胚性愈伤培养40-160 d，可以产生154株幼苗，培养到220-310 d，可产生282株幼苗。

Assem等［19］对10种不同基因型高粱的体细胞胚形成和植株再生能力进行研究，以幼胚为外植体，结果显示，在胚性愈伤组织诱导过程中，LG3在各培养基上表现最好，平均胚性愈伤诱导率为（47.5±6.0）%，而SPP462却只有（13.4±3.3）%；在分化过程中，不同基因型高粱也表现出较大的差异，分化率为0-22.1%，这表明胚性愈伤组织的形成和植株再生高度依赖于基因型。

2 外植体对高粱再生的影响2.1 幼胚幼胚是最为常用的一种外植体。

Gamborg等［20］首次利用高粱幼胚作外植体，并观察到愈伤形态发生和植株再生过程。

显微观察表明，由幼胚再生植株存在两种途径：器官发生途径和体细胞胚发生途径［21］。

此外，高粱幼胚再生过程中，会出现体细胞变异现象［22］，这对于维持品系的稳定是不利的。

用幼胚作外植体时，取材时期、幼胚大小及幼胚放置方式对愈伤组织的诱导及分化培养有重要的影响。

马鸿图等［23］研究了幼胚胚龄与诱发率间的关系，发现授粉后9-12 d的幼胚呈透明状，接种到培养基上后，小盾片一直保持活力，诱导出的愈伤由小盾片产生，能够正常分化出芽，而授粉后15-18 d的幼胚呈白色，接种到培养基上后，胚根和胚芽迅速伸长，小盾片则死亡，愈伤从胚根和芽鞘节出产生，这种愈伤通常只能分化出根，很难分化出芽。

从幼胚大小上看，大小为0.7-1.0 mm的幼胚适合作外植体［23］，胚太小则不宜接种，太大则芽萌发太快［24］。

幼胚的放置方式对愈伤组织的诱导也有重要的影响，盾片朝上，有利于诱导盾片愈伤组织；而盾片朝下，幼胚容易直接萌芽，不利于胚性愈伤的产生。

2.2 幼穗幼穗也是一种比较理想的外植体。

Brettell等［25］首次报道了高粱幼穗通过体细胞胚途径再生植株的过程，其研究表明，幼穗的大小对胚状体的诱导率有极大的影响，大小在10-20 mm时，诱导率最高；对于较大的幼穗，可以通过增加2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）的浓度来提高诱导率，但这会抑制分化培养时芽的形成。

在供试的几个基因型中，G522表现最好，这说明采用幼穗做外植体通过体细胞胚途径再生也有一定的基因型依赖性；对于诱导能力差的基因型，通过采取更小的幼穗，并增加2，4-D浓度，能够提高体细胞胚的诱导率。

Jogeswar等［26］利用幼穗在三种重要的高粱品种中建立了一种高效的体胚发生和植株再生体系。

在体胚发生阶段，在MS培养基（Murashige and Skoog medium［27］）中添加 2 mg/L 2，4-D就能高效的诱导出体胚，添加0.5 mg/L6-糠氨基嘌呤（6-Furfurylaminopurine，KT）后，能更进一步的促进每个外植体上体胚的形成；植株再生时，在MS培养基中添加1.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）和1.0 mg/L KT对体胚的成熟和萌发最有效。

此外，有研究表明，与幼胚相比，采用幼穗作外植体能够在一定程度上的克服基因型对植株再生的限制［28］。

2.3 其他外植体幼胚和幼穗在高粱再生体系建立中有一定的优越性，因此被大多数研究者采用。

然而，幼胚和幼穗取材都有严格的时间限制，并且在自然条件下种植，受季节的影响，这给其应用带来诸多不便。

高粱成熟种子可以长期储存，从这点看，成熟种子也是一种较好的外植体。

徐丹等［29］利用成熟种子在甜高粱中建立了一种再生体系，虽然分化率不高，但其愈伤诱导率高达77.26%，组织学观察发现，其再生过程中除了体胚发生途径外，还伴随着器官发生途径。

赵利铭［30］利用甜高粱成熟种子，从遗传背景入手，选择了适合进行组织培养的品种M-81E，并对其再生条件进行优化，使得愈伤诱导率高达87%，分化率也达到38.4%。

这表明，在合适的培养条件下，利用成熟种子可以获得较高的再生率。

此外，其他外植体如成熟胚［31］、幼叶［32-34］、花药［35］、茎尖［36-38］及根［39］等（表1）在高粱组织培养中也有研究。

其中，茎尖是一种比较好的外植体，并逐渐被应用到禾谷类作物的遗传转化中［40］。

刘宣雨等［38］以高粱成熟种子萌发3-7 d的幼苗顶端分生组织为外植体，建立了一种高频高效的再生体系，该体系在供试的3个高粱品种中均获得较高的再生频率。

表1 高粱不同外植体组织培养研究外植体研究内容幼胚愈伤诱导和植株再生［20］；组织观察［21］；基因型差异及再生过程中的变异研究［22］；幼胚取材时期、大小及再生变异［23］；基因型和外植体差异［24］幼穗再生的基因型差异［25］；体胚发生和植株再生［26］；克服基因型对再生的限制［28］成熟种子高效再生体系建立［29-30］成熟胚高效再生体系建立［31］叶植株再生研究［32-33］；体细胞胚发生和植株再生［34］花药植株再生获得单倍体植株［35］茎尖不定芽直接再生［36-38］根愈伤诱导及植株再生［39］3 培养基成分对高粱再生的影响3.1 基本培养基在植物组织培养中，培养基为培养材料提供各种养分，包括碳水化合物、矿质营养、维生素和氨基酸等，以满足离体植物材料生长发育的需要。

MS培养基矿质营养比较均衡，广泛地适用于各种植物的组织培养。

因此，在高粱组织培养早期研究中，多数研究者采用MS培养基。

也有研究者采用其他培养基，如Maekinnon等［41］报道采用LS培养基（Linsmaier and skoog medium［42］）建立了一种甜高粱体细胞胚再生体系。