流式细胞术彩色图谱(学习版)2

和细胞因子检测试剂盒。

这里所使用的检测仪器就是传统的流式细胞仪，为了使上样更为方便，BD公司开发了与流式细胞仪配套的自动上样系统，可以更方便的从微孔板中自动连续上样。

从传统意义上讲，流式细胞术通过检测细胞表面或细胞内抗原，对细胞进行计数、分型或分选。

流式细胞仪（FCM）仅能对类似细胞大小的颗粒物和荧光颜色进行分析，而对其他物质（如液相蛋白等）无能为力。

而近年发展起来的CBA则是一种将待测物结合于类似细胞大小的颗粒上，并利用FCM进行蛋白定量的液相蛋白检测技术。

1、CBA的作用原理
图2-9-3 CBA反应微球探针复合体结构模式图
CBA由具有不同荧光强度、包被了特异性捕获单抗（Capture Antibody）的多个捕获微球（Capture Bead）群组成。

CBA的每一微球提供一个针对某一特定蛋白的捕获表面，就如同ELISA板的各个包被孔。

加入待测样本后，微球上的捕获抗体就与相应的液相蛋白结合，再加入荧光标记的检测单抗（Detection Antibody），形成‘三明治’夹心复合物（见图2-9-3），在流式细胞仪FL2通道检测荧光信号就能定量可溶性被检物。

可同时检测多种液相
蛋白物质（见图2-9-4）
图2-9-4 CBA技术反应原理图
2、CBA技术与传统的ELISA相比有下列优点：
（1）CBA所需样本体积仅为ELISA分析所必需样本量的1/6；（2）CBA的灵敏度达到2-7pg/ml，而ELISA通常为20-100pg/ml；（3）CBA一致性和稳定性更好，符合细胞因子检测的国际标准（经美国NIBSC的gold标准测试）；（4）对标准品混合物做一次流式检测，就可得到样本中各种被分析物相应的标准曲线；（5）能避免由于酶联放大技术使信号失
真导致的假象；（6）CBA实验时间比单次ELISA大大缩短，而且能提供需要做6次ELISA 才能得到结果。

3、CBA的技术的操作（.以BD-Pharmingen公司的Th1/Th2为例）：Th1/Th2 CBA Kit包含了具有不同荧光强度的6个微球群，分别包被了针对IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α, IFN-γ的特异性捕获抗体。

上述的捕获微球和PE标记的检测抗体混合后，与重组标准品或待测样本孵育形成三明治复合物。

用FCM采集样本数据后，BD CBA分析软件就以图、表的形式产生分析结果（见图2-9-5和表2-9-1）。

图2-9-5 TH1/TH2细胞因子CBA检测结果
由于人TH1/TH2细胞因子CBA中的各种抗体经过优化及严格测试，因此与传统的ELISA 技术相比，无论是灵敏度、恢复度、稀释线性度，还是特异性和准确性都有了很大的提高。

CBA检测的灵敏度如下表。

表2-9-1 细胞因子的平均荧光强度、标准差和灵敏度分析
此外用人TH1/TH2细胞因子 CBA每次仅对一个重组细胞因子蛋白做分析，结果在其他捕获微球群未发现交叉反应和背景。

这表明CBA检测具有极好的特异性。

第10节流式细胞术在其他相关指标中的应用
一、RNA含量样品的制备方法
派若宁Y（Pyronin Y，PY）荧光染色法：PY是一种硷性的荧光染料，它可与细胞浆、核仁中的RNA进行特异性结合。

RNA的多核苷酸链多为单链结构，而呈现出红色荧光。

是流式细胞术进行单参数定量RNA的一种极好的荧光染料，激发波长与488nm相匹配，它发射的波长为580nm。

然而PY也可以与解链的DNA单链结合。

因此，在用PY荧光染色RNA 时，要避免DNA解链效应的干扰。

1、试剂配制：
①PY试剂的配制：PY 1.0g，以100ml蒸馏水溶解，配成母液，置4℃冰箱保存。

PY工作液：取1ml PY母液，加入1nol/L pH4.7的醋酸缓冲液100ml，稀释为0.01%的浓度。

② 1.0 mol/L pH4.7 醋酸缓冲液的配制：冰醋酸11.55ml加蒸馏水至1000ml；无水醋酸钠
16.4g加蒸馏水至1000ml；分别取上述两种液体255ml和245ml，再加入200ml蒸馏水即成。

