农杆菌感受态制备转化

农杆菌感受态细胞的制备及转化

农杆菌感受态细胞的制备及转化、浸润烟草1）挑取农杆菌单菌落于3 ml Sm（1000倍稀释）抗性的LB液体培养基中，28o C振荡培养过夜；2）取过夜培养菌液500μl加入到50ml的Sm抗性的LB液体培养基中，28o C振荡培养至OD600为0.5；3）5000rpm离心5min，倒掉培养液；4）加入10ml 0.15M NaCl悬浮农杆菌细胞，5000rpm 5min；5）倒掉上清，加入1ml 预冷的20mM CaCl2悬浮细胞，冰浴24h内使用，或者分装成每管200μl，液氮中速冻，保存于-70 o C备用。

取200μl感受态细胞，加入1ug质粒DNA，液氮中速冻1min，37o C水浴5min，加入1ml LB，28o C慢速振荡培养4－6h后，涂布于含有相应抗生素的固体培养基平板上，28o C 培养约48h。

挑取平板上长出的单菌落，接种于LB液体培养基（含有50μg/ml Kan和100μg/ml sm）中，28℃振荡培养过夜，碱裂解法小量提取质粒DNA，进行PCR及酶切鉴定。

用于浸润的菌液制备MMA buffer：10mmol/L MgCl2(95.21)，10mmol/L MES(195.23)，100μmol/L 乙酰丁香酮(196.20)（Acetosyringone）(MgCl2 :2g MES :2g 乙酰丁香酮:50ul)1）取单菌落接种于3ml LB（含有50μg/ml Kan和100μg/ml SM）培养基中28℃振荡培养过夜；2）取1ml活化后的菌液接入50ml LB（含有50μg/ml Kan和100μg/ml SM）中，28℃振荡培养至合适浓度OD600约0.8-1.0；3）4℃，4000rpm离心15min，沉淀用MMA buffer重悬，菌液终浓度为OD600约1.0-2.0；4）室温静置2hr以上，用1ml注射器对合适苗龄的本生烟进行浸润。

农杆菌感受态制备转化

农杆菌感受态制备转化
农杆菌感受态制备
1、划平板，单克隆培养
2、放单克隆于5mllb培养基中，挥至饱和状态（1-2day）
3、50m离心管中4500rpm，15min
4、50ml菌体用1ml氯化钙（预冷）悬浮，冰上操作
5、每100ul分装于冷冻管中，
液氮速冻后，-70℃保存
农杆菌转变
1．50ul感受态+5ul质粒，放入液氮速冻2min2．37℃热激5min
3.提1mllb，28℃培育3-4h
3.8000rpm/min去上清，200ullb悬浮，涂板吹干农杆菌抗性：利福平+庆大霉素+载
体抗性。

（gv3101）庆大霉素40mg/ml（0.4g/10ml）；利福平50mg/mldmso溶解
200mllb+200ul母液
农杆菌转回植物
1.植物去顶三天后转化，转前一天交足水
2.摇菌od600=1.2~1.6（先大挥后，挑200ul小挥200ml）
3.室温5000rpm，15min，弃上清，悬浮于等体积渗透培养基中（200ml/转化）每
1000ml渗透培养基：1/2ms2.42g；蔗糖50g；mes0.5g；用1mkoh调ph到5.8/5.7，定容
到1000ml，加10ul1mg/ml6-ba，加200ulsilwetl-7，混匀，将菌液悬浮，od=0.8左右。

不得低于0.7.
4.将菌液放入大平皿中，植株煮沸20s砌上白盆，过夜后掀开正常培育。

农杆菌感受态制备和转化：电转法和热击法

农杆菌感受态制备和转化：电转法和热击法电转法1）挑取新鲜单菌落接种到10mL YEP培养基（含50ug/ mL利福平）的试管里，28℃、200r/min培养过夜。

