农杆菌感受态制备转化

农杆菌感受态制备

1、划平板，单克隆培养

2、挑单克隆于5ML LB培养基中，摇到饱和（1-2day）

3、50m离心管中4500rpm，15min

4、50ml菌体用1ml氯化钙（预冷）悬浮，冰上操作

5、每100ul分装于冷冻管中，液氮速冻后，-70℃保存

农杆菌转化

1．50ul感受态+5ul质粒，放入液氮速冻2min

2．37℃热激5min

3. 加1mlLB，28℃培养3-4h

3. 8000rpm/min去上清，200ulLB悬浮，涂板吹干

农杆菌抗性：利福平+庆大霉素+载体抗性。（GV3101）

庆大霉素40mg/ml （0.4g/10ml）；利福平50mg/ml DMSO溶解

200ml LB + 200ul母液

农杆菌转植物

1.植物去顶三天后转化，转前一天交足水

2.摇菌OD600=1.2~1.6 （先小摇后，取200ul大摇200ml）

3.室温5000rpm，15min，弃上清，悬浮于等体积渗透培养基中（200ml/转化）

每1000ml渗透培养基：1/2 MS 2.42g；蔗糖50g；MES 0.5g；用1M KOH调PH到5.8/5.7，定容到1000ml，加10ul 1mg/ml6-BA，加200ul silwet l-7，混匀，将菌液悬浮，OD=0.8左右。不得低于0.7.

4.将菌液倒入大平皿中，植株浸泡20s盖上白盆，过夜后揭开正常培养