③配制pH7.2 的磷酸缓冲液；
④ DNA酶消化液的制备：DNA酶0.05mg/ml，0.25mol/L枸橼酸，2.5mmol/L Tris-HCl,调pH为6.0。

2、染色程序：①制备单细胞悬液，浓度为1×106/ml；②加入DNA酶液0.5ml，37℃，消化20 min，弃去DNA酶；③加入0.01%的PY工作液1.0ml ，室温下染色30 min ,离心沉淀（800prm,5min）；④去染色液，以PBS液洗3 次，，再加入1.0 ml PBS，上机检测。

3、检测分析：用Cellquest软件程序获取20000个细胞，用ModiFit LT软件分析细胞RNA 含量。

RNA含量用RNA指数（RNA Index，RI）表示。

在RNA直方图上，RI=（被检测细胞峰荧光道数/正常细胞峰荧光道数）×10，所得的值则为RNA指数。

RI为了与DI相区别，又以×10来表示。

二、蛋白质总量样品制备
测定细胞总蛋白量能够检测一个细胞群体生长和代谢的状态，也可区别具有不同蛋白质含量。

恶性肿瘤时，肿瘤细胞的蛋白质总量往往增加。

1、检测原理：异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate,FITC）是检测细胞总蛋白量最常用的荧光探针。

它是酸性染料，以共价键方式结合到蛋白的带正电核的基上；当以蓝色激光激发后，发出明亮的绿色继发荧光。

绿色继发荧光的强度，与细胞的蛋白质含量成严格的正相关关系。

2、染色方法：：取20 mg 异硫氰基荧光素，加20ml 无水酒精，使FITC充分溶解，即为染色液的原液，保存于4℃冰箱待用。

具体荧光染色步骤如下：①TITC贮存液的稀释：用pH 7.4的PBS 液稀释成50μg /ml 浓度的工作液，备用；②被染色细胞首先用70%酒精破膜，10imn ，使FITC染料能进入到细胞中；③用离心法以PBS液洗去破膜剂，离心收集细胞；④再取FITC工作液2ml 加入样品中，混匀，置4℃冰箱中反应30 min；⑤用PBS液以1500prm离心5min，洗去染色液，再离心去上清；⑥再加0.5 ml PBS，混匀，上机检测。

3、检测分析：用Cellquest软件程序获取20000个细胞，用ModiFit LT软件分析细胞总蛋白质含量。

用蛋白质指数（protein Index，PI）表示。

在蛋白质直方图上，PI=被检测细胞峰荧光道数/正常细胞峰荧光道数，所得的值。

三、网织红细胞样品的制备
1、染色原理
网织红细胞是一种未完全成熟红细胞。

在细胞成熟过程中，其胞浆中的RNA含量逐渐被血红蛋白所取代，因此，检测红细胞中RNA的含量多少，就代表了红细胞的成熟程度。

从而成为检测网织红细胞的重要方法。

网织红细胞计数可以判断骨髓红细胞系统造血情况。

溶血性贫血时由于大量网织红细胞进入血循环，可使网织红细胞高达0.20或更高。

急性失血后5-10天，网织红细胞达高峰。

2周后恢复正常。

典型再生障碍性贫血病例。

网织红细胞百分比常0.005。

网织红细胞数低于5×109/L为诊断再生障碍性贫血的标准之一。

网织红细胞升高：表示骨髓红细胞增生活跃，多见于各种急慢性失血、溶血和治疗有效的各类增生性贫血，如缺铁性贫血、溶血性贫血、巨幼细胞性贫血等等，是贫血治疗中非常有价值的监测指标。

网织红细胞减低：见于各种骨髓增生能力低下的疾病，尤多见于重型再生障碍性贫血等。

2、样品制备
（1）抽取全血0.5ml，注入盛有0.5ml的0.1mol/L EDTA溶液中；
（2） 用微量取液器取50μlEDTA抗凝血，置于另一离心管中，加入Good¹s缓冲液5.0ml,离沉淀1000 rpm,5min，连续洗3次；
（3） 将沉淀细胞加入1.0ml枸椽酸钠缓冲液，轻轻振荡悬浮；
（4） 将悬浮液缓慢注入盛有4ml 0.1%戊二醛缓冲液中固定15min；
（5） 上FCM之前，用PBS洗去固定剂，加入0.5ml 0.01%的派若宁工作液；染色30min 离心沉淀去染液，1500 rpm,5 min；
（6） 用PBS洗一次，离心1500 rpm，5min，去上清，再用PBS将细胞悬浮，上机检测。