2）稀释2 mL培养过夜的农杆菌到含200 mL YEP培养基的500 mL三角瓶里，28℃、200r/min培养至OD600达0.5。

4℃、5000 r/min离心5分钟收集细胞。

3）用适量体积的 10%的甘油（用去离子水配置）重悬洗涤沉淀2次，洗涤时一定要轻柔地把细胞悬均匀，每次4℃、5000 r/min离心5分钟收集细胞，小心将上清倒掉。

4）将细胞重悬于1 mL 10%的甘油里，细胞可以立即使用，也可分装成每管40μL（质粒连接产物体积不能超过感受态细胞体积的1/10，否则容易爆杯），经液氮速冻后，-70℃冰箱保存备用。

5）取一管感受态细胞放在冰上融化，加入100ng DNA样品混匀，将样品放入冰上的电击杯中，按照电击仪厂商说明进行电击转化，之后涂布在含有相应抗生素的YEB平板上培养（质粒抗性+农杆菌菌株抗性）。

热击法1）挑单菌落于2 mL YEP培养基（含Rif 50mg/ mL）中28℃过夜活化；2）取2 mL过夜菌液接种于200 mL YEP培养基中28℃振荡培养生长至OD600约等于0.5左右；3）冰上放置30 min左右，5000 rpm离心5 min；4）在60 mL冰水浴预冷的无菌0.1M CaCl2溶液中中悬浮细胞；5） 5000 rpm离心5 min，悬浮细胞加入20 mL冰水浴预冷的含15%甘油的0.1M CaCl2，轻敲管壁使菌体悬浮均匀，每管200 µL 进行分装，液氮速冻后保存于-80℃待用；6）取200 µL感受态细胞，加入0.5 µg质粒DNA，液氮中速冻5 min，37℃水浴热击5min，之后迅速置于冰水浴中冷却2 min，然后加入1 mLYEB 空白培养基，28℃低速振荡培养4 hr；7） 6000 rpm离心2 min，弃部分上清，留约200 µL溶液，重悬细胞，涂布于含有相应抗生素的YEB 平板上，28℃倒置培养约36 hr。

实验三农杆菌感受态细胞制备及转化

农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-
植物基因工程实验技术
实验三、农杆菌感受态细胞制备及转化
王欢欢二零一二.十
OD值与细菌生长曲线
I.调整期（lag phase） II.对数期( logarithmic phase)
III.稳定期（stationary phase）
IV.衰亡期（decline phase）
在对数生长期，OD值可以代表菌体密度，细菌悬液浓度与光密度成正比，可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液浓度。但当生长到一定时间后，OD值不会再增加.
农杆菌感受态的制备
A • 挑取农杆菌单菌落于液体培养基中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜活化
B
• 菌液按1:50的比例转接于50ml新鲜培养基中，振荡培养至OD600为0.4-0.6；
C
• 菌液转移至10 ml的离心管中，冰浴30 min
D
• 4℃，5 000 rpm离心5 min, 弃上清，收集菌体
整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化效率将会
降低。防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所有的试剂都要灭菌
感受态细胞制备及转化中出现的问题
感受态长期保存要进行速冻，立即用-80 ℃冰箱或液氮速冻，而在使用时，用37 ℃水浴或手掌体温进行速融，避免冰晶形成过程对细胞造成的伤害，导致细胞破损不能存活。感受态细胞不能反复冻融。涂板后时间过长会有假阳性转化子的出现，抗生素在37℃过夜后失活，抗生素作用是抑制未转化的感受态细胞生长，而不能将这些细胞杀死，

