SDS-PAGE凝胶的有效分离范围
SDS-PAGE分析
百泰派克生物科技
SDS-PAGE分析
SDS-PAGE（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳是Ulrich K. Laemmli开发的一种不连续电泳
系统，常用于分离和鉴定分子量在250 kDa之内的蛋白质混合物。
十二烷基硫酸钠（SDS，也称为十二烷基硫酸钠）和聚丙烯酰胺凝胶的联合使用可以消除结构和电
荷的影响，使蛋白质仅根据其分子量的差异进行分离，常用于复杂蛋白质混合物的高分辨率分离实验。
SDS-PAGE又称1D SDS-PAGE（一维凝胶电泳），根据蛋白质的相对分子量大小实现
蛋白质的分离，与高分子量蛋白质相比，较低分子量的分子在凝胶中迁移得更快。
因此，电泳结束后高分子质量的蛋白质仍然靠近点样孔。
在1D SDS-PAGE的基础上发展起来的2D SDS-PAGE（二维凝胶电泳）根据蛋白质的等电点和分子质量两个属
性对其进行分离，在2D凝胶电泳中，蛋白质先在固定pH梯度上进行第一维分离，再使用垂直或水平聚丙烯酰胺凝胶电泳进行二维分离，这种分离方法大大提高了蛋白质的分辨率。
SDS-PAGE已广泛应用于蛋白质样品纯度的评估、蛋白质表达的评估、蛋白质的免疫化学鉴定以及定量鉴定等。
百泰派克生物科技使用Bio-Rad Mini-PROTEAN® Tetra凝胶系统，提供基于1D和
2D的 SDS-PAGE分析服务技术包裹，用于多种蛋白质组学分析，包括蛋白质分子量测定、蛋白质鉴定、样品纯度分析、二硫键鉴定以及蛋白质定量等，欢迎免费咨询。
SDS-PAGE电泳常见问题
SDS-PAGE电泳问题总结蛋白质条带为什么走到下面逐渐变宽发散？回答:多数情况是因为小分子在胶里的运动不规律，这种情况常发生在高浓度胶或凝固不一致的胶里，你可以加大阴极的缓冲液浓度，可能会有点改善胶凝的快慢不在于TEMED多少，在于APS的量，APS提供自由基，TEMED帮助自由基作用，是催化剂，对凝固速度影响不是太大，可以试试加大APS的量丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的分辨范围15 ％ 15～45 kDa12.5％ 15～60 kDa10 ％ 18～75 kDa7.5％ 30～120kDa5 ％ 60～212kDa来源于《蛋白质技术手册》汪家政每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质，而是指在这个区间内，蛋白质迁移率基本和分子量成正比，也就是线性关系，为了数据的可靠性，大家尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。
下层也就是阳极缓冲液的作用当然是导电，用普通TRIS缓冲液做阳极缓冲液，一样跑得好，阴极就不一样了，需要提供离子强度和SDS环境，而在电泳过程中，阴极缓冲液的一些离子损失，而且与样品接触，不适合再次使用<br />至于有些时候跑太大浓度的胶，因为药品，BUFFER配制过程的一些问题，导致会出现蛋白带无法电泳到分离胶的最下方，胶跑得难看情况比较多，一般来说，15%的胶已经能够跑出大约15KDa左右的蛋白，对于普通SDS-PAGE已经几乎到了极限，还跑不出来的MARK带，就不必去追究商品的问题了SDS-PAGE胶的凝结速度受温度影响很大，随着温度的升高，凝结速度越来越快，温度降低则反之。
所以，夏天时胶凝结的比较快，而冬天脚的凝结速度则变慢，甚至不能凝结，解决此类问题较可行的方法是：冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED的使用量，可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。
做SDS-PAGE的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽，方便后面的比较，特别是WB。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量
02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应 的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶 的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂， 加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其 带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术， 如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结 合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
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白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分 子量的标准蛋白，可以大致测定出待 测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成 反比，因此可以通过计算待测蛋白与 标准蛋白的相对迁移率来推算其分子 量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基 本结构。
移液器
精确添加试剂和溶 液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。 准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。
SDS-PAGE常见问题
蛋白质条带为什么走到下面逐渐变宽发散？回答:多数情况是因为小分子在胶里的运动不规律，这种情况常发生在高浓度胶或凝固不一致的胶里，你可以加大阴极的缓冲液浓度，可能会有点改善胶凝的快慢不在于TEMED多少，在于APS的量，APS提供自由基，TEMED帮助自由基作用，是催化剂，对凝固速度影响不是太大，可以试试加大APS的量丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的分辨范围15 ％ 15～45 kDa12.5％ 15～60 kDa10 ％ 18～75 kDa7.5％ 30～120kDa5 ％ 60～212kDa来源于《蛋白质技术手册》汪家政每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质，而是指在这个区间内，蛋白质迁移率基本和分子量成正比，也就是线性关系，为了数据的可靠性，大家尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。
下层也就是阳极缓冲液的作用当然是导电，用普通TRIS缓冲液做阳极缓冲液，一样跑得好，阴极就不一样了，需要提供离子强度和SDS环境，而在电泳过程中，阴极缓冲液的一些离子损失，而且与样品接触，不适合再次使用<br />至于有些时候跑太大浓度的胶，因为药品，BUFFER配制过程的一些问题，导致会出现蛋白带无法电泳到分离胶的最下方，胶跑得难看情况比较多，一般来说，15%的胶已经能够跑出大约15KDa左右的蛋白，对于普通SDS-PAGE已经几乎到了极限，还跑不出来的MARK带，就不必去追究商品的问题了SDS-PAGE胶的凝结速度受温度影响很大，随着温度的升高，凝结速度越来越快，温度降低则反之。