3、检测和分析
运用对数放大的前向与侧向散射光信号来区分红细胞与血小板。

要采集足够数量的细胞进行分析，一般网织红细胞低于总红细胞的0.5%,最少要采集50000个颗粒进行分析以减小CV值。

建立FSC vs SSC 双参数直方图，运用对数放大后可设门圈定红细胞。

对于检测样本或对照，在单参数直方图中分析红细胞门中细胞。

注意在分析直方图上，主要细胞群体可能会偏移，这可能是由于成熟红细胞过度染色造成的。

检查强荧光表达区域并去除这些强阳性颗粒，这些颗粒是标本中的有核红细胞着色后形成的。

在成熟红细胞与有核红细胞之间设立适当的线性“门”（高于成熟红细胞低于有核红细胞）统计网织红细胞的比例。

如有必要，设立不同的线性“门”来统计不同成熟度的网织红细胞的百分比。

根据荧光强度，还可将网织红细胞分成低荧光强度网织红细胞（Low Fluorescent Reticulocyte简称LFR）、中荧光强度网织红细胞（Middle FluorescentReticulocyte简称MFR）和高荧光强度网织红细胞（High Fluorescent Reticu1ocyte简称 HFR）部分。

幼稚的网红显示最强的荧光，反之成熟红细胞极少或没有荧光。

4、临床典型应用
（1）骨髓移植(BMT)：评估BMT后的红细胞生成情况，HFR计数提供了早期测量依据，同时也比监测单核细胞水平更为精确和实际。

（2）贫血：可将网织红细计数及其分类作为鉴别诊断的初筛指标。

（3）海洋性贫血：地贫以无效造血和红细胞寿命缩短为特点，网织红细胞计数与HGB 水平变化相反，轻度贫血或非贫血病人，网织红细胞增长可能非常细微以至手工计数察觉不到，而使用精确的自动计数技术明显多了。

（4）骨髓增生异常综合征（MDS）
一般说来，MFR在HFR之前进入循环，暗示红细胞生成规律性恢复的开始。

L.Kuse
认为：少量 MFR可以作为MDS化疗后粒系恢复的早期指标，且比RET绝对值更敏感。

（5）放疗与化疗：通过流式法网织红细胞分析可获得骨髓增生特别是红系增生及放、化疗的细胞毒副作用的信息在造血反应中（如叶酸和VitB12）治疗后或化疗后造血恢复中可见网织红细胞短暂迅速的增高。

当HGB下降、组织氧化受阻时，EPO生成增多，EPO促使干细胞向原始红细胞分化，也加速网织红细胞释放。

因此，EPO增加，HFR也增多，并伴有网织红细胞的增多。

化疗后骨髓EPO功能恢复早期HPR增多比网织红细胞总数恢复早，这种反应时间的不同体现了EPO与HFR之间的密切关系。

末梢血网织红计数优于白细胞计数和血小板计数分析骨髓造血状态。

（6）抗贫血药疗效观察：网织红细胞可作为疗效观察指标。

凡是骨髓增生功能良好的病人，在给予有关抗贫血药物后，其网织红细胞在1周左右可百家高峰，贫血严重，网织红细胞数升得越高，而且其升高往往在红细胞恢复之前。

贫血病有在抗贫血治疗过程中，如果网织红细胞不见升高，说明该种治疗无效或骨髓造血功能障碍。

因此网织红细胞计数是对贫血病人经常随访检查的项目之一。

如缺铁性贫血铁剂治疗有效时，网织红细胞明显增多，随后红细胞及血红蛋白逐渐增高，网织红细胞下降，这种网织红细胞反应，可被作为抗贫血治疗的疗效判断。

四、外周血CD4+细胞CD45RA/CD45RO的表达
CD45RO、CD45RA是白细胞共同抗原CD45的两类亚型，由CD45肽链胞外区氨基端的三个外显子发生旁路剪接而导致。

缺乏三种外显子的同型称为CD45RO，仅表达外显子A的同型称为CD45RA。

T细胞表达不同的CD45亚型与其功能差异有一定的关系，通常CD45RO阳性T细胞为记忆T细胞（memory T 细胞），CD45-RA阳性为童贞T细胞（naïve T 细胞）。