农杆菌感受态的制备及电击转化

农杆菌感受态的制备及电击转化（1）将农杆菌EHA105菌株在含有50 mg/l 利福平的LB固体培养基上划线，28℃培养36~48 h；（2）挑取单克隆，于10 ml 含50 mg/l 利福平的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；（3）当OD600达到0.5~0.7时，6 000 r/min 4℃离心10 min收集菌体；（4）用预冷的10%无菌甘油洗菌体3次后用2 ml预冷的10%无菌甘油重悬沉淀，分装后于-70℃保存备用；（5）取重组质粒（pROK2-LbDREB）1 μl，加入100 μl EHA105感受态细胞，混匀后冰上放置；（6）将混合液放入预冷的电击杯中，1 800 V电击；（7）电击完成后迅速取出，加入500 μl LB液体培养基，迅速吸打混匀，尽可能多的将混合液移入无菌的离心管中，28℃摇菌1 h复苏；（8）取适量菌液涂布于含50 mg/l 卡那、50 mg/l 利福平的LB固体培养基上，28℃培养36~48 h；①农杆菌感受态细胞制备a. 在新活化的农杆菌EHA105/GV3101平板上，挑取单克隆于LB液体培养基（含利福平50mg/l）中，28℃，220r/min振荡培养至OD600达到0.6-0.7；b. 取1.5ml无菌离心管，每管分装1ml菌液，6000r/min离心10min；c. 去除上清，用1ml 10%无菌甘油重悬菌体，6000r/min离心10min，重复此过程3次，充分洗涤菌体以去除残留的培养基；d. 向洗好的菌体用100μl 20%无菌甘油重悬，-70℃保存备用。

②根癌农杆菌的电击转化a. 取-70℃保存的农杆菌感受态细胞，加入100ng重组质粒（pCAM-EG），吸打混匀后移入预冷的电击杯中；b. 1800V电压电击后迅速取出电击杯，加入500μl LB液体培养基，迅速吸打混匀；c. 尽可能多的吸出电击杯中的培养基，移入到无菌1.5ml无菌离心管中，28℃，振荡培养1h；d. 取转化的菌液200μl涂布于LB固体培养基（含利福平50mg/l和卡那霉素50mg/l）平板，28℃倒置培养24-48h。

农杆菌的转化流程

农杆菌的转化流程方案一1. 农杆菌的培养及感受态的制备①农杆菌菌株划YM平板，26—28℃培养48 h;②挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中，250 r/min，26-28℃悬浮培养12-16 h；③将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中，4℃，8000 r/min，离心8 min;④弃上清，加入用100 mM NaCl （4℃预冷）重悬收集的农杆菌；⑤ 4℃，8000 r/min，离心8 min;⑥弃上清，加入原始菌液1/50体积（800μ l/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化）并分装成100μ l)的20 mM CaCl2重悬菌体；⑦置液氮中10 s，放入—20℃冰箱中保存备用。

2。

农杆菌的转化(冻融法)将感受态农杆菌置于冰上，加入1μg质粒DNA（体积不宜超过10 μ l），充分混匀，冰上放置30 min；②置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中，待其融化；③加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃，230 r/min 培养2—4 h;(或直接用1 mlμl，留500 μ l于管中④ 3000 r/min 离心2 min收集菌体,将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板）；⑤重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干，28℃培养48 h；⑥挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中,28℃,250 r/min 培养48 h，将菌液用于保存或转化；注：EHA105抗利福平霉素，LBA4404抗硫酸链霉素.在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素，以防止杂菌污染.以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行.3．转基因烟草体系的建立⑴烟草无菌苗的培养:① 70%乙醇消毒烟草种子30 s后,用无菌水清洗两次,更换NaClO处理25—30 min，无菌水清洗四次;②将灭菌后的种子移至1/2 MS固体培养基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4)、1。