所以，夏天时胶凝结的比较快，而冬天脚的凝结速度则变慢，甚至不能凝结，解决此类问题较可行的方法是：冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED的使用量，可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。
做SDS-PAGE的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽，方便后面的比较，特别是WB。
SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)原理
甘氨酸
最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein(1964) 和 Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲 液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。系统中所有组 分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。样品和浓缩胶中的氯离子形 成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两 边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质 前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高， 有利于甘氨酸的离子化， 所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳 动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的 区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。
Ø 加入加速剂TEMED后聚合马上开始，应立即将凝胶混匀，迅速灌胶。
保存条件： 4℃保存。
注意事项：
Ø 易燃，有腐蚀性，请注意防护。
Ø为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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过硫酸铵 分子式: (NH4)2S2O8 分子量: 228.20
性状：过硫酸铵是一种白色、无味晶体，常作强氧化剂使用，也可用作单体聚合引发 剂。它几乎不吸潮，由于能达到很高的纯度而具有特别好的稳定性，便于储存。另外， 它还具有使用方便、安全等优点。 储存及使用注意事项：
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浓缩效应：凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离 胶。浓缩胶为大孔胶，缓冲液pH6.7，分离胶为小孔胶，缓冲液pH8.9。 在上下电泳槽内充以Tris—甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便形成了凝胶孔 径和缓冲液pH值的不连续性。在浓缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只 有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左 右，在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3 种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-＞蛋白质＞ H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而H2NCH2COO- 称为慢离子。电 泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。 电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压 梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间 形成—个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好 介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成— 条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。
蛋白印迹
蛋白印迹，也称Western，Western blot、Western blotting、Western印迹，是检测蛋白的重要方法之一。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
（一）蛋白样品的制备可以选用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。
为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定其蛋白浓度。
在微量离心管中，用2×SDS加样缓冲液按1:1(v/v)稀释待测蛋白质样品，于100℃煮沸5-10min。
以充分变性蛋白。
使用浓缩的蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以加入更多的蛋白样品。
（二）SDS-PAGE电泳1. SDS-PAGE凝胶配制（1）取出玻璃板，用自来水洗净后，蒸馏水冲洗一次，置37 度烘干或晾干（戴手套操作），梳子应用水洗净，临用前用乙醇擦拭，挥发至干。
组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上，确保不漏胶。
（2）按表1配制分离胶液体并脱气，其中AP和TEMED灌胶前再加入，轻轻摇匀，以免产生气泡。
表1 凝胶的制备按所需分离的蛋白质分子大小配制合适浓度的凝胶（表2），将凝胶溶液平稳地注入两层玻板中（以平稳流速从垫片的边缘注入），缓慢持续注入至液面距梳齿2-3厘米处，再在液面上小心注入一层水饱和异丁醇（厚约1cm），以隔绝空气，静置直至凝胶的形成（聚合后，可见在异丁醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线）。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
一、材料准备1M Tris-HCl, pH8.8、10% SDS、Ammonnium persulfate (过硫酸铵)和1M Tris-HCl, pH6.8室温保存。
30% Acr-Bis (29:1)和TEMED 4℃避光保存。
过硫酸铵配制成10%溶液后，分装成小管-20℃保存，通常半年内有效。
1.10%十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
配制方法：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。
2.10%过硫酸铵（Ap）：引发剂。
能产生自由氧基，使丙烯酰胺聚合。
配制方法：0.1 g过硫酸铵溶解于 1ml双蒸水中。