1、生物学特性：
① 胸腺内细胞：CD45RA-CD45RO- → RA-RO+ → RA+RO-（脐血T细胞占90%）。

胸腺中淋巴细胞成熟进入血液循环的为CD45RA+（ naïve T 细胞）。

②在外周血中，CD4+CD45RA+T细胞接触抗原刺激后可转变为CD4+CD45RO+ T细胞。

③ CD45RA+和CD45RO+两类T细胞分泌淋巴细胞因子的能力不同。

抗原刺激后，CD45RA+细胞以增殖为主，CD45RO+细胞以发挥效应为主。

2、临床意义：
① 骨髓移植：骨髓移植病人中CD45RA、CD45RO的不平衡可持续4～10年。

CD34+分选造血干细胞移植与未分选干细胞移植的受体比较，前者外周血T、B细胞恢复延迟。

移植后最先两个月，两组病人循环的T细胞主要是CD45RO+细胞。

前组移植后2～3月，CD45RA+细胞逐渐增高。

表明成熟的CD34+造血干细胞产生的是NaiveT细胞。

② SLE：临床症状出现后短期内多数T细胞表达CD45RA为静止T细胞或者已接触抗原的CD45RO弱阳性的早期T细胞。

然而，随着疾病活动期的延长，CD45RO强阳性T细胞开始增加。

在活动期SLE病人中，静止T细胞扩增在疾病中的作用胜于记忆T细胞的反应。

③ 葡萄膜炎：患者房水中CD4+淋巴细胞百分比明显较外周血高，而Naïve T细胞的百分比显著低于外周血，记忆T细胞高于外周血。

房水中Fas抗原主要表达在记忆细胞上。

Fas+记忆T 细胞可能涉及到葡萄膜炎的致病机理。

④ ITP：急性特发性血小板减少性紫癜（ITP）患儿比慢性ITP患儿和对照组有更高的CD45RA和更低的CD45RO，但是这些差异也可能与年龄有关。

⑤ CD45RA、CD45RO随年龄的变化：老年人组CD4+T细胞表达CD45RO超过CD45RA，而在年轻组中正相反。

五、外周血CD4+细胞CD40/CD40L的表达
CD40-CD40L通路是继CD28-CD80/86之后受到重视的又一共刺激分子通路。

CD40-CD40L 通路在体液免疫中具有重要作用，CD40-CD40L间的相互作用促进了B淋巴细胞增殖，是产生免疫球蛋白所必须的。

CD40广泛分布于体内各种细胞，主要表达于B淋巴细胞，CD40L
主要表达于活化的T淋巴细胞上。

1、生物学特性：
① 共刺激因子，传递第二信号。

② 延长APC寿命，其机制是通过CD40L通路抑制自发 或活化诱导的细胞死亡（AICD），
体外培养也发现，CD40信号能增强单核细胞和DC细胞的生存能力；
③ 分泌诸如：IL-12，IL-1，TNF-α，IL-6，IL-8等细胞因子；
④ 增强单核细胞对肿瘤的杀伤活性；
⑤ NO合成。

2、临床意义：
SLE： 正常情况下，CD40L仅暂时性的表达于激活的T淋巴细胞表面，而CD40L的持久表达可使活化的自身反应性淋巴细胞免于调亡，从而导致自身免疫性疾病的发生。

SLE患者血清中存在可溶性CD40L，其滴度明显高于对照组和正常人群，且与疾病严重程度相关，肾炎，高蛋白血症，有中枢神经系统受累者有更高sCD40L滴度。

六、Th1细胞和Th2细胞的检测
1、基本概念：
Th细胞：辅助性T 细胞，根据分泌细胞因子能力大小，又分为Th1和Th2。

Th1细胞和Th2细胞所分泌的细胞因子及与抗原递呈细胞的相互作用关系见图2-10-1、2-10-2、2-10-3。

Th1细胞： 辅助细胞免疫，并介导迟发型超敏反应。

分类标准：分泌细胞因子IFNγ（标志性细胞因子）、TNFβ、IL-2；
其它标记：CD3、CD2、TCR、CD4（通常）、LAG-3；
细胞功能：活化Ⅰ型免疫效应，细胞毒性T细胞、巨噬细胞、NK和K细胞、嗜中性
粒细胞
图2-10-1 Th1细胞与抗原提呈细胞的关系
Th2细胞： 辅助B细胞产生抗体,主要介导体液免疫。