实验三农杆菌感受态细胞制备及转化

所以涂板后无单菌落出现，出现长满板的情况为抗生素失活。
农杆菌感受态的制备
A • 挑取农杆菌单菌落于液体培养基中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜活化
B
• 菌液按1:50的比例转接于50ml新鲜培养基中，振荡培养至OD600为0.4-0.6；
C
• 菌液转移至10 ml的离心管中，冰浴30 min
D
• 4℃，5 000 rpm离心5 min, 弃上清，收集菌体
农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-
E
• 菌体重悬于4ml冰预冷的20 mM的CaCl2中，冰浴10-20 min
F
• 4℃，5 000 rpm离心5 min，弃上清 • 菌体重悬于1ml冰预冷的20 mM的CaCl2，分装100µ l/管，24 h内使用或液氮速冻后-70 °C保存
G
感受态制备的要点：
OD600：0.4～0.6 OD值超过0.6必须重新活化当OD达到0.3时，每隔20min测一次OD值。分光光度计要测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态，有沉淀要摇匀。注意比色杯的正确选择及使用光电比色法定量测试原理：朗伯比尔定律：“当一束平行单色光垂直通过某一均玻璃比色杯只适用于可见光区,在紫外区测定时要用石英比色杯。石英玻璃在紫匀非散射的吸光物质时, 其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比”。外线到红外线的整个光谱波段都有较好的透光性能，可见光透过率在９３％以其中“吸收层厚度”就是实践中的比色杯厚度，如果测试中使用的比色杯不是同上，特别是在紫外光谱区，最大透过率可达８０以上，而普通的玻璃在紫外光一套，就无法保证其厚度一致，也就人为导致测试结果出现偏差。谱区的透过率较差。一般，测定波长在350毫微米以上时，可以用玻璃比色杯；

关于电激法做农杆菌的转化的问题(农杆菌,电激法,质粒)

农杆菌感受态细胞制备方法1．农杆菌稀释100倍过夜培养；3．5000rpm离心5min，弃去上清液；4．沉淀用1.5 ml 25mM CaCl2悬浮,冰浴20min；5．5000rpm离心5min，弃去上清液；6．每管用50μl CaCl2悬浮，20 min 后用于转化；7．加入质粒DNA 0.1～1μg，之后冰浴30 min；8．放入液N2中5min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；10．取出10～50μl菌液涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。

转化时一般200μl感受态细胞悬液（OD600为0.5-0.6）中加入的质粒含量不超过50ng,体积不超过10μl。

电转化步骤如下：1. 从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；2. 取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。

3. 将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。

4. 打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。

5. 将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；6. 将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。

7．37℃，220－250rpm复苏1小时。

8. 取20ul转化产物加160ulSOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。

其余菌液加1：1的30％的甘油后混匀－80℃保存。

注：每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。

电击杯清洗流程1．用清水将电击杯稍冲一下。

2．向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。

3．弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。

4．加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。

实验三农杆菌感受态细胞制备及转化

农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-
农杆菌的转化加入1mlyep培养基加入1mlyep培养基28慢摇培养24h28慢摇培养24h液氮中速冻1min迅速置于37水浴中5min取100?l农杆菌感受态加入约051?g质粒dna混匀后冰浴30min均匀涂布在含rif和kan的yep平板上28c温育48h至菌落出现离心去上清将细胞重悬于200?lyep培养基中载体分子带有抗生素抗性基因kan感受态受体细胞本身不具有抗生素的抗性没有导入载体的细胞在抗生素培养基上便不能生长
农杆菌感受态的制备
A • 挑取农杆菌单菌落于液体培养基中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜活化
B
• 菌液按1:50的比例转接于50ml新鲜培养基中，振荡培养至OD600为0.4-0.6；
C
• 菌液转移至10 ml的离心管中，冰浴30 min
D
• 4℃，5 000 rpm离心5 min, 弃上清，收集菌体
DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然
后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。特点：操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
农杆菌感受态
感受态细胞（competent cell)是细菌细胞具有的能够接受外源DNA
的一种特殊生理状态. 重组DNA要导入宿主细胞，其生理状态很重要，需要将细胞进行特殊处理，使细胞膜透性发生暂时性改变，成为容易接受外源DNA分子的状态，即成为感受态细胞。电击法， CaCl2法。不同的转化方法需制备不同的感受态。 CaCl2法制备感受态：正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态.