过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。
过硫酸铵配制成10%溶液后，应当-20℃保存。
同时应尽量减少室温存放时间，以防失效。
3.N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED）：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固，其碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。
TEMED易挥发，使用后请盖紧瓶盖。
另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切，可通过适当调节TEMED的用量，控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。
配制方法：原液使用。
应使用电泳级TEMED。
4.30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis贮液） :含有29的丙烯酰胺和1的甲叉基聚丙烯酰胺。
丙烯酰胺单体（Arc）在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺。
N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis），交联剂。
丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。
SDS-PAGE实验步骤
试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml）(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。
可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。
过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。
3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml 使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。
4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml 使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液。
6. 10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）。
7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。
置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
器材电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。
样品制备将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。
放入100℃加热5－10min，离心，取上清点样。
电泳1. 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddHO冲洗数次，再用乙醇擦2拭，晾干；2. 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，装好玻璃板；3. 按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀；O 3.0 ml ddH21.0 mol/LTris-HCl pH=8.82.1 ml30% Acr-Bis 2.8 ml 10% SDS 80 ul10%AP 56 ul TEMED 6 ul4. 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；5. 按如下体积配制6％浓缩胶3.0 ml，混匀；O 2.0 ml ddH21.0 mol/LTris-HCl pH=6.8 400 ul30% Acr-Bis 600 ul 10% SDS 36 ul10%AP 24 ul TEMED 4 ul6. 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；7. 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl;8. 稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr；9. 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr；加入脱色液，置于80 rpm 脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏水）至完全脱净。
不同浓度western胶 分离能力
不同浓度的Western blotting方法是一种常见的生物化学技术，它用于检测特定蛋白质在细胞、组织或生物样本中的表达水平。
Western blotting方法的关键步骤包括蛋白质分离、电泳、转膜和特异性抗体探测。
在这些步骤中，蛋白质分离是至关重要的一步，它直接影响Western blotting的检测灵敏度和特异性。
蛋白质分离通常采用SDS-PAGE凝胶电泳技术，该技术能够将不同大小和电荷的蛋白质分离开来。
在SDS-PAGE凝胶电泳中，使用不同浓度的凝胶可以影响蛋白质分离的能力。
一般来说，低浓度的凝胶可以有效分离大分子量的蛋白质，而高浓度的凝胶则可以有效分离小分子量的蛋白质。
1. 低浓度Western gel的分离能力低浓度的Western gel通常是8-10的聚丙烯酰胺凝胶，它适用于分离分子量较大的蛋白质。
在低浓度Western gel中，孔隙大小较大，电泳时蛋白质能够更快地移动，从而有效地分离出大分子量的蛋白质。
这种凝胶的优势在于其较好的分离能力和较短的电泳时间，同时也可以在较大分子量蛋白质的定量上有更好的表现。
2. 高浓度Western gel的分离能力高浓度的Western gel通常是12-15的聚丙烯酰胺凝胶，它适用于分离分子量较小的蛋白质。
在高浓度Western gel中，孔隙大小较小，能够更好地分离出小分子量的蛋白质。
这种凝胶的优势在于其较好的分离能力和较高的分辨率，能够有效地分离出分子量接近的蛋白质，从而有助于提高Western blotting的检测灵敏度和特异性。
3. 不同浓度Western gel的选择选择合适浓度的Western gel对于蛋白质的分离至关重要。
一般来说，如果要分离大分子量的蛋白质，可以选择低浓度的Western gel；如果要分离小分子量的蛋白质，可以选择高浓度的Western gel。
在实际操作中，还可以根据待检测蛋白质的分子量范围进行优化选择，以求得最佳的分离效果。
SDS-PAGE
不连续SDS。
NGE垂直电泳及考马斯亮蓝染色法[实验目的]1．掌提SDS—PAGE的基本原理。
2．掌握垂直扳状凝胶电泳槽的使用和凝胶配制方法。
3．掌握考马斯克蓝法对SDS聚丙烯配胺凝胶染色的方法。
4．了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用范围。
[实验原理]带电颗粒在电场的作用下，向与其电荷相反的电极方向移动的现象称为电泳(elecbphoKsis)。