分类标准：分泌细胞因子IL-4（标志性细胞因子）、IL-2、IL-10；
其它标记：CD3、CD2、TCR、CD4（通常）、LAG-3；
细胞功能：活化Ⅱ型免疫效应，B细胞（IgG1、IgE、IgA）、嗜酸性粒细胞、柱
状细胞、肥大细胞
图2-10-2 Th2细胞与抗原提呈细胞的关系
图2-10-3 Th1和Th2 细胞与Th0\APC的相互关系
2、检测原理
活化：未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞术很难检测出来，因此在检测前需剌激活化。

活化剌激素为PMA（佛波脂）+Ionomycin。

抑制分泌：淋巴细胞在剌激素的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。

因为流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阴止细胞因子的分泌。

确定CD4+细胞：Th1/Th2细胞的先决条件是CD4+T细胞，因此存在着用CD4凤定细胞群的问题。

我们知道，CD4不仅在T细胞表面上表达，而且还在所有单核细胞表面上表达。

因此，单独用CD4设门无法将CD4T细胞区分开来。

实践证明也不能用CD3/CD4双参数设门，因为佛波脂作用下CD4抗原表达迅速下调。

只能用CD3/CD8设门，因为CD8不受佛
波脂的影响；而且绝大多数CD3+/CD8-细胞都是CD3+/CD4+细胞。

所以可用CD3+/C左细胞群来确定CD4+T细胞群。

3、检测试剂：(问陈军浩)
PMA：贮存液：PMA溶于DMSO，浓度为0.1mg/ml,-20℃保存；工作液贮存液1：100稀释于RPMI 1640或PBS（无菌，无NaN3）中,此时为1μg/ml；工作浓度为25ng/ml，（取25μg/ml）。

Ionomycin：贮存液：Ionomycin溶于DMSO，浓度为1mg/ml,-20℃保存；工作液：贮存液1：20稀释于RPMI 1640或PBS（无菌，无NaN3）中，此时为50μg/ml；工作浓度为1μg/ml,（取20μg/ml）。

Monensin：贮存液：Monensin溶于甲醇，浓度为50mg/ml,为加速成溶解，可置于40-43℃水浴。

4℃只少保存4个月；工作液：贮存液1：50稀释于RPMI 1640或PBS（无菌，无NaN3）中，此时为1mg/ml；工作浓度为1.7μg/ml（取17μl/ml）。

RPMI 1640：RPMI 1640含10%FCS（胎牛血清），2mM glutamin,50μg/ml 青霉素，50μg/mlsteptomycin 和100μg/ml neomycin。

抗体：细胞表面标志抗体：CD3-PC5(PerCP),CD8-FITC
细胞内因子抗体：IL-4-PE，IFN-γ-PE。

破膜剂：可用品牌：美国Caltag公司的Fix&Perm破膜剂；美国BD公司的FACS破膜剂。

法国Immunotech公司的IntraPrep破膜剂。

4、检测步骤：
（1）肝素抗凝采血；
（2）取两只试管，分别作茧自缚为阴性对照管（A管）和测定管（B管），于两只试管中均加入100μl血液和100μl PRPIM 1640。

（3）A管中加和：3.4μl 1mg/ml的Monensin工作液；B管中加入：5μl 1μg/ml的PMA 工作液+4μl 50μg/ml Ionomycin工作液+3.4μl 1 mg/ml Monensin工作液。

（4） 37℃，5% CO2培养箱培养4-6h；
（5）混匀，取出100μl，加入适量CD3-PC5（PerCP），CD8-FITC，孵育一段时间，（参阅抗体说明书）；
（6）不着破膜剂固定和破膜；
（7）加入适量IL-4-PE，IFN-γ-PE，孵育一段时间，（参阅抗体说明书）；
（8） PBS洗一次，去上清；适量PBS重悬细胞沉淀，上机检测。

注意：细胞表面和细胞内抗原同时检测时，应先标记细胞表面抗菌素原，破膜后再标记细胞内抗原。

Caltag公司的破膜剂不同于其它公司，其破膜与抗体标记同时进行，大缩短了操作时间。

5、结果分析
（1）用CD4设门，选定淋巴细胞；
（2）用CD8分别和IFN-γ建立双参数直方图对第1步所确定的淋巴细胞进行分析；（3）得出CD8-/IL-4+（Th2）和CD8-/IFN-γ+（Th2）细胞百分含量。

