流式细胞术彩色图谱(学习版)2

和细胞因子检测试剂盒。这里所使用的检测仪器就是传统的流式细胞仪，为了使上样更为方便，BD公司开发了与流式细胞仪配套的自动上样系统，可以更方便的从微孔板中自动连续上样。从传统意义上讲，流式细胞术通过检测细胞表面或细胞内抗原，对细胞进行计数、分型或分选。流式细胞仪（FCM）仅能对类似细胞大小的颗粒物和荧光颜色进行分析，而对其他物质（如液相蛋白等）无能为力。而近年发展起来的CBA则是一种将待测物结合于类似细胞大小的颗粒上，并利用FCM进行蛋白定量的液相蛋白检测技术。

1、CBA的作用原理

图2-9-3 CBA反应微球探针复合体结构模式图

CBA由具有不同荧光强度、包被了特异性捕获单抗（Capture Antibody）的多个捕获微球（Capture Bead）群组成。CBA的每一微球提供一个针对某一特定蛋白的捕获表面，就如同ELISA板的各个包被孔。加入待测样本后，微球上的捕获抗体就与相应的液相蛋白结合，再加入荧光标记的检测单抗（Detection Antibody），形成‘三明治’夹心复合物（见图2-9-3），在流式细胞仪FL2通道检测荧光信号就能定量可溶性被检物。可同时检测多种液相

蛋白物质（见图2-9-4）

图2-9-4 CBA技术反应原理图

2、CBA技术与传统的ELISA相比有下列优点：

（1）CBA所需样本体积仅为ELISA分析所必需样本量的1/6；（2）CBA的灵敏度达到2-7pg/ml，而ELISA通常为20-100pg/ml；（3）CBA一致性和稳定性更好，符合细胞因子检测的国际标准（经美国NIBSC的gold标准测试）；（4）对标准品混合物做一次流式检测，就可得到样本中各种被分析物相应的标准曲线；（5）能避免由于酶联放大技术使信号失

真导致的假象；（6）CBA实验时间比单次ELISA大大缩短，而且能提供需要做6次ELISA 才能得到结果。

3、CBA的技术的操作（.以BD-Pharmingen公司的Th1/Th2为例）：Th1/Th2 CBA Kit包含了具有不同荧光强度的6个微球群，分别包被了针对IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α, IFN-γ的特异性捕获抗体。上述的捕获微球和PE标记的检测抗体混合后，与重组标准品或待测样本孵育形成三明治复合物。用FCM采集样本数据后，BD CBA分析软件就以图、表的形式产生分析结果（见图2-9-5和表2-9-1）。

图2-9-5 TH1/TH2细胞因子CBA检测结果

由于人TH1/TH2细胞因子CBA中的各种抗体经过优化及严格测试，因此与传统的ELISA 技术相比，无论是灵敏度、恢复度、稀释线性度，还是特异性和准确性都有了很大的提高。

CBA检测的灵敏度如下表。

表2-9-1 细胞因子的平均荧光强度、标准差和灵敏度分析

此外用人TH1/TH2细胞因子 CBA每次仅对一个重组细胞因子蛋白做分析，结果在其他捕获微球群未发现交叉反应和背景。这表明CBA检测具有极好的特异性。

第10节流式细胞术在其他相关指标中的应用

一、RNA含量样品的制备方法

派若宁Y（Pyronin Y，PY）荧光染色法：PY是一种硷性的荧光染料，它可与细胞浆、核仁中的RNA进行特异性结合。RNA的多核苷酸链多为单链结构，而呈现出红色荧光。是流式细胞术进行单参数定量RNA的一种极好的荧光染料，激发波长与488nm相匹配，它发射的波长为580nm。然而PY也可以与解链的DNA单链结合。因此，在用PY荧光染色RNA 时，要避免DNA解链效应的干扰。

1、试剂配制：

①PY试剂的配制：PY 1.0g，以100ml蒸馏水溶解，配成母液，置4℃冰箱保存。PY工作液：取1ml PY母液，加入1nol/L pH4.7的醋酸缓冲液100ml，稀释为0.01%的浓度。

② 1.0 mol/L pH4.7 醋酸缓冲液的配制：冰醋酸11.55ml加蒸馏水至1000ml；无水醋酸钠

16.4g加蒸馏水至1000ml；分别取上述两种液体255ml和245ml，再加入200ml蒸馏水即成。

③配制pH7.2 的磷酸缓冲液；

④ DNA酶消化液的制备：DNA酶0.05mg/ml，0.25mol/L枸橼酸，2.5mmol/L Tris-HCl,调pH为6.0。

2、染色程序：①制备单细胞悬液，浓度为1×106/ml；②加入DNA酶液0.5ml，37℃，消化20 min，弃去DNA酶；③加入0.01%的PY工作液1.0ml ，室温下染色30 min ,离心沉淀（800prm,5min）；④去染色液，以PBS液洗3 次，，再加入1.0 ml PBS，上机检测。

3、检测分析：用Cellquest软件程序获取20000个细胞，用ModiFit LT软件分析细胞RNA 含量。RNA含量用RNA指数（RNA Index，RI）表示。在RNA直方图上，RI=（被检测细胞峰荧光道数/正常细胞峰荧光道数）×10，所得的值则为RNA指数。RI为了与DI相区别，又以×10来表示。

二、蛋白质总量样品制备

测定细胞总蛋白量能够检测一个细胞群体生长和代谢的状态，也可区别具有不同蛋白质含量。恶性肿瘤时，肿瘤细胞的蛋白质总量往往增加。

1、检测原理：异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate,FITC）是检测细胞总蛋白量最常用的荧光探针。它是酸性染料，以共价键方式结合到蛋白的带正电核的基上；当以蓝色激光激发后，发出明亮的绿色继发荧光。绿色继发荧光的强度，与细胞的蛋白质含量成严格的正相关关系。

2、染色方法：：取20 mg 异硫氰基荧光素，加20ml 无水酒精，使FITC充分溶解，即为染色液的原液，保存于4℃冰箱待用。具体荧光染色步骤如下：①TITC贮存液的稀释：用pH 7.4的PBS 液稀释成50μg /ml 浓度的工作液，备用；②被染色细胞首先用70%酒精破膜，10imn ，使FITC染料能进入到细胞中；③用离心法以PBS液洗去破膜剂，离心收集细胞；④再取FITC工作液2ml 加入样品中，混匀，置4℃冰箱中反应30 min；⑤用PBS液以1500prm离心5min，洗去染色液，再离心去上清；⑥再加0.5 ml PBS，混匀，上机检测。

3、检测分析：用Cellquest软件程序获取20000个细胞，用ModiFit LT软件分析细胞总蛋白质含量。用蛋白质指数（protein Index，PI）表示。在蛋白质直方图上，PI=被检测细胞峰荧光道数/正常细胞峰荧光道数，所得的值。

三、网织红细胞样品的制备