电泳的速度与带电颗粒的电荷强弱、分离介质的阻力、电解液的教度和电场强度等因素相关。
生物大分子电泳的速度除上述因素之外，还与分子形状、相对分子质量大小、分子的带电性质和数目等因索有关。
基于各种带电粒子在电场中迁移速度的不同，可将蛋白质、核酸等物质进行分离，此实验技术称为电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酞胺单体和少量交联剂N，N’—甲叉双丙烯酰胺，在催化剂(化学聚合剂过硫酸铵或光聚合剂核黄素)和加速剂(N，N，N’，N，·四甲基乙二胺)的作用下聚合含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交联起来而形成三维网状结构的凝胶。
改变单体Acr浓度或单体与交联剂的比例，就可以得到不同孔径的凝胶。
以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳，可用来分离核酸(<3％)和蛋白质(7％—15％)。
待分离分子通过凝胶孔的能力取决于凝胶孔的大小和形状，也取决于被分离分子的形状、大小以及分子所带的电荷等因素。
蛋白质是两性电解质分子，大多数蛋白质的等电点在5左右，在PH 6.8的聚丙烯酰胺凝胶中带有负电荷，在电场中能向正极迁移。
由于相对分子质量的不同和蛋白质形状以及所带静电荷的多少等因素的差异，不同蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度也有所差异，从而使不同性质的蛋白质得以分离。
PAGE分离蛋白质基于三种物理效应：1．凝胶对蛋白质样品的分子筛效应：聚丙烯配胺凝胶是三维网状结构的凝胶。
分子量大、形状不规则的分子通过凝胶孔洞的阻力大，移动慢；分子量小、球形的分子移动快。
SDS-PAGE凝胶制备试剂盒使用说明书
SDS-PAGE凝胶制备试剂盒使用说明书产品货号：SK6010储存条件：Acr-Bis溶液2-8℃储存，其它常温储存。
有效期2年。
产品组成：Components SK6010-50SK6010-250保存条件30%Acr-Bis(29:1)100ml500ml2-8℃分离胶缓冲液100ml500ml RT浓缩胶缓冲液50ml250ml RTAPS（过硫酸铵）5×0.1g5×0.5g RT TEMED1ml5ml RT/避光说明书1份注意：过硫酸铵（APS）为固体粉末，使用前配制成10%APS溶液（0.1g APS加1ml双蒸水；0.5g APS 加5ml双蒸水）。
APS溶液最好现配现用，通常4℃可保存两周，-20℃能保存半年。
产品简介：本产品包括SDS-PAGE凝胶制备所需全部试剂，只需自备蒸馏水，即可制备各种浓度的变性及非变性PAGE凝胶，方便、快捷、安全、实惠。
本试剂盒在分离胶缓冲液和浓缩胶缓冲液中已加入10%SDS，使用时无需另外加入，分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液放置2-8℃可能出现絮状，为SDS析出，常温下放置一会溶液恢复澄清，可继续使用。
因为制备凝胶浓度不同，本品只给出大概制胶数量。
操作步骤：根据目的蛋白分子量大小选择合适的PAGE分离胶配制浓度，最佳胶浓度请参考附表1。
一、灌制分离胶（各试剂使用量请参考附表3）1．参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
注：加入上层筛板有助于加样时保持填料与样品均匀接触，是否加入上层筛板可根据实际情况选择。
2．将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。
3．加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
4．在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm即可，然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5cm的水层，使凝胶表面保持平整。
实验二_SDSPAGE凝胶电泳
甲醇/冰醋酸固定液 甲醇 冰醋酸固定液
甲醇：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、
球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差(亲和力小 且易自溶)。甲醇固定的特点是杀死快，渗透力强，对 组织收缩较大(可收缩20%左右)，可使材料变硬。 。
冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又
称为冰醋酸。常用0.3～0.5%的浓度作为固定液。冰醋 酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、 氯仿混合。
电荷效应之二
结合的蛋白质的构型也发生变化， 与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化，在 结合的蛋白质的构型也发生变化 水溶液中SDS-蛋白质复合物都具有相似的形状， 蛋白质复合物都具有相似的形状， 水溶液中 蛋白质复合物都具有相似的形状 使得SDS-PAGE电泳的泳动率不再受蛋白质原有 使得 电泳的泳动率不再受蛋白质原有 电荷与形状的影响。因此，各种SDS-蛋白质复 电荷与形状的影响。因此，各种 蛋白质复 合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子 量的不同。 量的不同。
激活作用
基本原理之一
阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间 阴离子去污剂
及与其它物质分子之间的非共价键， 及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质 变性而改变其原有的构象， 变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充 分结合形成带负电荷的蛋白质复合物。 分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 复合物
实 验 二
SDS-PAGE凝胶电泳 凝胶电泳
SDS-PAGE凝胶电泳 凝胶电泳
实验原理 实验步骤 注意事项 SDS-PAGE的优点 的优点 SDS-PAGE的缺点 的缺点 实验常见问题及处理 小技巧
实验原理
源起 基本原理 分类 分离范围
1967年由Shapiro建立。 1969年由Weber和Osborn进一步完善。
蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法一、实验目的1、学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。
2、掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的操作技术。
二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。
SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS-蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。
SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