七、外周血白细胞HLA-B27的表达
HLA-B27抗原是人类主要组织相容性复合体（MHC）的表达产物，属Ⅰ型MHC基因。

在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫反应。

单核细胞、粒细胞、淋巴细胞表
面均可检测到含量不等的HLA-B27抗原，以单核细胞表面含量最为丰富。

HLA-B27抗原与共刺激分子B7（CD80、CD86）有类似的组成结构，因而， HLA-B27抗原的单克隆抗体常与B7分子交叉反应。

国外于1987年首次报告了用流式细胞术检测HLA-B27的表达，随后，开始应用流式细胞术从细胞水平研究HLA-B27的表达状况，并作为相关疾病筛选的指标，迄今为止检索表明共有相关文献81篇。

国内最早的综述文献发表于1994年，致病机理研究发表于1998年（PCR方法），使用流式细胞术检测HLA-B27表达文献发表于2000年。

1、HLA-B27在强直性脊柱炎（ankylosing spondylistis，AS）中的诊断价值
（1）敏感性及特异性对于一个随机选择的患者来说，以HLA-B27实验发现AS的诊断价值可以通过实验的敏感性来获得，敏感性的定义是患者中阳性结果的比率，AS病人为90%~95%（白种人）。

特异性的定义是健康个体中阴性结果的比率。

当人群AS发病为0.1%时，人群HLA-B27出现频率为10%，敏感性为95%,HLA-B27的特异性为90.1%;如果人群AS发病率升至1%时，则特异性为90.8%。

（2） HLA-B27实验阳性的预示价值预示价值系指HLA-B27阳性患者占HLA-B27阳性人群的比率，如果人群HLA-B27出现频率为10%，发病率分别为0.1%和1%，则预示价值分别为0.95%和9.5%。

这些数字与流行病学调查发现恰好吻合，后者算出1%~6%HLA-B27阳性者患AS。

（3） HLA-B27实验阴性的预示价值指的是HLA-B27阴性健康者所占比率，可以通过计数得出，HLA-B27阴性者未患AS约为99.9%。

从上述数据资料可以看出，尽管HLA-B27实验具有高度敏感性的特异性，但不可用于论断随机选择的患者是否患有AS，阳性结果的预示价值在0.95~9.5%，提示绝大多数的HLA-B27阳性者并未患AS。

因此HLA-B27不能作为随机选择人群的AS筛选指标。

但不患AS者的阴性结果预示价值非常高，因为AS患者HLA-B27阴性机会是非常少的，这样HLA-B27实验在处理随机选择患者的临床实践中具某此价值，阴性结果可被看做诊断AS的排除标准。

但是，这是不现实的，因为不可能的随机选择人群中作HLA-B27实验，只有临床上怀疑其患有血清学阴性脊椎关节病变时才作这个实验。

因此，对于那些具有提示血清学阴性脊柱关节病的症状及体症的病例，本实验具有潜在的使用价值。

流行病学调查发现HLA-B27阳性伴背痛及强直，AS的发病率为22.5%，这个数字与随机选择的B27阳性者的AS发病变幻无常为1%~6%相差悬殊，因此选择背痛及强直者进行实验提高了发现AS的可能性。

有些研究者指出，AS可表现为炎性背痛的临床症状，但没有AS的典型影像特征。

在家族调查中，这个临床特征与HLA-B27有显著联系，发现13%~18% B27阳性的一级亲属，有炎性临床特征而不伴随影像学改变。

（4）青少年性关节炎HLA-B27的意义与成人的AS不同，青少年AS在发病初期引起骨骼病变的症状出现较少，可能有24%的儿童主诉腰椎痛或强直。

但是发病初期末梢关节病变表现明显，青少年AS与HLA-B27的关系与成年人AS的一样，对于已确诊的青少年慢性关节炎患者，HLA-B27实验阳性对于提醒医生诊断即将发生的AS起辅助作用。