农杆菌感受态细胞的制备与转化

实验五、农杆菌感受态细胞的制备与转化
01
实验目的：学习农杆菌感受态细胞的制备和转化原理。
02
实验要求：掌握农杆菌的特点及真核表达载体结构及应用。
03
技术应用：高等植物（双子叶植物或单子叶植物）转基因鉴定基因功能，包括过表达（诱导型或组成型），RNAi等。
04
试剂： YEB液体培养基（液体和固体），Kan（卡那霉素），Rif（利福平）； CaCl2(预冷)；NaCl；50%无菌甘油。
02
实验材料：农杆菌GV3101菌株，重组双元表达载体pCAMBIA1300
01
农杆菌简介：第一例转基因植物就是用农杆菌介导法完成的。
01
菌种：根癌农杆菌和发根农杆菌，二者均属革兰氏阴性菌，对双子叶植物侵染广泛，在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。
02
实验原理：
双元表达载体系统主要包括两个部分：
2.双元表达载体系统
双元表达载体
双元表达载体中Ti质粒pCAMBIA1300 的结构
1
2
3
4
5
农杆菌感受态细胞的制备流程
将10l构建好的质粒DNA加入200 l 农杆菌感受态细胞中，混匀；
01
冰浴30min，液氮迅速冷冻3-5min，37℃水浴无抗）YEB培养基，28℃振荡培养4h（选作）；
一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如NPTII基因以及Lac Z基因等。双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。

农杆菌感受态的制备和转化

1.农杆菌感受态的制备感受态制备溶液:8% PEG 4000, 4% DMSO,50mM CaCl220Mm重悬细胞效果更好？挑取农杆菌(EHA105和LBA4404)单菌落接种于含氯霉素或链霉素和利福平5mLYEB液体培养基中,28℃,200～250r/min振荡培养30～36h,转入100mLYEB液体培养基中(1:20比例接种),在相同条件下培养至菌液OD600=0.4-0.6(约10h)。

然后冰上放置菌液15min，4℃,4000r/min离心10min,用适量50mmol/L冰浴CaCl2溶液重悬后在相同条件下离心,再用1/10原体积50mmol/L冰浴感受态制备溶液重悬,用1.5mL离心管分装成50μL小份,置于冰上，液氮速冻之后现用或-80℃保存备用。

Not Iike E.coli cells, fresh A.bacterium competent cells had higher transformation efficiency . As time went on . the transformation efficiency was decreased. When the storage time was longer than7 days and the temperature is higher than 4℃, A. bacterium lost the competent ability.2.冻融法转化农杆菌50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），与质粒混合均匀之后, 放置冰上30 min，然后置于液氮速冻3-5min,28℃水浴热激5min,然后加入无抗生素的LB培养基，28℃，200～250r/min振荡培养2h，涂布抗性平板，28℃静置培养36小时后挑菌落鉴定。

1. 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备1) 挑取单菌落GV3101，接种于5mL附加有50mg/L的利福平的液体LB培养基中，28℃，200rpm，过夜；2) 取2mL培养物至50mL液体LB培养基中，继续培养至OD600为0.5左右；3) 将培养物冰浴30min，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；4) 用l0mL 0.lmol/L冷的NaCl悬浮菌体；5) 4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；6) 1 mL 20mmo1/L冷的CaCl2悬浮，分装成50uL/管，液氮速冻后，-80℃保存。