Acr和bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。
引发自由基的方法有化学法和光化学法两种。
化学法的引发剂是过硫酸铵（Ap），催化剂十四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。
采用不同浓度的acr、bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。
因此可按分离物质的大小、形状来选择凝胶浓度。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
三、实验器材及数据30%分离胶储存液、10%浓缩胶储存液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、电泳缓冲液、样品溶解液、染色液、脱色液；标准蛋白，样品蛋白；电泳槽，移液管1ml，烧杯100ml四、注意事项1、acr和bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴口罩和手套，纯化应在通风处内进行。
SDS
SDS-PAGE影响因素注意事项等SDS-PAGE原理SDS电泳技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。
当在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS后，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，其它因素可以忽略不计。
SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键。
在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。
解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。
椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-SDS复合物基本上是相同的（约18?），但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比，因此这种复合物在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质及其亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。
由此可见，SDS-PAGE不仅可以分离鉴定蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。
SDS-PAGE实验操作试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。
可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。
; C3 Y) Z8 a2 g% C" t4 u/ ^2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。
过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。
/ z2 W6 w- V$ o) \# e3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。
SDS-PAGE配方
.SDS-PAGE1)根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围胶6%50-150kD8%胶30-90kD10%胶20-80kD胶12%12-60kD15%胶10-40kD.'.成分分离胶所需各成分的体积（毫升）配制不同体积SDS-PAGE胶。
即可配制成非变性注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDSPAGE 冰箱放两周，但是最好新鲜配置效果好。
10%过硫酸铵配好后可以在4D ：(也称堆积胶、积层胶或上层胶)按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶1)1L电泳缓冲溶液5XTris-Glycine0.5% W/V SDS ，1.25M Glycine 0.125M Tris，Tris 15.1 gGlycine 95 gSDS 5.0 g.'.5X SDS-PAGE 加样缓冲液：5ml250mM Tris-HCl (pH6.8), 10% SDS, 0.5% BPB, 50% glycerol, 5% 2-ME 1M Tris-HCl (pH6.8): 1.25 mLSDS：0.5 gBPB: 25mgGlycerol: 2.5ml2-ME: 使用时加入小份（25微升），新鲜使用。
TBST 缓冲液每2L体积中含：1M TrisHCL(pH7.5) 100mLNacl 16g0.4g KCL1ml吐温1)抗体去除液50mL抗体去除液中含：每6.25mL pH6.80.5M TrisHCL（）10mL 10%SDS0.175mL Beta-ME33.75mL 水.'.SDS-PAGE电泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
SDS—PAGE凝胶电泳(细致分析)
SDS-PAGE电泳的基础原理和实验步骤1.名称：SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳2.原理：此项技术的原理，是根据样品中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。
不同的蛋白质在不同的pH值下表现出不同的电荷，同时蛋白质具有不同的大小和形状。
为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理。
上样缓冲液由Tris-HCl （pH6.8）、甘油，10％SDS、β-巯基乙醇、0.1％溴酚蓝以及蒸馏水组成。
其各自的作用如下述：SDS 即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。
由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或者单个肽链，因此测定结果只是亚基或者单个肽链的分子量。
同时，SDS与蛋白质结合引起蛋白质的构象改变，形成长椭圆棒状，不同蛋白质短轴长度都一样，长轴随蛋白分子量不同而不同，这样就消除了性状的影响。
另外，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
甘油用以增大样品液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。
样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
样品液和浓缩胶中Tris-HCl均为pH6.8,上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸（pH8.3）,分离胶含Tris-HCl(Ph8.8).电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8 的上层，pH8.8 的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。