DNA测序标准实验流程(V1.3版)

DNA测序标准实验流程（V1.2版）1．对DNA的要求

纯度：OD

260 / OD

280

= 1.6 ~ 2.0，

PCR产物用量：每反应15 -20ng（片段大于3KB可加两倍DNA）。

质粒DNA用量：每反应20 -25ng（插入片段大于3KB质粒要加两倍DNA）。

1300载体本身序列就比较长，我们建议每反应加50-80ng。

每个小组一次配100份BD MIX(BD 0.4ul,5*buffer 1.8ul,water 2.8ul)长期保存，每个反应体系加5ul

2．P CR产物的测序PCR反应（测序PCR反应中只要加一个引物就可以，需要加热盖）

标准反应体系： 10ul体系

试剂用量

纯化的P CR产物(15-20 ng / μL) 1 μL （片段大于3KB可加两倍DNA）

引物(2 pmol / μL) 1 μL

BigDye (2.5 x) 0.4 μL

BigDye Seq Buffer (5 x) 1.8μL

灭菌去离子水 5.8μL

96 °C 1 min → (96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 2 min) x 25个循环→ 4 °C保温

质粒DNA的测序PCR反应

标准反应体系： 10ul体系

试剂用量

质粒DNA (20-25 ng / μL) 1 μL （插入片段大于3KB质粒要加两倍DNA）

引物(2 pmol / μL) 1 μL

BigDye (2.5 x) 0.4 μL

BigDye Seq Buffer (5 x) 1.8 μL

灭菌去离子水 5.8 μL

96 °C 1 min → (96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 2 min) x 25个循环→ 4 °C保温

注意：BigDye (2.5 x)是一种含有DNA聚合酶和荧光物质的混合物，非常昂贵，平时都放在-20度保存。加之前拿出来放在冰上融化，用完马上放回-20冰箱。BigDye (2.5 x)和BigDye Seq Buffer (5 x)可以混合后一起加到反应体系，有多的话可以放在-20冰箱，下次还能使用。

BIGDYE尽量避光，一般用铝珀纸遮盖。P CR样品处理过程中如在室温放置和酒精挥发阶段都尽量用铝珀纸遮盖或者放入抽屉，有利于样品的稳定性。

3．测序产物纯化

单个0.2 mL离心管离心方法：

1. 每孔加入1μL 7.5M NH3Ac，26μL 100%酒精，盖好，震荡4次。（酒精和NH3Ac先混合好，而且要比样品数多预算几个）

2. 台式离心机12000 x g 4°C离心20 min，马上用枪吸尽上清液。(DNA很微量，基本看不到，所以枪头不要碰到DNA沉积处)

3. 每孔加入100μL 75% 酒精，12000 x g 4°C离心10 min，马上用枪吸尽上清液。（如果不是马上操作，DNA沉淀很可能

浮起，被吸走，所以如果没有及时吸去上清的话，要重新离心5MINS。）

4. 让酒精在室温避光（抽屉）挥发干净(至少20mins)，加入10 μL Hi-Di Formamide溶解DNA。

5. 在PCR仪上变性：95 °C 4 min，4 °C 4 min。上机测序。

96孔板整板离心方法：

1. 每孔加入1μL 7.5M NH3Ac，26μL 100%酒精，盖好，震荡4次。（酒精和NH3Ac先混合好，而且要比样品数多预算几个）

2. 板式离心机4000 x rpm 4°C离心30min；马上倒置96孔板，弃上清，倒置在洗水纸上，离心500rpm，1mins。

3. 加100μL 75% 酒精，4000 rpm 4°C离心20 min；马上倒置96孔板，弃上清，离心500rpm,1mins。

4.让酒精在室温避光（抽屉）挥发干净（至少15mins），加入10 μL Hi-Di For mamide溶解DNA。

5. 在PCR仪上变性：95 °C 4 min，4 °C 4 min。上机测序。

4. 部分相关试剂

酒精：100%酒精使用国产分析纯；75%酒精用去离子水配制。

BigDye (2.5 x) -20度保存

BigDye Seq Buffer (5 x) 4度保存

7.5M NH3Ac 4度保存

Hi-Di For mamide -20度保存

黄方亮

2009.10.27日整理