实验三农杆菌感受态细胞制备及转化

若在350毫微米以下，必需使用石英比色杯。
农杆菌的转化
取100µ L农杆菌感受态，加入约0.5-1µ g质粒DNA,混匀后冰浴30 min
液氮中速冻1 min,迅速置于37℃水浴中5 min
加入1 mLYEP培养基，28℃慢摇培养2-4 h
离心去上清，将细胞重悬于200µ L YEP培养基中
均匀涂布在含Rif和Kan的YEP平板上，28 ° C温育48 h至菌落出现
DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然
后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。特点：操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
农杆菌感受态
感受态细胞（competent cell)是细菌细胞具有的能够接受外源DNA
的一种特殊生理状态. 重组DNA要导入宿主细胞，其生理状态很重要，需要将细胞进行特殊处理，使细胞膜透性发生暂时性改变，成为容易接受外源DNA分子的状态，即成为感受态细胞。电击法， CaCl2法。不同的转化方法需制备不同的感受态。 CaCl2法制备感受态：正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态.
E
• 菌体重悬于4ml冰预冷的20 mM的CaCl2中，冰浴10-20 min
F
• 4℃，5 000 rpm离心5 min，弃上清 •µ l/管，24 h内使用或液氮速冻后-70 °C保存
G
感受态制备的要点：
OD600：0.4～0.6 OD值超过0.6必须重新活化当OD达到0.3时，每隔20min测一次OD值。分光光度计要测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态，有沉淀要摇匀。注意比色杯的正确选择及使用光电比色法定量测试原理：朗伯比尔定律：“当一束平行单色光垂直通过某一均玻璃比色杯只适用于可见光区,在紫外区测定时要用石英比色杯。石英玻璃在紫匀非散射的吸光物质时, 其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比”。外线到红外线的整个光谱波段都有较好的透光性能，可见光透过率在９３％以其中“吸收层厚度”就是实践中的比色杯厚度，如果测试中使用的比色杯不是同上，特别是在紫外光谱区，最大透过率可达８０以上，而普通的玻璃在紫外光一套，就无法保证其厚度一致，也就人为导致测试结果出现偏差。谱区的透过率较差。一般，测定波长在350毫微米以上时，可以用玻璃比色杯；

农杆菌感受态制备与转化

农杆菌感受态制备与转化普通农杆菌感受态制备与转化：方案一1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。

2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。

3. 5k rpm离心5分钟。

4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。

5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。

如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。

6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。

7. 液氮中冷冻1分钟。

8. 37℃水浴溶化细胞。

9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。

10. 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。

11. 涂板，28℃培养2-3天。

电转农杆菌感受态细胞制备与转化方案二1．挑取单克隆接种于2mlYEP（含50mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250rpm，振荡培养过夜。

（如用5mlYEP，需培养36h）2．将菌液按1:100转移至200mlYEP（含50mg/l链霉素）培养液中，28℃，250rpm，振荡培养至OD=0.3(约4~5h)。

3．转入50ml的无菌离心管，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。

4．用20ml冰浴的HEPES(1mM，PH-7.0)重悬。

5．4℃，4000rpm离心10min，弃上清。

6．重复4、5步骤2~3次。

7．用2ml冰浴的10％甘油重悬。

8．每管100μl分装于1.5ml无菌的Eppendorf管中，-70℃保存。

1mM HEPES的配制：称取0.119gHEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH调pH至7.0，灭菌后待用。

注：HEPES需现用现配。

电击法转化农杆菌感受态细胞1．取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。

2．加2μl质粒DNA于100μl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。

农杆菌感受态细胞的制备与转化(PDF)

农杆菌感受态细胞的制备［实验原理］在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。

在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。

感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。

农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。

将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。

制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。

［实验仪器、材料和试剂］一、仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，-70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml离心管，冰浴，微量进样器及吸头。

以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。

二、材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株三、试剂：YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。

利福平（Rif）储液：50mg/ml20mM CaCl2，高压灭菌。

［实验步骤］1、挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；2、取过夜培养菌液1ml接种于50mlYEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；3、取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；4、加入1000µl 20mM CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；5、13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入500µl预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24hr内使用，或液氮中速冻1min，置-70℃保存备用。