但是，本实验与诊断成人AS一样具有相同的局限性，不可以作为诊断标准。

由于HLA-B27以共显性方式遗传，故一级亲属HLA-B27出现率因是否为纯合体及配偶HLA状态不同而表现为25%~100%。

AS先证者的一级亲属AS出现率预计为1.3%~11%。

AS的诊断依据为背部疼痛或强直并出殃有影像学的骶髂关节炎。

这类病例即使HLA-B27阴性也不能改变诊断，AS伴HLA-B27阴性的患者提醒医生有同时发生牛皮癣及炎症性小肠病变的可能。

当然，亦有HLA-B27阴性不伴发皮肤及肠道病变的纯AS病例。

HLA-B27是脊柱关节病病因及发病机制的关键，这一观点已被广泛认同。

但是必须清楚，只有少数HLA-B27阳性者患病。

目前AS的诊断仍主要依靠临床检查，X线片示双侧骶髂
关节炎和脊柱则是最重要的诊断依据。

虽然HLA-B27实验应用有限，既不能用于疾病确诊，也不能预见患者的预后，但它以下几个方面将有助于诊断：BD公司生产的B27检测试剂使用方便可靠。

试剂盒由FITC标记标准微球一瓶、B27FITC/CD3PE双标试剂1瓶和BD溶血剂1瓶组成。

2、 实验方法
① 取荧光素PE标记的CD3单抗及FITC标记的HLA-B27单抗30 ul、EDTAK2抗凝的全血50 ul混匀后室温染色15min(或20min)；
② 加溶血剂 2 ml溶解红细胞(10min)；
③ 1500rpm离心洗涤除去细胞碎片，加1%多聚甲醛固定(15min)；
④上机测定。

在测完标准微球并调节好FL1电压后，不可改变FL1的设置。

通过CD3PE vs SSC设门圈定CD3阳性细胞（T淋巴细胞），检测其B27的平均荧光强度。

如标本荧光强度小于标准微球荧光强度则为阴性，相反为阳性。

⑤流式细胞仪检测、发出实验报告。

(10min)。

图2-10-2 HLA-B27细胞表达的检测原理
3、 临床意义
① 强直性脊椎炎患者中90%以上HLA-B27阳性，正常人群中只有5%～10%阳性。

而强直性脊椎炎由于其临床症状与许多疾病相似而难以确诊，特别在疾病早期。

② Reiter`s综合症患者中HLA-B27阳性率70%～90%。

③ 银屑病性关节炎患者中HLA-B27阳性率50%～60%。

④ 葡萄膜炎患者中HLA-B27阳性率40%～50%。

八、PNH的流式细胞术分析：
阵发性睡眠性血红蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）是一种获得性造血干细胞异常，临床主要表现为骨髓丧失造血功能、血栓、慢性溶血性贫血急性发作。

PNH 的发病率很低，发病原因不详，可能与再生障碍性贫血有关系。

PNH的临床表现不一，疾病进程多变，给临床的诊断治疗和疾病研究带来很多困难。

最近15年，在PNH的细胞和分子生物学研究中取得了重要进展，定义了导致PNH异常表现的分子缺陷。

而使用流式细胞仪进行PNH诊断分型，是PNH研究的又一里程碑。

使用单克隆抗体和流式细胞仪技术则是发现诊
断PNH表型异常的重要手段。

使用流式细胞仪可以发现Ham实验阴性的再生障碍性贫血病人中存在的少量PNH细胞，这可以将PNH分为两种情况：（1）溶血性PNH，特征是显性溶血性贫血，同时有血红蛋白尿。

值得注意的是，这组病人中，有50%发生静脉血栓，这是导致病人死亡的主要原因。

（2）再生不良性PNH，可以检出GPI缺乏的造血细胞，没有显性溶血，但可能有其它症状，如再生障碍性贫血、白细胞减少症或血小板减少症。

1、检测方法：通过应用CD45、CD61、CD64等单抗分别设定血小板、淋巴、单核、粒、红细
胞III区、II区及I区细胞的位置（见图）。

（1）阴性对照管：CD55/CD59相应同型对照
取3µl全血，加入CD45+CD61FITC /IgG1PE / CD64TC 和CD45+CD61FITC /IgG2a PE / CD64TC
（2）阳性对照管
取正常人外周血3µl加入CD45+CD61FITC /CD55PE / CD64TC, CD45+CD61FITC /CD59PE / CD64TC
（3）病人检测管
直接将病人外周血3µl用CD45+CD61FITC /IgG1PE / CD64TC ，CD45+CD61FITC /IgG2a PE / CD64TC染色测定各细胞群体CD55，CD59的表达情况。

图2-10-3 通过CD61、CD45和CD64识别血小板、红细胞、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞
2、结果分析：见图2-2-4及2-2-5。