质粒DNA直接导入农杆菌［实验原理］在低温下，外源DNA（质粒）可吸附到感受态细胞表面，诱导细胞吸收DNA。

农杆菌的转化流程

农杆菌的转化流程方案一1.农杆菌的培养及感受态的制备①农杆菌菌株划YM平板，26-28℃培养48 h；②挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中，250 r/min，26-28℃悬浮培养12-16 h；③将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中，4℃，8000 r/min,离心8 min；④弃上清，加入用100 mM NaCl (4℃预冷)重悬收集的农杆菌；⑤4℃，8000 r/min, 离心8 min；⑥弃上清，加入原始菌液1/50体积（800μ l/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化）并分装成100μ l）的20 mM CaCl2重悬菌体；⑦置液氮中10 s，放入-20℃冰箱中保存备用。

2.农杆菌的转化（冻融法）将感受态农杆菌置于冰上，加入1μg质粒DNA（体积不宜超过10 μ l），充分混匀，冰上放置30 min；②置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中，待其融化；③加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃，230 r/min 培养2-4 h；（或直接用1 mlμl，留500 μ l于管中④3000 r/min 离心2 min收集菌体，将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板）；⑤重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干, 28℃培养48 h；⑥挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中，28℃，250 r/min 培养48 h，将菌液用于保存或转化；注：EHA105抗利福平霉素，LBA4404抗硫酸链霉素。

在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素，以防止杂菌污染。

以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行。

3．转基因烟草体系的建立⑴烟草无菌苗的培养：①70%乙醇消毒烟草种子30 s后，用无菌水清洗两次，更换NaClO处理25-30 min，无菌水清洗四次；②将灭菌后的种子移至1/2 MS固体培养基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、1.0 mg/L 维生素、2.0 mg/L 苷氨酸、3% 蔗糖、0.6-0.7% 琼脂（KOH 调至pH 5.7-5.8），于25-26℃，14 h光照/10 h黑暗条件下萌发；③14天后，将萌发出的烟草幼苗转移至含有相同1/2 MS培养基的组织培养盒中，同样条件下继续培养4-6周，小苗长出后可用于叶盘转化。

实验五农杆菌感受态细胞的制备和质粒转化

感受态细胞制备的原理
• 感受态细胞制备的原理是细菌在低温和低渗氯化钠溶液中，菌细胞壁通透性增加。
实验原理
• 转化方法：电击法、 CaCl2、 NaCl等化学试剂法 • 感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。 • 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( TransfoKan培养基
影响转化率的因素
• • • • 细胞生长状态和密度。转化的质粒 DNA 的质量和浓度。试剂的质量。防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。
实验试剂
农杆菌LBA4404 YM培养基， 0.1mol/LNaCl溶液（预冷） 20mM CaCl2溶液（预冷）卡那霉素（50mg/ml）质粒DNA （上周日提取）
2.挑取单菌落接种到40ml YM液体培养基（硫酸链霉素，25mg/ml）中，28℃条件下，250rpm悬浮培养12-20小时。
3．在超净工作台上将菌液转入灭过菌的50ml离心管中，4℃ ，5000×rpm离心8min。 4．在超净工作台上弃上清，用100mM NaCl （4℃ 预冷）重悬农杆菌，4℃， 5000×rpm离心8min。 5．在超净工作台上弃上清，加入原始农杆菌菌液 1/50体积（800ml）的20mM CaCl2溶液重悬菌体，并分装成500ml/管。 6．将分装后的离心管置于液氮中10秒，-80℃保存。
农杆菌感受态细胞的制备
1.将农杆菌LBA4404（抗硫酸链霉素，25mg/ml）接种在YM平板上，26-28℃ 培养48小时。
YM培养基的配方：酵母提取物0.4g/L；甘露醇 10g/L；NaCl 0.1g/L；MgSO4 0.1g/L； K2HPO4 0.5g/L；琼脂粉 15g/L pH：7.2-7.4